郭 誼，韓 炎，周麗芝，王俊華，馬 躍，魯大鵬

(1.唐山市中醫(yī)醫(yī)院口腔科，河北 唐山063000；2.文安縣醫(yī)院口腔科，河北 廊坊 065800；3.唐山市第八醫(yī)院口腔科，河北 唐山 063000；4.文安縣醫(yī)院心內(nèi)科，河北 廊坊 065800；5.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院急診綜合治療中心，北京 100050)

口腔鱗癌是臨床常見的口腔頜面部惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、惡性程度高、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。手術(shù)切除、放化療及聯(lián)合治療均是治療口腔鱗癌的常用方法，但患者預(yù)后仍較差，5年生存率不足40%[2]。因此，了解口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，找到相關(guān)的治療靶點(diǎn)非常重要。PIWI家族在各種生物中的表達(dá)具有廣泛保守性，主要參與調(diào)控干細(xì)胞自我更新、轉(zhuǎn)座子沉默、基因重組等過程[3]。精原干細(xì)胞自我更新基因PIWIL2是PIWI家族的重要成員之一，可介導(dǎo)轉(zhuǎn)座子活化調(diào)控生殖干細(xì)胞的自我更新[4]。有研究顯示，PIWIL2可能具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的潛力[5]。Wang等[6]發(fā)現(xiàn)，PIWIL2可預(yù)測口腔鱗癌患者的預(yù)后及癌前口腔白斑的癌變風(fēng)險，但PIWIL2在口腔鱗癌中的分子機(jī)制尚未完全明確。故本研究探討PIWIL2對口腔鱗癌細(xì)胞CAL27增殖、侵襲、遷移和裸鼠皮下移植瘤生長的影響，旨在為新型抗腫瘤藥物的開發(fā)和該病的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞與動物：人口腔鱗癌細(xì)胞株CAL27(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；16只BALB/c雄性裸鼠，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(冀)2018-004]，飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃、相對濕度40%～60%，每12 h光暗交替的環(huán)境中。

主要試劑：PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#和3#，慢病毒陰性對照病毒scramble(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco)；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本TaKaRa)；Transwell小室、基質(zhì)膠(美國BD)；JC-1探針、細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗Ki67、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、E-cadherin、N-cadherin、Snail抗體，小鼠抗β-actin抗體(美國Abcam)。

儀器：SpectraMax型多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)，CX21BIM-SET5型顯微鏡(日本OLYMPUS)，CyFlow Space型流式細(xì)胞儀(德國Partec)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基復(fù)蘇CAL27細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板，將細(xì)胞分為空白組(不作處理)，陰性對照組(轉(zhuǎn)染慢病毒陰性對照病毒scramble)和PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#、3#組(轉(zhuǎn)染PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#、3#)，其中慢病毒陰性對照病毒滴度為3×108TU/mL，以感染復(fù)數(shù)為50進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)72 h后加入1.5 mg/L嘌呤霉素，收集穩(wěn)定低表達(dá)PIWIL2的細(xì)胞。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測PIWIL2 mRNA表達(dá)

收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，加入TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，再添加SYBR Green PCR Master Mix試劑進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，共38個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算PIWIL2 mRNA的表達(dá)水平。PIWIL2上游引物序列為5’-ATCTATATCTGGCTGCTCCTC-3’，下游引物序列為5’-GATGCAAGATGTGTCCTGAC-3’；GAPDH上游引物序列為5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’，下游引物序列為5’-TCCCTCAAGAATGTCAGCAA-3’。

1.4 蛋白印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，定量后取70 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后切割目的蛋白處凝膠并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，加入封閉液室溫封閉2 h，加入兔抗Ki67、VEGF、E-cadherin、N-cadherin、Snail抗體，小鼠抗β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃下反應(yīng)過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，37 ℃下反應(yīng)1 h，洗膜后進(jìn)行暗室曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.5 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，以500個/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)約2周，每3天更換1次培養(yǎng)基，0.5%結(jié)晶紫染色后于光鏡下計數(shù)集落細(xì)胞。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

預(yù)先用基質(zhì)膠包被Transwell小室上室，收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種100 μL細(xì)胞于小室上室，下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出小室，除去上室未侵入細(xì)胞，并將侵入細(xì)胞于甲醇溶液中固定，0.5%結(jié)晶紫染色后于光鏡下計數(shù)染色侵襲細(xì)胞。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，以1×106/mL的密度接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，用200 μL無菌微量移液管尖端垂直于板底中央劃線，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別于0 h、24 h時光鏡下選擇劃痕區(qū)拍照，測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率。

1.8 JC-1探針檢測線粒體膜電位

收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，以1×104/mL的密度接種于專用培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，添加500 μL JC-1工作液，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光情況。

1.9 沉默PIWIL2對口腔鱗癌生長的影響

將16只BALB/c裸鼠隨機(jī)分為陰性對照組和PIWIL2-shRNA慢病毒組，每組8只。取對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109/L，接種于PIWIL2-shRNA慢病毒組裸鼠背部皮下，每只200 μL，構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型。每隔5 d測量腫瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積。腫瘤體積=長徑×短徑2/2。于第30天處死裸鼠，剝離腫瘤組織，稱重并計算其體積。再將腫瘤組織于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟組織切片，免疫組化染色檢測腫瘤組織中VEGF的陽性表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PIWIL2-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)細(xì)胞中PIWIL2表達(dá)

實(shí)時熒光定量PCR和蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#和3#組CAL27細(xì)胞中PIWIL2 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，以PIWIL2-shRNA慢病毒3#組降低最為顯著(圖1)，因此，后續(xù)選擇PIWIL2-shRNA慢病毒3#沉默CAL27細(xì)胞中PIWIL2的表達(dá)。

a：PIWIL2 mRNA水平比較；b：PIWIL2蛋白表達(dá)水平比較 *：與陰性對照組比較，P<0.05

2.2 沉默PIWIL2抑制CAL27細(xì)胞增殖能力

集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，PIWIL2-shRNA慢病毒組細(xì)胞集落形成率顯著降低(P<0.05)，見圖2。

a：集落形成實(shí)驗(yàn)光鏡圖(×200)；b：集落形成率定量圖 *：與陰性對照組比較，P<0.05

2.3 沉默PIWIL2抑制CAL27細(xì)胞中Ki67和VEGF蛋白表達(dá)

蛋白印跡法結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，PIWIL2-shRNA慢病毒組Ki67和VEGF蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

a：Ki67和VEGF蛋白電泳圖；b：Ki67和VEGF蛋白表達(dá)定量圖*：與陰性對照組比較，P<0.05

2.4 沉默PIWIL2抑制CAL27細(xì)胞侵襲能力

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，PIWIL2-shRNA慢病毒組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖4。

a：Transwell實(shí)驗(yàn)光鏡圖(×400)；b：侵襲細(xì)胞數(shù)定量圖 *：與陰性對照組比較，P<0.05

2.5 沉默PIWIL2抑制CAL27細(xì)胞遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，PIWIL2-shRNA慢病毒組劃痕愈合率顯著降低(P<0.05)，見圖5。

a：劃痕實(shí)驗(yàn)光鏡圖(×40)；b：劃痕愈合率 *：與陰性對照組比較，P<0.05

2.6 沉默PIWIL2降低CAL27細(xì)胞線粒體膜電位

JC-1探針結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，PIWIL2-shRNA慢病毒組紅色熒光減少，綠色熒光增多，見圖6。

a：JC-1探針檢測流式圖；b：細(xì)胞中紅綠熒光比較

2.7 沉默PIWIL2對CAL27細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

蛋白印跡法結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，PIWIL2-shRNA慢病毒組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，N-cadherin和Snail蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

a：蛋白電泳圖；b：蛋白相對表達(dá)定量圖 *：與陰性對照組比較，P<0.05

2.8 沉默PIWIL2抑制CAL27細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長

CAL27細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型和免疫組化染色結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，PIWIL2-shRNA慢病毒組移植瘤重量較輕，腫瘤體積較小，移植瘤組織中VEGF陽性表達(dá)率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖8。

a：移植瘤剝離觀察圖；b：移植瘤重量比較；c：移植瘤體積生長曲線；d：移植瘤組織免疫組化染色(×200)；e:移植瘤組織中VEGF陽性表達(dá) *：與陰性對照組比較，P<0.05

3 討論

早期研究認(rèn)為，PIWIL2僅表達(dá)于生殖細(xì)胞，隨著研究的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PIWIL2在人類各種腫瘤中廣泛表達(dá)，隨后其在腫瘤領(lǐng)域的研究迅速發(fā)展[7]。Feng等[8]研究顯示，PIWIL2可激活Wnt3a/β-catenin信號通路介導(dǎo)體細(xì)胞的重編程過程，使其獲得干細(xì)胞特性，從而促進(jìn)宮頸癌變。Zhao等[9]首次發(fā)現(xiàn)PIWIL2可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和凋亡促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的生長，且其高表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。有研究表明，PIWIL2在口腔鱗癌和惡變前口腔白斑中高表達(dá)，在口腔癌樣干細(xì)胞中具有重建腫瘤異質(zhì)性的能力[6]。本研究轉(zhuǎn)染PIWIL2-shRNA慢病毒至CAL27細(xì)胞中下調(diào)PIWIL2表達(dá)后，細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力明顯降低，且CAL27細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的重量和體積也受到明顯抑制，表明沉默PIWIL2可抑制CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。

細(xì)胞增殖抗原蛋白Ki67是一種僅存在于增生細(xì)胞的核蛋白，可表達(dá)于除G0期以外所有細(xì)胞周期階段的細(xì)胞核增殖標(biāo)志物，細(xì)胞周期為G1期時Ki67開始表達(dá)，在S期和G2期其表達(dá)逐漸升高，于M期達(dá)到峰值，但在有絲分裂結(jié)束后迅速分解[10]。因此，常以Ki67表達(dá)水平反映細(xì)胞增殖能力。VEGF是重要的血管生成因子，對血管的調(diào)控具有高度特異性和高效性，主要通過增加血管通透性和誘導(dǎo)血管形成促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[11]。本研究中PIWIL2-shRNA慢病毒組CAL27細(xì)胞中Ki67和VEGF蛋白表達(dá)水平降低，且移植瘤組織中VEGF陽性表達(dá)率也降低，說明沉默PIWIL2表達(dá)可抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖。Qiu等[12]也發(fā)現(xiàn)，沉默PIWIL2后，腫瘤細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞周期受到阻滯。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，沉默PIWIL2表達(dá)后，細(xì)胞線粒體膜電位下降，這是細(xì)胞凋亡過程中的標(biāo)志性事件。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指在胞外信號的刺激下，上皮細(xì)胞喪失極性，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，從而具有浸潤、游走、遷移的能力，這在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[13]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中伴有上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-cadherin、β-catenin等)表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(N-cadherin、波形蛋白等)表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子(Snail、腫瘤生長因子β等)表達(dá)上調(diào)，輔助性誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)上調(diào)[14-15]。Zhang等[16]通過構(gòu)建PIWIL2誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞衍生的外泌體發(fā)現(xiàn)，外泌體可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的癌癥相關(guān)表型，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，PIWIL2-shRNA慢病毒組CAL27細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平高于陰性對照組，N-cadherin和Snail蛋白表達(dá)水平低于陰性對照組，提示沉默PIWIL2表達(dá)可抑制CAL27細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制細(xì)胞侵襲及遷移。

綜上所述，沉默PIWIL2可抑制口腔鱗癌細(xì)胞CAL27增殖、侵襲、遷移及裸鼠皮下移植瘤的生長，提示PIWIL2可能是口腔鱗癌的有效治療靶點(diǎn)。