阿麗米熱·伊力哈木，卡米力江·買買提明，美爾瓦提，李朝陽

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院整形外科，新疆 烏魯木齊 830001；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院頜面外科，新疆 烏魯木齊 830001；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床心理科，新疆 烏魯木齊 830001)

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)形成是一種皮膚纖維增生性疾病，多發(fā)生在手術(shù)或嚴重燒傷引起的損傷后，會導致疼痛、瘙癢、關(guān)節(jié)活動受限、關(guān)節(jié)攣縮和畸形等，嚴重影響患者的身心健康[1]。目前HS形成的具體機制尚不清楚，其主要表現(xiàn)為成纖維細胞增殖、膠原蛋白過度產(chǎn)生及細胞外基質(zhì)過度沉積[2]。迄今為止，臨床已經(jīng)有了許多抑制HS形成的方法，如手術(shù)切除、放射療法、冷凍療法、內(nèi)皮質(zhì)類固醇注射以及激光療法等，但由于治療周期長、個體差異大及復發(fā)率高等情況，仍未能取得滿意的治療效果[3-4]。因此，臨床亟需尋找一種高效、方便、成本低、副作用小的治療方式。

近年來，干細胞治療已成為皮膚創(chuàng)面愈合的研究熱點。脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)是廣泛使用的成體干細胞之一，能夠促進皮膚傷口愈合，減少瘢痕形成[5]。ADSCs通過旁分泌細胞因子、外泌體(exosomes，Exo)和一些其他生物活性物質(zhì)發(fā)揮其生物學功能。其中，Exo是由細胞分泌的具有雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)的顆粒物，直徑40～150 nm，含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA和microRNA(miRNA)等物質(zhì)[6]。Exo作為干細胞旁分泌途徑中的重要成分，在促進皮膚創(chuàng)面修復和再生方面具有很高的應用前景，與直接使用干細胞進行組織修復相比，Exo具有安全性更高、易于儲存、快速高效、來源廣泛等優(yōu)點[7]。

miRNA是一種長度為21～23個核苷酸的非編碼RNA，能夠同時影響多個基因網(wǎng)絡(luò)以協(xié)調(diào)生物反應。miRNA可以通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)、編碼區(qū)或5’非翻譯區(qū)結(jié)合來抑制靶基因的表達，從而阻斷mRNA翻譯或降解，參與細胞增殖、分化、遷移、代謝和凋亡等過程[8]。此外，miRNA是皮膚形態(tài)發(fā)生改變和傷口愈合中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其在HS形成中也起著重要作用。有研究表明，miR-145與HS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在HS組織中miR-145的表達明顯降低，而miR-145能夠抑制成纖維細胞增殖和侵襲，并促進成纖維細胞凋亡[9]，這提示miR-145是抑制HS形成的潛在靶點。但ADSCs來源的Exo是否可以通過將外源性miR-145遞送至傷口部位，進一步發(fā)揮抑制瘢痕形成的作用目前仍有待進一步研究，本研究旨在探究富含miR-145的ADSCs來源Exo在HS形成中的作用，以期為臨床治療HS提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

SPF級健康雄性C57/BL6小鼠40只，8周齡，體質(zhì)量20～25 g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2021-000]，飼養(yǎng)條件：溫度22～25 ℃，相對濕度45%～55%，給予周期性光照/黑暗12 h循環(huán)，期間自由進食、飲水。適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

胎牛血清(杭州四季青)，青—鏈霉素雙抗液、DMEM培養(yǎng)基、成脂分化誘導培養(yǎng)基及成骨分化誘導培養(yǎng)基(美國Corning公司)，油紅O染色液和茜素紅染色液(北京伊塔生物科技有限公司)，Exo提取試劑盒(上海宇玫博生物公司)，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量檢測試劑盒(美國GeneCopoeia公司)，HE染色試劑盒(北京索萊寶科技公司)，Masson染色試劑盒(上海貝博生物公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒、DAB顯色試劑盒及ECL超敏發(fā)光液(上海碧云天生物研究所)。FITC標記的CD29、CD34、CD45、CD90和CD105抗體，Alix，Tsg101，CD81，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)及Ⅲ型膠原蛋白(CollagenⅢ)抗體(英國Abcam公司)；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔和GAPDH抗體(北京中杉金橋生物公司)。含miR-145的慢病毒及陰性對照miR-NC慢病毒的載體構(gòu)建、包裝、滴度測定均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 ADSCs分離與鑒定

收集志愿者進行抽脂術(shù)時抽取的脂肪組織，將脂肪組織剪碎，PBS清洗，添加1 mg/mL Ⅰ型膠原酶消化，過濾器過濾，以300 ×g低溫離心5 min，棄去上清液，留沉淀，加含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素雙抗液的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)，期間每3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及形態(tài)。取第3～5代細胞，PBS清洗后重懸，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，取100 μL懸液后依次加入10 μL FITC標記的CD29、CD34、CD45、CD90和CD105單抗，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌并重懸，通過流式細胞儀檢測分析。將分離的細胞分別使用成脂分化誘導培養(yǎng)基孵育2周或成骨分化誘導培養(yǎng)基孵育3周后，4%多聚甲醛固定，利用油紅O染色或茜素紅染色檢測誘導結(jié)果，測定細胞成脂、成骨分化能力，在光學顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.3 ADSCs轉(zhuǎn)染

將ADSCs以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別添加含miR-145過表達的慢病毒及陰性對照miR-NC慢病毒進行轉(zhuǎn)染，感染復數(shù)為50∶1，以正常培養(yǎng)未經(jīng)轉(zhuǎn)染的ADSCs作為對照，培養(yǎng)4 h后，棄原液，更換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，用1 mg/L嘌呤霉素篩選，以構(gòu)建穩(wěn)定過表達miR-145的ADSCs。

1.4 Exo提取與鑒定

收集轉(zhuǎn)染后的ADSCs上清液，差速超速離心，從上清液中分離ADSCs來源的Exo。在4 ℃下以300 ×g離心10 min，去沉淀，保留上清；于4 ℃下以2 000×g離心10 min，去除碎片和凋亡小體，保留上清；再于4 ℃下以10 000×g離心30 min，保留上清，0.22 μm濾膜過濾，添加Exo提取試劑液，4 ℃下靜置12 h后再以10 000×g離心60 min，棄上清，留沉淀，加入保存液吹打混勻，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。透射電鏡觀察顆粒物的形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析儀分析粒徑大小，Western blot檢測Exo表面標志性蛋白Alix、Tsg101和CD81的表達。

1.5 實時熒光定量PCR

利用Exo提取試劑盒提取總RNA，參照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA。設(shè)計miR-145和內(nèi)參基因U6的上游引物和下游引物：miR-145上游引物5’-GTCCAGTTTTCCCAGG-3’，下游引物5’-GAGCAGGCTGGAGAA-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。通過實時熒光定量PCR測定系統(tǒng)檢測miR-145表達，參照試劑盒說明書配制擴增體系，程序設(shè)置為：95 ℃ 3 min，循環(huán)1次；95 ℃ 12 s、62 ℃ 40 s、95 ℃ 15 s，循環(huán)45次。擴增結(jié)束后，采用2-△△Ct法計算miR-145的相對表達量。

1.6 HS動物模型建立與分組處理

參考文獻[10]制作小鼠HS模型，1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，無菌環(huán)境下常規(guī)備皮，在其背中線處作切口，長度為2 cm，縱向切開全層皮膚，再以6-0尼龍線縫合，繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠，在第4天后移除縫合線，機械牽拉裝置拉伸傷口，牽拉距離為2 mm，后每隔1 d牽拉4 mm，持續(xù)至第14天，構(gòu)建HS模型。

將40只小鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、Exo組和miR-145-Exo組，每組10只，除對照組外，其余3組小鼠均構(gòu)建HS模型。在第1次拉伸和第5次拉伸后，Exo組和miR-145-Exo組小鼠分別在背部傷口處皮下注射100 μL Exo和轉(zhuǎn)染miR-145的Exo，對照組和模型組注射等體積PBS，14 d后處死各組小鼠并切取瘢痕組織，一部分固定于4%多聚甲醛中用于組織學分析，另一部分置于液氮迅速冷凍后于-80 ℃保存。

1.7 HE染色

瘢痕組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制備5 μm厚的切片，置于37 ℃烘箱過夜，烤干后保存。進行HE染色，洗滌后自然晾干，滴加中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察各組小鼠皮膚組織病理學變化，拍攝圖像，并用病理圖像分析系統(tǒng)測量真皮層厚度。

1.8 Masson染色

取瘢痕組織石蠟切片，經(jīng)過脫蠟脫水處理后進行Masson染色，洗滌干凈，自然晾干，滴加中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察各組小鼠皮膚膠原沉積情況，并拍攝圖像。

1.9 免疫組化染色

取瘢痕組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟脫水后浸入3%過氧化氫中，加入5%山羊血清封閉組織切片15 min。在切片上滴加抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)單克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜；PBS清洗后，滴加辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體(1∶1 000)，室溫孵育60 min；PBS清洗，DAB顯色，蘇木精染核，脫水、透明，自然晾干，滴加中性樹膠封片，使用光學顯微鏡觀察各組小鼠皮膚組織染色情況，隨機取6個視野并拍攝，Image J軟件分析VEGF平均光密度值，以反映VEGF蛋白表達水平。

1.10 Western blot

將瘢痕組織于無菌環(huán)境下剪碎，研磨勻漿，加入RIPA裂解液裂解，隨后4 ℃下以10 000×g離心10 min，提取上清液，BCA法測定蛋白濃度。配制濃縮膠與分離膠，在樣孔內(nèi)加入等量的各蛋白樣品上樣，電泳分離蛋白，80 V恒壓電泳20 min，隨后將電壓調(diào)為110 V電泳60 min，再以恒壓100 V，冰上轉(zhuǎn)2 h至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，滴加α-SMA、TGF-β1、Collagen Ⅰ及CollagenⅢ抗體(均1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，再滴加辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗，ECL顯影及曝光，EPSON掃描儀掃描膠片，攝取蛋白圖像，以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析各目標條帶的蛋白灰度值，以目的蛋白與GAPDH的灰度值之比作為目的蛋白的相對表達量。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 ADSCs鑒定

倒置顯微鏡下觀察到分離的細胞表現(xiàn)出明顯的纖維細胞樣形態(tài)(圖1a)，具有多種分化潛能；經(jīng)茜素紅染色可見細胞內(nèi)沉積鈣鹽，形成明顯的紅色結(jié)節(jié)(圖1b)；油紅O染色可見細胞中有明顯脂滴形成，呈橘紅色(圖1c)。流式細胞術(shù)測定顯示，CD105(99.95%)、CD90(99.72%)和CD29(98.82%)呈陽性表達，CD34(1.15%)和CD45(0.08%)呈陰性表達(圖1d)，表明成功分離獲得ADSCs。

a：倒置顯微鏡下觀察ADSCs的形態(tài)；b：茜素紅染色檢測ADSCs成骨分化能力；c：油紅O染色檢測ADSCs成脂分化能力；d：流式細胞術(shù)檢測ADSCs表面標志物表達

2.2 ADSCs來源Exo及轉(zhuǎn)染效果鑒定

透射電鏡觀察到分離的顆粒物呈明顯的球形囊泡，粒徑峰值約為128 nm(圖2a、b)。Western blot檢測結(jié)果顯示，該顆粒物中Exo標志性蛋白Alix、Tsg101和CD81均呈陽性表達(圖2c)，說明該顆粒物為Exo。轉(zhuǎn)染miR-145的ADSCs來源Exo中miR-145相對表達水平顯著高于未經(jīng)轉(zhuǎn)染的ADSCs來源Exo及轉(zhuǎn)染miR-NC的ADSCs來源Exo(P<0.05)，見圖3。

a：透射電鏡觀察Exo形態(tài)；b：納米顆粒跟蹤分析儀測定Exo粒徑峰值；c：Western blot檢測Exo標志性蛋白的表達

*：與Exo比較，P<0.05；#：與miR-NC-Exo比較，P<0.05

2.3 各組小鼠皮膚組織形態(tài)學觀察

HE染色觀察到對照組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，真皮層較薄，皮下可見脂肪組織，成纖維細胞排列整齊，毛囊結(jié)構(gòu)明顯；模型組小鼠可見HS組織，真皮層較對照組顯著增厚(P<0.05)，成纖維細胞排列不規(guī)則，血管分布較為密集；Exo組和miR-145-Exo組小鼠中成纖維細胞恢復平行且規(guī)則排列，真皮層較模型組明顯變薄(P<0.05)，有毛囊結(jié)構(gòu)，HS區(qū)域減少；miR-145-Exo組對HS的組織病理學表現(xiàn)的改善作用較Exo組更加明顯，真皮層顯著變薄(P<0.05)，見圖4。

a：HE染色和Masson染色(×100)；b：真皮層厚度 *：與對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與Exo組比較，P<0.05

Masson染色發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，模型組皮膚組織內(nèi)出現(xiàn)大量致密的深染區(qū)域，膠原沉積明顯，組織表現(xiàn)為纖維化；與模型組比較，Exo組和miR-145-Exo組染色強度下降，染色區(qū)域減少，膠原沉積減少，組織纖維化得到緩解；與Exo組比較，miR-145-Exo組染色區(qū)域減少，染色強度下降，膠原沉積減少，纖維化程度更低，見圖4。

2.4 各組小鼠皮膚組織VEGF表達比較

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，相較于對照組，模型組小鼠皮膚組織內(nèi)著色細胞增多，染色加深，VEGF陽性表達率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，Exo組和miR-145-Exo組中著色細胞減少，VEGF陽性表達率顯著降低(P<0.05)；miR-145-Exo組中VEGF陽性表達率顯著低于Exo組(P<0.05)，見圖5。

a：免疫組化染色(×400)；b：VEGF陽性表達率比較 *：與對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與Exo組比較，P<0.05

2.5 各組小鼠皮膚組織TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ蛋白表達

模型組小鼠皮膚組織TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ蛋白表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)；與模型組比較，Exo組和miR-145-Exo組TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ及CollagenⅢ蛋白表達水平均顯著下調(diào)(P<0.05)；與Exo組比較，miR-145-Exo組TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ及CollagenⅢ蛋白表達水平均下調(diào)更明顯(P<0.05)，見圖6。

A：對照組；B：模型組；C：Exo組；D：miR-145-Exo組 *：與對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與Exo組比較，P<0.05

3 討論

手術(shù)、外傷、燒傷、燙傷等都會造成皮膚外傷，皮膚傷口的快速有效修復是保證皮膚屏障功能的關(guān)鍵。皮膚傷口的愈合過程是一個復雜的再生反應，涉及止血、炎癥反應、細胞增殖和組織重建4個階段，在這個動態(tài)過程中，過度的膠原蛋白沉積和成纖維細胞增殖會導致病理性瘢痕(包括HS和瘢痕疙瘩)的形成，該機制復雜多樣，涉及多種細胞和因子的多階段協(xié)同作用[2,11]。皮膚傷口無瘢痕愈合是瘢痕預防策略的最終目標。因此，揭示病理性瘢痕形成與增生機制中的關(guān)鍵細胞和分子之間的因果關(guān)系，從而為無瘢痕愈合提供新的治療靶點，是醫(yī)學整形外科領(lǐng)域的熱門課題之一，具有重要的臨床意義。

近年來，干細胞治療和組織工程的不斷進步使得更多替代療法成為可能，通過各種藥物和生長因子對生物材料進行功能化加工，為治療HS提供了一種可控且有效的方法。ADSCs是具有自我更新和多向分化能力的多能干細胞，在傷口愈合過程中，ADSCs可以直接分化為創(chuàng)傷修復所需的細胞系，如表皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞，并分泌細胞因子和生長因子，以促進健康組織再生，防止受傷區(qū)域瘢痕形成[12]。研究表明，干細胞的組織修復功能只有一小部分涉及受損區(qū)域干細胞的增殖和分化，而大部分則通過旁分泌信號傳導發(fā)揮作用[13-14]。ADSCs通過旁分泌生物活性因子調(diào)節(jié)免疫細胞促進炎癥反應，從而抑制瘢痕增生，其中，Exo攜帶復雜的生物信息并將其釋放到靶細胞中，作為旁分泌介質(zhì)存在于間充質(zhì)干細胞和靶細胞之間，可調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞遷移、骨再生和膠原蛋白合成。ADSCs來源Exo在傷口愈合的不同階段均發(fā)揮著重要作用，包括減少炎癥、調(diào)節(jié)血管生成和重塑基質(zhì)，并抑制組織纖維化及HS形成[7]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過ADSCs來源Exo處理的HS小鼠瘢痕區(qū)域與膠原沉積均減少，真皮層變薄，減輕了由機械牽拉造成的瘢痕形成程度。

miRNA在再生醫(yī)學中具有顯著作用，可在皮膚愈合、骨再生、肝再生、腎再生和心肌再生等過程中調(diào)節(jié)多種組織生長。Exo中所含的miRNA是細胞間通訊的重要介質(zhì)，Exo進入靶細胞后，受到降解和重新表達的調(diào)節(jié)，從而改變靶細胞的基因表達。Exo內(nèi)部還載有母細胞中所含的mRNA、蛋白質(zhì)、膽固醇等特異性生物學物質(zhì)[15]，由此可見，不同細胞來源的Exo可能具有不同的生物學特性。先前研究表明，攜帶miR-21、miR-23a和miR-125b的臍帶間充質(zhì)干細胞來源Exo可抑制TGF-β2/Smad2信號通路，從而抑制肌成纖維細胞的形成并防止瘢痕形成[16]；ADSCs來源Exo可通過傳遞外源性miR-29a抑制燙傷小鼠的病理性瘢痕形成，從而減少組織中的膠原沉積[17]。本研究結(jié)果顯示，攜帶miR-145的ADSCs來源Exo能夠抑制HS小鼠的瘢痕形成，并減少組織纖維化，這提示miR-145在ADSCs來源Exo抑制HS形成中起到了積極作用。

VEGF可誘導血管生成并促進血管再生，血管生成在促進創(chuàng)面愈合及瘢痕增生方面均具有重要作用；然而，異常的血管生成可能是導致瘢痕組織增生的關(guān)鍵因素[18]，提示靶向抑制血管生成是預防或減少瘢痕形成的主要手段之一，降低VEGF表達可減少HS形成。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)攜帶miR-145的ADSCs來源Exo作用的HS小鼠皮膚組織中VEGF陽性表達率顯著降低，提示攜帶miR-145的ADSCs來源Exo能夠抑制創(chuàng)面血管異常生成。已知瘢痕形成的特征包括膠原受體的重排、表達α-SMA的肌成纖維細胞的激活以及受影響組織中高水平TGF-β1的產(chǎn)生與分泌[19]。高表達的TGF-β1會刺激成纖維細胞的增殖和膠原蛋白產(chǎn)生，并抑制基質(zhì)降解，最終導致HS形成[20]；α-SMA作為成纖維細胞標志物，其表達異常增高表明成纖維細胞過度增殖；Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ是主要的間質(zhì)膠原蛋白，在細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成中具有重要作用，也與肌成纖維細胞表型和纖維化進展密切相關(guān)，Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ的過度沉積也會促進HS形成[21]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)攜帶miR-145的ADSCs來源Exo作用的HS小鼠皮膚組織內(nèi)TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ蛋白表達水平均顯著下調(diào)，提示攜帶miR-145的ADSCs來源Exo能夠明顯抑制小鼠皮膚組織HS形成。

綜上，本研究結(jié)果表明外源性miR-145能夠促進ADSCs來源Exo對小鼠HS形成的抑制作用，這種作用與抑制瘢痕血管生成與纖維增生以及相關(guān)因子TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ及CollagenⅢ的表達有關(guān)，提示miR-145修飾的ADSCs來源Exo可能是皮膚傷口愈合和病理性瘢痕的潛在治療方法。但關(guān)于miR-145的下游靶標及具體作用機制有待后續(xù)進一步探究。