杜彥挺，杜光勇，夏志強，張 偉，趙振偉

(榆林市第二醫(yī)院神經(jīng)外科二病區(qū)，陜西 榆林 719000)

急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是致心血管疾病患者殘疾和死亡的主要原因，動脈粥樣硬化是其病理基礎[1-2]。動脈粥樣硬化是一種涉及大中型動脈的慢性全身性炎癥性疾病，發(fā)病機制與免疫細胞激活、膽固醇積累及年齡增長等因素密切相關[3]。動脈粥樣硬化斑塊的特征是具有一個壞死核心，其上覆蓋薄的纖維帽[4]。早期動脈粥樣硬化起始于吞噬了脂質的巨噬細胞形成泡沫細胞并經(jīng)歷自噬，但在中晚期動脈粥樣硬化中，這種泡沫細胞的自噬功能失調(diào)，凋亡細胞也不能通過正常自噬過程有效降解，從而導致炎癥和斑塊壞死核心的形成[5]。

動脈粥樣硬化的高危因素包括動脈高血壓、吸煙、糖尿病和肥胖，這些因素均會增強血管收縮，增加組織內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)的水平[6]。ET-1是內(nèi)皮素肽家族的主要成員，是一種內(nèi)皮細胞衍生的血管收縮肽。目前認為ET-1是一種多功能肽，具有細胞因子樣活性，參與幾乎所有的生理過程[7]。限制內(nèi)皮細胞過表達ET-1將導致內(nèi)皮損傷，促進動脈粥樣硬化進展并顯著加重病變程度[8]。而使用ET-1 A型受體拮抗劑達魯生坦治療7個月，可改善內(nèi)皮依賴性血管舒張并減緩實驗性動脈粥樣硬化的進展[9]。因此，使用ET-1受體拮抗劑(包括ET-1 A型受體和B型受體的拮抗劑)治療動脈粥樣硬化已發(fā)展為一種新興療法[7]，但其作用的具體分子機制還有待深入研究。

一項抗炎性血栓形成的臨床研究結果表明，抗IL-1β抗體可以減少二級預防中的復發(fā)性心血管事件，從中和IL-1β到抑制IL-6分泌的途徑是一個值得深入研究和臨床開發(fā)的治療靶標[10]。Caspase-1是IL-1β的轉化酶，也是NLRP3炎癥小體的組成成分之一[11]。許多與動脈粥樣硬化相關的刺激物(如膽固醇結晶和缺氧)均可激活NLRP3炎癥小體[12]。NLRP3炎癥小體激活后Caspase-1酶活性增強，將促炎細胞因子IL-1β從無活性的前體加工為成熟的活性形式，并分泌至胞外，從而觸發(fā)炎癥反應。有報道顯示ET-1 B型受體拮抗劑BQ-123能夠顯著改善因腦血管痙攣導致的蛛網(wǎng)膜下腔出血后模型動物腦部微循環(huán)灌注，降低血管炎癥反應[13]。因此，我們猜測ET-1受體拮抗劑也有可能通過抑制血管內(nèi)皮細胞NLRP3/IL-1β炎癥小體的活性發(fā)揮藥效?，F(xiàn)本研究擬使用ET-1 B型受體拮抗劑BQ-788治療ApoE-/-小鼠晚期動脈粥樣硬化，研究其對血管內(nèi)皮細胞NLRP3/IL-1β炎癥小體活性的影響，深入探討ET-1 B型受體拮抗劑的藥物作用機理，為其在臨床的大規(guī)模應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

24只6～7周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠，體質量(20.0±3.5)g，遺傳背景為C57BL/6小鼠，實驗動物購自西安交通大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(陜)2003-0007?；A飼料和高脂飼料均購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。BQ-788(批號B00797882)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA；批號A00130384)、疊氮化鈉(批號S00003536)、蛋白酶抑制劑混合物粉末(批號P00753839)、磷酸酶抑制劑混合物(批號P00765737)購自Sigma-Aldrich公司(美國)。ECL化學發(fā)光底物(批號W00429053)購自Merck-Millipore公司(美國)。兔單抗Caspase-1 p20(批號P091799)、兔單抗Caspase-1 p45(批號P272322)、兔單抗NLRP3(批號P150107)、兔單抗IL-1β(批號P137040)、山羊抗兔IgG(H+L)HRP二抗(批號S354028)購自CST公司(美國)。RIPA裂解液(批號17-10-2900)購自Thermo Fisher公司(美國)。油紅O染色液、HE染色液套裝、Masson染色液套裝購自北京國藥集團。IL-1β(批號04-0634)、IL-6(批號04-2639)和TNF-α(批號04-7441)的ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。酶標儀(美國BioTek，型號Synergy LX)、流式細胞儀(美國Thermo Fisher，型號Attune NxT)，光學顯微鏡(日本Nikon，型號Ni-E)。

1.2 晚期動脈粥樣硬化小鼠模型構建

24只6～7周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠飼養(yǎng)于恒溫(22～25 ℃)、恒濕(相對濕度60%)、12 h/12 h明暗周期的SPF級鼠房，自由進食、飲水。將小鼠隨機分為飼喂常規(guī)嚙齒類動物基礎飼料的正常飲食(CHOW)組、飼喂高脂飲食(high-fat diet，HFD)飼料的HFD組和飼喂HFD飼料并給予BQ-788治療的HFD+BQ-788組，每組8只。每4只小鼠一籠，不同分組的小鼠分別飼養(yǎng)于不同鼠籠。HFD飼料含有21%的脂肪、0.25%的膽固醇、78.75%的基礎飼料。小鼠適應性飼養(yǎng)至第8周齡第1天開始造模：①CHOW組小鼠從第8周齡第1天開始喂食基礎飼料，并于同一天開始每隔24 h腹腔注射一次0.5 mL無菌生理鹽水；②HFD組小鼠從第8周齡第1天開始連續(xù)喂食16周HFD飼料，構建晚期動脈粥樣硬化小鼠模型，并于同一天開始每隔24 h腹腔注射一次0.5 mL無菌生理鹽水；③HFD+BQ-788組小鼠從第8周齡第1天開始，在連續(xù)喂食16周HFD飼料的同時，于同一天開始每隔24 h腹腔注射一次BQ-788，每次3 nmol。所有鼠籠、小鼠器具和飲用水均經(jīng)高壓滅菌處理，基礎飼料和HFD飼料均經(jīng)60Coγ照射滅菌處理。

1.3 流式細胞術檢測

在造模開始后第16周的第7天，從3組小鼠眼眶取血并加入枸櫞酸鈉，溫和混勻數(shù)次。然后將抗CD16/32抗體加入抗凝全血中，室溫避光孵育10 min，以阻斷Fc-受體。接著進行如下處理：①加抗小鼠IgG-FITC和抗小鼠CD115-APC；然后加抗小鼠CD115-APC和抗小鼠Ly6C-percpcy5.5，溫和混勻，室溫避光孵育20 min；②加入含1.5%甲醛的OptiLyse溶血劑，溫和混勻，室溫避光放置10 min；③加入FACS緩沖液(含0.1%BSA、0.01%疊氮化鈉的PBS，pH 7.4)，混勻，300×g離心5 min，棄上清，再加入適量FACS緩沖液重懸細胞沉淀，然后立即上機流式細胞儀檢測。以CD115-APC標記單核細胞，以Ly6C陽性標記單核細胞的炎癥狀態(tài)。

1.4 ELISA檢測

從3組小鼠眼眶取血，然后使用IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA檢測試劑盒，按照試劑盒說明書進行ELISA測定。使用酶標儀在450 nm處檢測吸光值。

1.5 小鼠胸主動脈的采集

采用CO2對小鼠實施安樂死。然后將小鼠腹部向上，固定小鼠前后肢，用手術剪從小鼠腹底部到胸頂部剪開皮膚，打開雙側胸腔，直至暴露胸腺和肺，然后移除食管和肺以暴露心臟，使用冰預冷的PBS對心臟進行灌注。用鑷子夾住與胸主動脈末端相連的橫膈膜，切開主動脈與胸腔肌壁之間的結締組織，露出主動脈弓，切斷左右頸動脈和左鎖骨下動脈，以便分離心臟和主動脈。分離胸主動脈后將其置于解剖盤中，滴加PBS始終保持胸主動脈濕潤，然后用小鑷子小心地拉出外膜脂肪并丟棄，注意避免過度操作破壞胸主動脈血管組織。切斷并丟棄胸主動脈的分支血管，將胸主動脈血管浸沒于新鮮制備的10%中性福爾馬林溶液中，于4 ℃固定48 h。

1.6 Western blot檢測

向小鼠胸主動脈血管組織中加入含有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解液，然后在液氮中研磨組織，制備組織勻漿。使用BCA蛋白定量試劑盒定量總蛋白濃度。每個樣本取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件為150 mA恒流跑積層膠，100 mA恒流跑分離膠。然后于4 ℃以80 mA恒流將PAGE膠中的蛋白通過半干轉印法轉印至PVDF膜上。使用含10%脫脂奶粉的TBS-T緩沖液于室溫封閉PVDF膜1 h。于4 ℃孵育一抗過夜，抗體工作濃度如下：Caspase-1 p20(1∶500稀釋)，Caspase-1 p45(1∶1 000稀釋)，NLRP3(1∶500稀釋)，IL-1β(1∶1 000稀釋)。次日加入山羊抗兔IgG(H+L)HRP二抗(1∶3 000稀釋)，于37 ℃孵育1 h。然后用TBS-T緩沖液洗膜；滴加ECL發(fā)光底物進行目的條帶的化學發(fā)光。

1.7 油紅O染色

將固定好的小鼠胸主動脈放入1.5 mL的EP管中，每管1個胸主動脈。向每管中加入1 mL新鮮配制的78%甲醇溶液，室溫孵育5 min，更換新鮮甲醇溶液，重復1次。棄甲醇溶液，加入1 mL新鮮的油紅O染色液，于室溫孵育60 min。棄油紅O染色液，加入1 mL 78%甲醇溶液清洗，室溫孵育5 min，棄甲醇溶液，重復1次。隨后可加入1 mL PBS，將裝有胸主動脈的EP管置于4 ℃冰箱中等待觀察；也可直接對動脈粥樣硬化斑塊進行觀察。將胸主動脈置于解剖盤中，用手術剪從主動脈的升弓到左鎖骨下動脈切開主動脈弓的外曲率，并縱向剖開胸主動脈；使用鋼制小針將縱向剖開的胸主動脈固定，并觀察、拍照，使用Image J v1.8.0進行動脈粥樣硬化斑塊面積的計算。動脈粥樣硬化斑塊面積占比(%)=動脈粥樣硬化斑塊面積/胸主動脈總面積×100%。

1.8 HE染色和Masson染色

將新鮮采集的小鼠胸主動脈血管浸沒于新鮮制備的10%中性福爾馬林溶液中，于4 ℃固定48 h，然后進行石蠟包埋并切片(5 μm)。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，重復1次；再經(jīng)梯度乙醇水化。HE染色：先使用蘇木精染色液對細胞核染色5 min，使用1%鹽酸乙醇分化3 s，再對切片進行復藍3 s；然后用85%和95%乙醇脫水，每次4 min；接著對切片進行伊紅染色5 min；使用無水乙醇脫水5 min，重復2次；二甲苯透明化 2 min，重復1次；最后，使用中性樹膠封片。Masson染色：使用Masson染色液套裝進行染色，操作步驟按照套裝中的說明書進行，中性樹膠封片。在Nikon光學顯微鏡(型號Ni-E)下觀察并拍照。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 BQ-788能夠抑制血管內(nèi)皮細胞NLRP3/IL1β炎癥小體通路的活化

ELISA測定小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，結果顯示，與CHOW組小鼠相比，HFD組小鼠上述3種炎癥因子的水平均顯著上升(P<0.01)；與HFD組小鼠相比，HFD+BQ-788組小鼠上述3種炎癥因子的水平均明顯回落(P<0.05)，見圖1a。采用Western blot測定小鼠血管內(nèi)皮細胞中炎癥小體的活化水平，結果顯示，與CHOW組小鼠相比，HFD組小鼠Caspase-1 p20(Caspase-1的活性形式)、NLRP3和IL-1β蛋白的表達水平顯著上調(diào)(P<0.01)；與HFD組小鼠相比，HFD+BQ-788組小鼠上述3種蛋白的表達水平顯著下調(diào)(P<0.01)；Caspase-1 p45(Caspase-1的無活性形式)在CHOW組、HFD組和HFD+BQ-788組小鼠血管內(nèi)皮中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1b、c。

a：ELISA測定小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平；b、c：Western blot測定小鼠血管內(nèi)皮細胞中Caspase-1 p20、Caspase-1 p45、NLRP3和IL-1β蛋白的表達水平 *：與CHOW組比較，P<0.05；**：與CHOW組比較，P<0.01；#：與HFD組比較，P<0.05；##：與HFD組比較，P<0.01

2.2 BQ-788能夠減少促炎單核細胞數(shù)量

與CHOW組相比，HFD組小鼠全血中的單核細胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)；與HFD組小鼠相比，HFD+BQ-788組小鼠全血中的單核細胞數(shù)量顯著減少(P<0.01)，見圖2a。與CHOW組相比，HFD組小鼠全血中的促炎單核細胞Ly6Chigh數(shù)量顯著增加(P<0.01)，抗炎單核細胞Ly6Clow數(shù)量顯著減少(P<0.01)；與HFD組小鼠相比，HFD+BQ-788組小鼠全血中的Ly6Chigh數(shù)量顯著回落(P<0.01)，Ly6Clow數(shù)量顯著增加(P<0.01)，見圖2b。

a：小鼠全血中單核細胞計數(shù)結果；b：小鼠全血中促炎和抗炎單核細胞計數(shù)結果 *：與CHOW組比較，P<0.05；**：與CHOW組比較，P<0.01；##：與HFD組比較，P<0.01

2.3 BQ-788能夠緩解動脈粥樣硬化斑塊進展

油紅O染色結果顯示，CHOW組小鼠胸主動脈血管無油紅O染色陽性著色區(qū)域；HFD組小鼠胸主動脈血管油紅O陽性著色面積占比超過30%，與CHOW組相比顯著增高(P<0.01)；而HFD+BQ-788組小鼠胸主動脈血管的油紅O陽性著色面積占比低于20%，顯著低于HFD組(P<0.01)，見圖3。

a：小鼠胸主動脈血管油紅O染色結果;b:油紅O染色陽性著色區(qū)域統(tǒng)計結果 *：與CHOW組比較，P<0.05；**:與CHOW組比較，P<0.01;##：與HFD組比較，P<0.01

HE染色結果顯示，CHOW組小鼠無動脈粥樣硬化斑塊“帽”；HFD組小鼠動脈粥樣硬化斑塊“帽”的平均厚度>15 μm，與CHOW組相比顯著增厚(P<0.01)；而HFD+BQ-788組小鼠動脈粥樣硬化斑塊“帽”的平均厚度<10 μm，顯著小于HFD組(P<0.01)，見圖4。

Masson染色結果顯示，CHOW組小鼠動脈血管內(nèi)壁無藍色(膠原)著色；HFD組小鼠動脈粥樣硬化斑塊有較大范圍的藍色(膠原)著色，與CHOW組比較顯著增大；HFD+BQ-788組斑塊的藍色(膠原)著色區(qū)域范圍明顯縮小，見圖4。

a:小鼠胸主動脈血管HE染色及Masson染色結果；b：動脈粥樣硬化斑塊“帽”的厚度測定結果 *:與CHOW組比較，P<0.05；**：與CHOW組比較，P<0.01；##：與HFD組比較，P<0.01

3 討論

NLRP3與Caspase-1及接頭蛋白共同組成了NLRP3炎癥小體。研究證明，膽固醇晶體可誘導激活人類巨噬細胞中的NLRP3炎癥小體[14]。使用ApoE-/-/Caspase-1-/-雙基因敲除小鼠模型的研究表明，Caspase-1的激活在血管炎癥和動脈粥樣硬化斑塊形成中起著關鍵作用，能增強病變部位的炎癥水平，進而加速動脈粥樣硬化的形成和惡化；而與ApoE+/+/Caspase-1+/+野生型相比，ApoE-/-/Caspase-1-/-雙基因敲除小鼠的斑塊面積顯著減少，血清炎癥細胞因子IL-1β、CCL2和TNF-α的水平明顯降低[15]。一項LoDoCo研究將廣泛用于治療炎癥的秋水仙堿用于ACS的二級預防，每天劑量為0.5 mg,在為期3年的隨訪中發(fā)現(xiàn)，秋水仙堿顯著減少了復發(fā)性心血管事件的發(fā)生[16]。還有研究表明，秋水仙堿可抑制NLRP3炎癥小體的激活[17]。miR-99a-5p通過靶向mTOR抑制NLRP3炎癥小體活化，從而減輕動脈粥樣硬化[18]。新型Caspase-1抑制劑VX765能夠通過抑制NLRP3炎癥小體的組裝減輕線粒體損傷，從而抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成[19]。Thioredoxin-1緩解動脈粥樣硬化也是通過抑制NLRP3炎癥小體的活性水平實現(xiàn)的[20]。本研究結果顯示，ET-1 B型受體拮抗劑BQ-788也能夠抑制HFD組小鼠胸主動脈的NLRP3炎癥小體的活化水平，并能降低HFD組小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

此外，本研究還觀察到HFD組小鼠循環(huán)系統(tǒng)中單核細胞亞群的顯著變化。已知Ly6Chigh單核細胞是在炎癥因子驅動下遷移到受傷或感染部位參與炎癥反應的細胞亞群；而Ly6Clow單核細胞則是在靜息脈管系統(tǒng)中巡邏并參與炎癥消退的細胞亞群[21]。由于Ly6Chigh單核細胞將分化為類似于M1型巨噬細胞(促炎)的亞型，而Ly6Clow單核細胞將分化為類似于M2型巨噬細胞(抗炎)的亞型，這可能導致動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)出現(xiàn)不同的巨噬細胞亞型[22-23]。已知制瘤素M在動脈粥樣硬化發(fā)展的多個階段中發(fā)揮促進作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，當暴露于氧化低密度脂蛋白后，制瘤素M以劑量依賴性方式在THP-1巨噬細胞表面被誘導高表達，并促進THP-1巨噬細胞活化為M1表型，加速動脈粥樣硬化斑塊的形成[24]。使用長鏈3-酮?；o酶A硫解酶曲美他嗪抑制脂肪酸氧化能夠抑制巨噬細胞NLRP3的活化，減緩動脈粥樣硬化的進展[25]。目前NLRP3炎癥小體影響循環(huán)系統(tǒng)中單核細胞亞群的機制尚不清楚，但本研究結果顯示，BQ-788在抑制NLRP3炎癥小體的同時，也能夠抑制單核細胞的增殖及向Ly6Chigh亞型的分化；與HFD組相比，HFD+BQ-788組小鼠全血單核細胞及Ly6Chigh亞型細胞數(shù)量明顯減少，且Ly6Clow亞型細胞數(shù)量顯著增加，進一步說明BQ-788具有顯著的抗炎效果。隨后本研究的油紅O染色、HE染色和Masson染色結果明確了BQ-788治療ApoE-/-小鼠晚期動脈粥樣硬化的療效，與HFD組相比，HFD+BQ-788組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積顯著減少，斑塊“帽”的厚度顯著減小，斑塊內(nèi)膠原沉積也明顯減少。這也進一步說明，炎癥及炎癥驅動激活的Ly6Chigh亞型單核細胞在動脈粥樣硬化形成過程中的確扮演著重要的角色，以Ly6Chigh亞型單核細胞為治療靶點或許能夠探索一條減緩動脈粥樣硬化進展的預防和治療新策略。

本研究僅使用ApoE-/-小鼠構建晚期動脈粥樣硬化模型這一種方式對BQ-788緩解動脈粥樣硬化的療效進行了評估，而未使用其他方式構建動脈粥樣硬化模型，如使用Ldlr-/-小鼠或Ldlr-/-合并糖尿病小鼠等造模在多個動物模型上對BQ-788的療效進行綜合評估，獲得的關于BQ-788治療動脈粥樣硬化的療效評價結論具有一定的局限性[5,26]。但本研究發(fā)現(xiàn)，使用ET-1 B型受體拮抗劑BQ-788治療動脈粥樣硬化是通過抑制NLRP3炎癥小體的激活水平和降低IL-1β的分泌發(fā)揮功效的，這為臨床上廣泛使用ET-1 B型受體拮抗劑類藥物進行ACS的二級預防提供了臨床前研究證據(jù)。