廖 茜，陳 煒，于雪梅，卿 清

(四川綿陽四○四醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 綿陽 621000)

卵巢癌是特發(fā)于女性卵巢的惡性腫瘤，在50歲以上女性中尤為常見，約占女性癌癥的3.4%，主要(約占90%)以上皮型為主[1-2]。卵巢癌患者早期缺乏特異性癥狀，確診時多處于中晚期，其病死率位列乳腺癌和宮頸癌之后，是第三大致命的婦科惡性腫瘤[1-2]。卵巢癌治療以手術治療和化療為主，臨床常用的化療藥物為紫杉類藥物(如紫杉醇、多西他賽)，但化療藥物常有骨髓抑制、過敏反應、神經(jīng)毒性和水鈉潴留等副作用，且易產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果[1,3]。

S100A5是一種鈣結合蛋白，屬于E-F手型鈣結合蛋白S100家族成員[4]。目前對S100A5的生物學作用了解相對較少，有研究表明S100A5對蛋白質與Ca2+和Cu2+的結合具有拮抗作用，且與炎癥和嗅覺信號有關[5-6]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌患者中S100A5表達量越高，其總生存期越長[7-9]，提示其可能是卵巢癌的抑制因子。本研究利用外源性S100A5蛋白處理卵巢癌細胞SKOV3，分析其對卵巢癌細胞SKOV3增殖、遷移和侵襲的影響，以進一步明確S100A5對卵巢癌的具體作用及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細胞株SKOV3購自上海蓋寧生物科技有限公司，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。人源重組S100A5蛋白凍干粉購自北京義翹神州科技股份有限公司，滅菌PBS復融為終濃度1 mmol/L的儲存液，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩CK-8試劑購自美國Bimake生物科技有限公司；Transwell小室和基質膠(Matrigel)購自美國BD公司；結晶紫染液購自北京百泰克生物技術有限公司；所有一抗、內(nèi)參β-actin抗體和HRP標記二抗均購自美國Affinity Biosciences公司。

1.2 CCK-8實驗

在96孔板中按照每孔1 000個的數(shù)量接種人卵巢癌細胞SKOV3，并使用不同濃度的S100A5蛋白(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)處理細胞，每組5個重復孔。分別在24 h、48 h和72 h后徹底吸除孔內(nèi)培養(yǎng)基，CCK-8原液按1∶9的比例稀釋為工作液，每孔加入0.1 mL CCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，讀取450 nm波長下的OD值。

1.3 克隆形成實驗

在6孔板中按照每孔800個的數(shù)量接種人卵巢癌細胞SKOV3，使用不同濃度的S100A5蛋白(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)處理7 d后，每孔加入0.1 mL結晶紫染液染色20 min，掃描成像后采用Image J軟件計數(shù)克隆形成數(shù)目。

1.4 劃痕愈合實驗

在6孔板中按照每孔3×105個的數(shù)量接種人卵巢癌細胞SKOV3，待細胞融合度達到90%時，用10 μL無菌槍頭沿孔板直徑劃線制造劃痕，使用不同濃度的S100A5蛋白(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)處理0 h和16 h后，于相同位置對劃痕進行成像，采用Image J軟件測量劃痕寬度，劃痕愈合率=(0 h寬度-16 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.5 Transwell小室(含基質膠)實驗

使用RPMI 1640培養(yǎng)基將基質膠原液按1∶5的比例稀釋為工作液，60 μL基質膠工作液均勻包被上室，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中使其完全凝固。將含有不同濃度S100A5蛋白(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)的完全RPMI 1640培養(yǎng)基添加到下室，將400 μL含有2.5×104個細胞的RPMI 1640培養(yǎng)基添加到上室。24 h后進行結晶紫染色，顯微鏡下成像，采用Image J軟件計數(shù)侵襲細胞數(shù)量。

1.6 Western blot

將人卵巢癌細胞SKOV3以1×106個/瓶的濃度接種于T-25培養(yǎng)瓶中，使用不同濃度的S100A5蛋白(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)處理36 h后，裂解細胞提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離并轉移至PVDF膜，TBST(5%脫脂奶粉、4 g NaCl、1.214 g Tris-HCl和0.2% Tween-20)封閉2 h，分別用Ki67、PCNA、MMP2、MMP7、MMP9、E-cadherin、N-cadherin、Snail和Vimentin一抗37 ℃孵育過夜，HPR標記二抗37 ℃孵育1 h，ECL顯影、成像和分析。Quantity One軟件進行灰度值定量，計算蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 外源性S100A5蛋白抑制人卵巢癌細胞SKOV3增殖

CCK-8實驗檢測結果顯示，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白對人卵巢癌細胞SKOV3增殖具有明顯抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度依耐性(圖1a)。Western blot分析顯示，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白可降低增殖標志物Ki67和PCNA蛋白的表達水平(圖1b)?？寺⌒纬蓪嶒灠l(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L組相比，給予不同濃度外源性S100A5蛋白處理后，SKOV3細胞克隆形成數(shù)目減少(P<0.01)，見圖2。以上結果表明外源性S100A5蛋白可抑制人卵巢癌細胞SKOV3的增殖。

a：外源性S100A5蛋白對SKOV3細胞增殖的影響(CCK-8)；b：外源性S100A5蛋白對SKOV3細胞增殖的影響(Western blot) *：與 0 μmol/L相比，P<0.05；**：與0 μmol/L相比，P<0.01

**：與0 μmol/L組相比，P<0.01

2.2 外源性S100A5蛋白抑制人卵巢癌細胞SKOV3遷移和侵襲

劃痕愈合實驗結果顯示，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白處理組SKOV3細胞劃痕愈合率下降，遷移能力明顯受抑制(圖3a)。Transwell小室實驗結果顯示，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白處理組穿過基質膠(Matrigel)包被小室的侵襲性SKOV3細胞數(shù)量減少(P<0.01)，見圖3b。以上結果表明外源性S100A5蛋白可抑制SKOV3細胞的遷移和侵襲。

a：外源性S100A5蛋白對SKOV3細胞遷移的影響(劃痕愈合實驗，×40)；b：外源性S100A5蛋白對SKOV3細胞侵襲的影響(Transwell小室實驗，×100) *：與0 μmol/L組相比，P<0.05；**：與0 μmol/L組相比，P<0.01

2.3 外源性S100A5抑制人卵巢癌細胞SKOV3中MMP2、MMP7和MMP9蛋白表達水平

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白可抑制MMPs家族成員MMP2、MMP7和MMP9蛋白表達水平，見圖4。

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05；**：與0 μmol/L組相比，P<0.01

2.4 外源性S100A5蛋白抑制人卵巢癌細胞SKOV3的上皮間質轉化進程

Western blot結果顯示，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白處理組中Vimentin、Snail、N-cadherin蛋白表達水平下調(diào)，而E-cadherin蛋白表達水平上調(diào)。表明外源性S100A5蛋白可能通過抑制MMPs和上皮間質轉化進程進而抑制人卵巢癌細胞SKOV3的遷移和侵襲，見圖5。

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05；**：與0 μmol/L組相比，P<0.01

3 討論

S100蛋白家族是一類小分子鈣結合蛋白，人S100蛋白家族包括至少21個成員[4]。幾乎所有S100蛋白家族成員都與腫瘤密切相關，但各成員在不同類型腫瘤中的具體作用并不盡相同，如S100A2是口腔癌的抑制因子，但卻是肺癌的促進因子[10]，S100A7抑制雌激素受體-α陽性乳腺癌進程，但促進雌激素受體-α陰性乳腺癌進程[11]。S100A5在腫瘤中的具體作用報道較少，有研究發(fā)現(xiàn)，高表達S100A5的腦膜瘤患者更不易復發(fā)或者復發(fā)時間延后[12]。另有研究顯示，在卵巢癌中高表達S100A5的患者具有更為良好的預后，提示S100A5極可能是卵巢癌的抑制因子[7]。因此，本研究利用外源性S100A5蛋白處理人卵巢癌細胞SKOV3，結果顯示S100A5蛋白可抑制SKOV3的增殖、遷移和侵襲。

核Ki67蛋白主要位于細胞核，在有絲分裂時被募集到濃縮染色體，通常僅在增殖細胞中表達，Ki67可獨立預測癌癥進展[13]。PCNA是一種重要的蛋白，參與DNA復制和修復、姐妹染色單體粘連和能量代謝，并與細胞存活密切相關[14]。Ki67和PCNA均是良好的細胞增殖標志物，也可作為腫瘤治療的靶點[13-14]。本研究結果顯示，S100A5蛋白可抑制Ki67和PCNA蛋白的表達，CCK-8實驗和克隆形成實驗亦表明外源性S100A5蛋白可抑制人卵巢癌細胞SKOV3的增殖。

MMPs是一類Zn2+依耐性的內(nèi)肽酶，可降解細胞外基質的各種蛋白成分，是癌癥侵襲和轉移中關鍵的調(diào)節(jié)分子[8]。上皮間質轉化是腫瘤細胞從非運動性上皮表型向遷移性間充質表型轉化的過程，其共同特征是上皮E-cadherin表達下調(diào)或缺失，伴隨N-cadherin表達上調(diào)，增加了腫瘤的遠端轉移能力，上皮間質轉化可賦予腫瘤轉移能力，預示著預后不良[9,15]。Snail作為上皮間質轉化中E-cadherin表達的關鍵轉錄抑制因子，可使腫瘤保持高度的遷移侵襲能力，并促進耐藥性、腫瘤復發(fā)和轉移[16]。Vimentin作為上皮間質轉化的標志物，在大多數(shù)腫瘤細胞中高表達，在腫瘤轉移中起關鍵作用[17]。本研究結果顯示，S100A5顯著抑制MMP2、MMP7和MMP9蛋白的表達水平，有效降低了N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表達水平，同時提高了E-cadherin蛋白的表達水平。因此，我們推測外源性S100A5蛋白可能通過抑制MMPs和逆轉上皮間質轉化過程，從而降低人卵巢癌細胞SKOV3的遷移和侵襲。

綜上，外源性S100A5蛋白極可能是卵巢癌的抑制因子，可抑制人卵巢癌細胞SKOV3的增殖、遷移及侵襲。因此，外源性S100A5蛋白可作為一種潛在的治療卵巢癌的方法。