馬衛(wèi)紅， 龔才偉， 陳啟青， 楊志艷， 羅德彪， 劉永懷， 彭慶波， 趙福瓊*

(1. 惠水縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州惠水550600； 2. 黔南州養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心，貴州都勻558000)

大腸桿菌(又稱大腸埃希氏菌)是1種典型的革蘭氏陰性桿菌[1]。該菌一般分為致病性和非致病性(或條件致病性)，在環(huán)境中廣泛存在，常作為環(huán)境、食品、飲水污染的指標細菌[2，3]。多年來，抗菌藥物在畜禽養(yǎng)殖中普遍使用，存在使用不規(guī)范、不合理甚至濫用的現(xiàn)象[4]。一方面促使細菌產(chǎn)生耐藥性，從而加大抗菌藥的使用量，對生活環(huán)境造成嚴重污染；另一方面，動物產(chǎn)品中抗菌藥物殘留，對公共衛(wèi)生安全帶來嚴重隱患[5]。筆者通過對貴州省惠水縣雞場及獸藥店抗菌藥物的使用和銷售情況進行調(diào)研，根據(jù)調(diào)研結(jié)果選擇部分常用的抗菌藥物進行大腸桿菌耐藥情況檢測，為雞場規(guī)范合理使用抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2021年5—12月，從全縣11個鄉(xiāng)鎮(zhèn)(街道)的16個雞場隨機無菌采集雞口咽和泄殖腔雙棉拭子，每場5份，共80份，24 h內(nèi)進行細菌分離培養(yǎng)鑒定。

1.2 主要試劑麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、抗生素藥敏紙片(均購于杭州微生物試劑有限公司)；Hifiscript cDNA Synthesis Kit(北京康為世紀生物科技有限公司)、核酸提取試劑盒(西安天隆科技有限公司)、Gold ViewⅠ型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)、瓊脂糖(蘭杰柯有限公司)。

1.3 主要儀器電子天平(型號：JA2003，上海上平儀器公司)、相稱顯微鏡(型號：ZYX300E，上海兆儀光電科技有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(型號：PR-BYX9082，上海普瑞賽斯儀器有限公司)、PCR儀(型號：StepOnePlus，賽默飛世爾科技公司)、全自動核酸提取儀(型號：NP968-C，西安天隆科技有限公司)、雙穩(wěn)定時電泳儀(型號：DYY-6C，北京六一生物科技有限公司)、藍光切膠儀(型號：BL-18，蘭杰柯有限公司)。

1.4 細菌分離培養(yǎng)將采集的雞口咽和泄殖腔雙棉拭子樣品分別浸入無菌生理鹽水1 mL，洗脫液采用平板劃線法接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。挑取典型菌落(粉紅色、圓形、光滑)進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。將典型菌落采用平板劃線法分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。再從麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上將典型菌落接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃純化培養(yǎng)24 h。

1.5 細菌PCR鑒定參考相關(guān)文獻[6]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成細菌16S rDNA通用引物。27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Tm：54.2 ℃)；1492R：5’-GGTTAACCTTACGACTT-3’(Tm：48.6 ℃)；預(yù)擴增片段約1 400 bp。以各分離菌純培養(yǎng)物為模板進行PCR鑒定。反應(yīng)體系50 μL：Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA模板5 μL，無菌水補足50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共31個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。 擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的大腸桿菌基因序列進行同源性(BLAST)比對。

1.6 細菌藥敏試驗按照《抗菌藥物敏感性試驗的技術(shù)要求》(WS/T 639—2018)，將純化培養(yǎng)的單個菌落接種于1.5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，用滅菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基表面水分吸干后，用眼科鑷取8種藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，測量抑菌圈直徑。判定敏感(S)、中敏(I)、耐藥(R)情況(見表1)。

表1 大腸桿菌耐藥判定標準

2 結(jié)果與分析

2.1 分離細菌特征麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長菌落為粉紅色、圓形、濕潤、表面光滑、半透明、邊緣整齊(見圖1)；伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上生長菌落為紫黑色、有金屬光澤(見圖2)；普通瓊脂培養(yǎng)基上生長菌落為白色、圓形(見圖3)。挑取典型菌落，經(jīng)革蘭氏染色，油鏡(×1 000)下觀察為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的小桿菌(見圖4)。

圖1 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基菌落 圖2 伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基菌落 圖3 普通瓊脂培養(yǎng)基菌落

圖4 菌體形態(tài)(×1 000)

2.2 細菌PCR鑒定結(jié)果PCR擴增產(chǎn)物長度約1 400 bp，經(jīng)測序為1 446 bp，與預(yù)期片段基本相符(見圖5)?；蛐蛄蠦LAST比對，分離菌與大腸桿菌的同源性為99.58%，鑒定為大腸桿菌。

2.3 細菌耐藥情況從16個雞場共分離到66株大腸桿菌，對阿莫西林耐藥率最高，其次分別為復(fù)方新諾明、氨芐西林、奧格門汀，且耐藥雞場數(shù)較多；對鏈霉素、慶大霉素、頭孢克洛、多西環(huán)素耐藥率相對較低，耐藥雞場數(shù)也較少。其中多個雞場出現(xiàn)多重耐藥情況(見表2、表3)。

M：DL 2 000 DNA Marker； 1～7：分離菌株(部分)； -：陰性對照圖5 分離菌16S rDNA PCR擴增

表2 大腸桿菌耐藥情況

表3 各雞場耐藥情況

3 結(jié)論

本次從惠水縣16個雞場分離的66株大腸桿菌耐藥較普遍，對阿莫西林、復(fù)方新諾明、氨芐西林、奧格門汀耐藥率較高，對鏈霉素、慶大霉素、頭孢克洛、多西環(huán)素耐藥率較低，多個雞場存在多重耐藥現(xiàn)象。

4 討論

近年來，抗菌藥物濫用導(dǎo)致的細菌耐藥已引起我國及國際社會的廣泛關(guān)注[7]。據(jù)報道，我國2013年抗生素總使用量達到10萬t，其中獸用抗生素占總量的52%[8]。抗生素在畜牧、水產(chǎn)等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用，然而濫用或不規(guī)范使用容易使細菌產(chǎn)生耐藥[9]，同時也對環(huán)境造成嚴重污染。本試驗從惠水縣雞場分離的66株大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類的阿莫西林、氨芐西林，以及奧格門汀(阿莫西林與克拉維酸復(fù)合制劑)、磺胺類的復(fù)方新諾明耐藥率較高。與全國耐藥細菌監(jiān)測網(wǎng)2014—2019年細菌耐藥監(jiān)測報告相比[10]，惠水縣分離菌株對氨芐西林的耐藥率(81.82%)比全國2019年(83.06%)略低，慶大霉素的耐藥率(36.36%)比全國2019年(37.3%)略低。檢測結(jié)果說明惠水縣雞場大腸桿菌的耐藥較普遍，但各個雞場耐藥情況差異較大，可能與不同的飼養(yǎng)管理有關(guān)。養(yǎng)殖場應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果科學(xué)選擇抗菌藥物種類，嚴格控制用量，科學(xué)制定給藥方案，避免在養(yǎng)殖過程中盲目濫用抗菌藥。