翁昌梅,李冠樺,甘惠方,張東冬,張良潮,康建毅

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院武器殺傷生物效應(yīng)評(píng)估研究室/創(chuàng)傷燒傷復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042)

隨著城市化進(jìn)程加速，液化天然氣等可燃?xì)怏w成為居民生活必不可少的能源，近年來(lái)我國(guó)燃?xì)獗ㄊ鹿暑l繁發(fā)生，造成了巨大的生命財(cái)產(chǎn)損失[1-2]?？扇?xì)怏w爆炸對(duì)生物的殺傷效應(yīng)主要表現(xiàn)為爆炸時(shí)產(chǎn)生的高壓沖擊波導(dǎo)致原發(fā)沖擊傷和熱輻射所致的燒傷疊加，形成熱沖復(fù)合傷，尤其是在密閉空間爆炸傷情更為嚴(yán)重。熱沖復(fù)合傷后急性肺損傷進(jìn)程加速，是導(dǎo)致患者早期死亡的主要原因之一[3]，因而研究熱沖復(fù)合傷后急性肺損傷的特點(diǎn)對(duì)可燃?xì)怏w爆炸事故傷員的救治至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于爆炸后熱輻射和沖擊波復(fù)合致動(dòng)物受傷的研究模型均不能真實(shí)地模擬密閉環(huán)境內(nèi)可燃?xì)怏w爆炸所致的熱沖復(fù)合傷[4-6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在密閉巷道內(nèi)引爆可燃?xì)怏w甲烷模擬密閉環(huán)境內(nèi)氣體爆炸致動(dòng)物損傷，對(duì)動(dòng)物血清中肺損傷標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合肺組織病理學(xué)及肺損傷評(píng)估，對(duì)密閉爆炸環(huán)境下熱沖復(fù)合傷致動(dòng)物急性肺損傷的特點(diǎn)進(jìn)行分析研究，以期為進(jìn)一步研究熱沖復(fù)合傷后急性肺損傷機(jī)制及診治提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年波爾山羊9只，雌雄不拘，6～8月齡，體質(zhì)量(30.0±2.5)kg；健康成年新西蘭大白兔8只，雌雄不拘，4～8月齡，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，均由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)20170002]。本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)煤炭科工集團(tuán)重慶研究院有限公司大型地下巷道試驗(yàn)系統(tǒng)開(kāi)展。該巷道直徑3.2 m，高3.4 m，全長(zhǎng)896.0 m，采用200 m3甲烷氣體起爆，分別在距離爆炸點(diǎn)40 m、60 m處各布放實(shí)驗(yàn)羊及實(shí)驗(yàn)兔3只，在距離爆炸點(diǎn)80 m處布放實(shí)驗(yàn)羊3只及實(shí)驗(yàn)兔2只，試驗(yàn)巷道及動(dòng)物布放見(jiàn)圖1、2，山羊?yàn)檎咀?，兔為臥姿，所有動(dòng)物均右側(cè)面向爆炸點(diǎn)，右側(cè)胸部剃毛。本實(shí)驗(yàn)已獲陸軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)審批(AMUWEC20201924)，所有實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按規(guī)定執(zhí)行。

圖1 試驗(yàn)巷道及動(dòng)物布放示意圖

圖2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布放圖

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)、表面活性蛋白A(surfactant protein A,SP-A)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)測(cè)定試劑盒(江蘇蘇酶科)，正置熒光顯微鏡(日本Olympus,BX43)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo,MK3)，冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma,3-16KL)，溫度傳感器(西安玉林,ZLZ-HS-2)，壓力傳感器(美國(guó)PCB，113B21)。HE染色試劑(北京索萊寶)，戊巴比妥鈉(德國(guó)Merk)，組織固定液(武漢博士德)，石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡)，耗材均為國(guó)產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物血液采集及肺損傷標(biāo)志物檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)羊分別在實(shí)驗(yàn)前(0 h)及傷后4 h、24 h、48 h取靜脈血約5 mL，實(shí)驗(yàn)兔分別在實(shí)驗(yàn)前(0 h)及傷后24 h、48 h、72 h取靜脈血約5 mL，室溫靜置2 h后，于4 ℃以3 000 r/min離心15 min，取上清分別檢測(cè)RAGE、SP-A、NE含量，操作步驟按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 肺組織病理學(xué)觀察 傷后48 h，各組動(dòng)物用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后放血處死，然后開(kāi)胸取距離肺損傷部位3～5 cm處小塊肺組織，大小為1.2 mm3，經(jīng)4%多聚甲醛固定72 h后，乙醇脫水，石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)、HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.3.3 動(dòng)物損傷程度的醫(yī)學(xué)評(píng)估 沖擊傷判定方法：參考王正國(guó)[7]院士制定的沖擊傷傷情的病理判定標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)肺部原發(fā)性沖擊傷情況分為無(wú)傷(Ⅰ)、輕度(Ⅱ)、中度(Ⅲ)、重度(Ⅳ)、極重度(Ⅴ)五個(gè)等級(jí)，對(duì)動(dòng)物的損傷程度以及肺損傷情況進(jìn)行評(píng)估。燒傷判定方法：根據(jù)10 s積分?jǐn)?shù)值來(lái)評(píng)估燒傷嚴(yán)重程度。燒傷分度見(jiàn)表1。復(fù)合損傷判定方法：參照簡(jiǎn)明損傷定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(2005版)，通過(guò)新的損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(new injury severity score,NISS)[8-9]對(duì)動(dòng)物復(fù)合損傷進(jìn)行評(píng)估，其中1～9分為輕度損傷，10～15分為中度損傷，16～24分為重度損傷，25分及以上為極重度損傷。所有評(píng)分均由2名評(píng)估人員獨(dú)立完成，結(jié)果由創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)專家進(jìn)行最終審核。

表1 燒傷分度表

1.3.4 物理參數(shù)檢測(cè) 各動(dòng)物布放點(diǎn)放置溫度傳感器、壓力傳感器以測(cè)定該點(diǎn)溫度、壓力值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 物理參數(shù)測(cè)試結(jié)果

2.1.1 沖擊波超壓測(cè)試結(jié)果 爆炸后，沖擊波壓力呈現(xiàn)不同的衰減規(guī)律(圖3、表2)。沖擊波正壓持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，為0.107～0.150 s;上升時(shí)間為0.078～0.084 s;超壓峰值為112～163 kPa，在距離起爆點(diǎn)60 m后達(dá)到高峰值163 kPa。

圖3 不同距離沖擊波壓力波形變化

表2 沖擊波物理參數(shù)測(cè)定表

2.1.2 溫度測(cè)定結(jié)果 爆炸后高溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，最長(zhǎng)達(dá)16.6 s；10 s積分值為766～1 941 ℃·s;溫度隨著距離的增加而降低，范圍為134.4～262.7 ℃，溫度上升較快，下降比較平緩，見(jiàn)圖4、表3。

圖4 不同距離溫度測(cè)試波形變化

表3 溫度物理參數(shù)測(cè)定表

2.2 動(dòng)物大體損傷及肺損傷評(píng)估

2.2.1 動(dòng)物復(fù)合損傷評(píng)估 爆炸后，各動(dòng)物受到?jīng)_擊波及熱輻射的疊加作用，傷亡情況如下：60 m處 2只羊(4#、8#)即刻死亡，80 m處1只羊(7#)即刻死亡，其余動(dòng)物均受到不同程度的損傷。實(shí)驗(yàn)羊復(fù)合損傷NISS為24～57分，為重度至極重度損傷；實(shí)驗(yàn)兔復(fù)合損傷程度為輕度到極重度，NISS為6～30分，具體損傷評(píng)估結(jié)果見(jiàn)表4、5。

單因素方差分析顯示，40 m、60 m、80 m之間實(shí)驗(yàn)羊NISSP值分別為：P(40 m∶60 m)=0.260,P(40 m∶80 m)=0.072,P(60 m∶80 m)=0.386，表明不同距離處羊損傷程度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。實(shí)驗(yàn)兔不同距離NISSP值分別為：P(40 m∶60 m)=0.037,P(40 m∶80 m)=0.791,P(60 m∶80 m)=0.791，僅40 m與 60 m處兔NISS比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 動(dòng)物肺損傷情況 爆炸后，各動(dòng)物大體解剖肺損傷評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表4、5。結(jié)果顯示羊肺沖擊傷程度為輕度到重度，中度肺損傷及重度肺損傷均占 22.2%，其中以5#羊及7#羊肺沖擊傷最為嚴(yán)重；而兔肺沖擊傷中極重度、重度、中度損傷均占12.5%，其中以R06#兔及R07#兔肺沖擊傷最為嚴(yán)重。其余動(dòng)物均為輕度肺損傷。疊加沖擊波和熱輻射，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物復(fù)合肺沖擊傷和燒傷程度不一。5#羊肺出血嚴(yán)重，左肺上、中、下葉均有出血，且有肺大泡，右肺有條狀性出血及彌漫性出血；R07#兔全肺均有散在的出血點(diǎn)，且肺組織有實(shí)變，見(jiàn)圖5。

表4 羊損傷評(píng)估結(jié)果

表5 兔損傷評(píng)估結(jié)果

注：左圖和右圖分別為肺背側(cè)面和腹側(cè)面

2.3 血清肺損傷標(biāo)志物檢測(cè)

2.3.1 羊血清肺損傷標(biāo)志物變化 與傷前(0 h)相比，爆炸后羊血清RAGE、SP-A及NE濃度均隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，在傷后24 h劇增，傷后48 h趨于穩(wěn)定。傷后24 h、48 h血清RAGE、SP-A及NE濃度與傷前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

a：血清RAGE濃度；b：血清SP-A濃度；c：血清NE濃度 *：P<0.05；**：P<0.01

2.3.2 兔血清肺損傷標(biāo)志物變化 兔血清RAGE濃度隨時(shí)間逐漸上升，傷后48 h、72 h均顯著高于傷前(P<0.05)；兔血清SP-A濃度在傷后24 h達(dá)到最高值，顯著高于傷前(P<0.01)，此后恢復(fù)至傷前水平；兔血清NE濃度隨時(shí)間逐漸上升，在傷后48 h、72 h顯著高于傷前(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

a：血清RAGE濃度；b：血清SP-A濃度；c：血清NE濃度 *：P<0.05；**：P<0.01

2.4 肺組織病理學(xué)變化

羊肺組織病理學(xué)結(jié)果顯示(圖8)，2#羊部分肺泡腔萎陷，肺間質(zhì)水腫、增厚，肺泡間隔斷裂，肺間質(zhì)及部分肺泡腔有滲出液、大量紅細(xì)胞漏出，肺出血嚴(yán)重。5#羊肺泡結(jié)構(gòu)明顯，肺間質(zhì)明顯水腫、增厚，肺泡腔及肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞、散在紅細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)為彌漫性出血。1#羊部分肺間隔斷裂、肺泡腔融合，肺間質(zhì)有散在炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞聚集，出血、水腫程度較2#、5#羊輕。

a：2#羊肺；b：5#羊肺；c：1#羊肺

兔肺組織病理學(xué)結(jié)果顯示(圖9)，R05#兔肺泡結(jié)構(gòu)明顯，肺間質(zhì)顯著增厚、水腫，充盈了大量炎性細(xì)胞及散在的紅細(xì)胞，表現(xiàn)為肺水腫伴彌漫性出血。R07#兔部分肺泡腔萎陷，肺泡腔有大量的紅細(xì)胞漏出，肺泡間隔略微增厚，肺出血較為嚴(yán)重。R02#兔大量肺泡間隔斷裂，肺泡腔融合，肺泡腔有少許紅細(xì)胞充盈，肺泡間隔有少量紅細(xì)胞聚集。

a：R05#兔肺；b：R07#兔肺；c：R02#兔肺

3 討論

熱沖復(fù)合傷的傷情較單一的沖擊傷或燒傷更為復(fù)雜，肺部是受熱沖復(fù)合傷最嚴(yán)重的器官，熱沖復(fù)合傷后急性肺損傷進(jìn)展迅速，從而增加了熱沖復(fù)合傷的早期病死率[10-11]。因此，模擬密閉環(huán)境內(nèi)可燃?xì)怏w爆炸致熱沖復(fù)合傷的機(jī)理研究及其救治具有重要意義。本研究通過(guò)氣體爆炸對(duì)不同距離的動(dòng)物進(jìn)行致傷以了解巷道內(nèi)動(dòng)物熱沖復(fù)合傷及急性肺損傷的特點(diǎn)，結(jié)果顯示不同距離處羊損傷程度無(wú)顯著差異，因此動(dòng)物生化指標(biāo)檢測(cè)不考慮布放距離的影響。根據(jù)沖擊傷判定標(biāo)準(zhǔn)以及文獻(xiàn)報(bào)道，肺損傷程度和沖擊波超壓峰值與正壓持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)，通常短時(shí)間(<0.01 s)脈沖的沖擊波超壓峰值為200 kPa左右即能引起輕度肺損傷,而長(zhǎng)時(shí)間(>0.1 s)脈沖只需100 kPa的超壓峰值即可導(dǎo)致嚴(yán)重肺損傷[12-13]；參考以往評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，如果10 s積分值超過(guò)1 315 ℃·s ，則人裸露皮膚可達(dá)Ⅱ度燒傷[14]。本實(shí)驗(yàn)物理參數(shù)測(cè)試結(jié)果顯示，距離爆炸源40～80 m的沖擊波超壓峰值為112～163 kPa，持續(xù)時(shí)間為0.107～0.150 s；溫度為134.4～262.7 ℃，持續(xù)時(shí)間為9.8～16.6 s，40 m處10 s積分值為1 941 ℃·s。由于本實(shí)驗(yàn)在密閉環(huán)境中進(jìn)行，沖擊波和熱輻射疊加，故相同標(biāo)準(zhǔn)下動(dòng)物實(shí)際的損傷可能會(huì)更嚴(yán)重。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)物理參數(shù)測(cè)試及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷評(píng)估結(jié)果，40～80 m處實(shí)驗(yàn)羊中、重度肺損傷比例為44.4%，實(shí)驗(yàn)兔中度及以上(中度、重度、極重度)肺損傷比例為37.5%，肺損傷較為嚴(yán)重。

血清中RAGE、SP-A、NE為創(chuàng)傷性急性肺損傷的標(biāo)志物，其濃度能在一定程度上反映創(chuàng)傷性急性肺損傷的嚴(yán)重程度[10,15-16]。RAGE是一種損傷相關(guān)的分子模式受體，定位于Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞基底膜，被視為肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞損傷或肺損傷的標(biāo)志物[17-18]。SP-A是肺泡表面活性物質(zhì)的特異性蛋白之一，其在動(dòng)物血清中的濃度可反映肺泡細(xì)胞的屏障功能[19-20]，動(dòng)物血清中SP-A含量可能與肺纖維化嚴(yán)重程度有關(guān)[21-22]。NE是由中性粒細(xì)胞釋放的一種絲氨酸蛋白酶[23]，在嚴(yán)重的炎癥條件下，NE濃度過(guò)度升高，從而破壞內(nèi)皮屏障并滲透到支氣管肺泡腔，引起肺泡細(xì)胞損傷，加重肺損傷[16,24-25]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了氣體爆炸所致熱沖復(fù)合傷后羊和兔血清RAGE、SP-A及NE濃度的變化情況，結(jié)果顯示，傷后羊和兔血清RAGE、SP-A及NE濃度均呈上升趨勢(shì)，且傷后24 h和/或48 h顯著高于傷前，表明氣體爆炸所致熱沖復(fù)合傷后羊及兔均有不同程度急性肺損傷，與文獻(xiàn)[10,15-16]報(bào)道一致。

本研究肺組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺損傷主要表現(xiàn)為肺出血、肺水腫、肺泡間隔斷裂、肺泡腔萎陷等。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[26]，出現(xiàn)以上結(jié)果可能與熱沖復(fù)合傷后肺發(fā)生以下病理生理變化有關(guān)：首先，沖擊波導(dǎo)致肺泡細(xì)胞及肺毛細(xì)血管損傷，引起肺出血、肺水腫；其次，體表燒傷會(huì)引起體內(nèi)免疫反應(yīng)、遠(yuǎn)端肺損傷，激發(fā)炎癥；同時(shí)，肺水腫本身也能引起肺部炎癥反應(yīng)，多重炎癥疊加，導(dǎo)致炎性細(xì)胞及炎癥因子聚集，肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，通透性改變，炎性物質(zhì)、蛋白復(fù)合物漏出，肺功能受損，肺組織缺氧、充血、水腫進(jìn)一步加重。結(jié)合本研究損傷評(píng)分及肺組織病理結(jié)果，在熱沖復(fù)合傷致肺損傷后，血清中RAGE、SP-A及NE濃度顯著升高，提示RAGE、SP-A及NE在熱沖復(fù)合傷的早期肺損傷中具有重要意義，對(duì)熱沖復(fù)合傷后急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制、機(jī)理研究以及診治具有一定的參考作用。

綜上，結(jié)合肺損傷標(biāo)志物濃度變化、肺組織病理學(xué)觀察及肺損傷評(píng)估分析，本實(shí)驗(yàn)提示在密閉巷道內(nèi)引爆甲烷后動(dòng)物肺損傷發(fā)生率較高，且主要為中重度肺損傷，主要表現(xiàn)為肺出血、肺水腫、肺泡間隔斷裂等，在熱沖復(fù)合傷所致的早期急性肺損傷中，動(dòng)物血清中RAGE、SP-A及NE濃度均顯著升高，表明血清RAGE、SP-A及NE能在一定程度上反映急性肺損傷的嚴(yán)重程度，可為密閉巷道內(nèi)可燃?xì)怏w爆炸所致熱沖復(fù)合傷后急性肺損傷的特點(diǎn)研究及診治提供參考依據(jù)。