程德剛 李福昌 任剛

中藥是一種強(qiáng)有效的輔助治療手段，可用于臨床治療胰腺癌，其作用機(jī)制有待更深入的研究[1]。異澤蘭黃素是從菊科蒿屬植物中分離的一種黃酮苷元，具有抗炎，抗氧化，抗腫瘤等多種藥理活性[2,3],可抑制miR-21的表達(dá)，通過激活A(yù)KT通路誘導(dǎo)腎癌786-O細(xì)胞凋亡[4],可通過靶向Akt /GSK3β和MAPK/ERK信號級聯(lián)反應(yīng)來抑制食管癌TE1細(xì)胞增殖[5],可通過抑制ERK通路抑制肝癌細(xì)胞SK-HEP-1增殖以及促進(jìn)其凋亡[6]。然而異澤蘭黃素對胰腺癌細(xì)胞SW-1990生物學(xué)行為的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道m(xù)iR-138-5p上調(diào)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[7]。lncRNA MCM3AP-AS1通過調(diào)節(jié)miR-138-5p促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的生長和遷移[8]。生物學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-138-5p與lncRNA DCST1-AS1有結(jié)合位點(diǎn)，DCST1-AS1可促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖[9]。抑制DCST1-AS1可通過增加miR-874-3p表達(dá)抑制子宮頸癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究異澤蘭黃素對胰腺癌細(xì)胞SW-1990生物學(xué)行為的影響及機(jī)制是否與DCST1-AS1和miR-138-5p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 胰腺癌細(xì)胞SW-1990(美國ATCC)；RPMI-1640完全培養(yǎng)基(武漢Procell)；異澤蘭黃素(HPLC≥98%，滁州仕諾達(dá)生物)；CCK-8試劑盒(武漢博士德生物)；吉薩姆染色液(上海鈺博生物)；Transwell小室、基質(zhì)膠(美國康寧)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、蛋白提取試劑盒(上海貝博生物)；熒光定量PCR試劑盒(德國Qiagen)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(上海碧云天)。

1.2 細(xì)胞處理與分組 胰腺癌細(xì)胞SW-1990用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別用2.5 μmol/L、10 μmol/L、40 μmol/L異澤蘭黃素處理，記為異澤蘭黃素2.5、10、40 μmol/L組，常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組；將DCST1-AS1抑制表達(dá)載體及陰性對照轉(zhuǎn)染至SW-1990細(xì)胞，記為si-DCST1-AS1組、si-NC組；將DCST1-AS1過表達(dá)載體染至SW-1990細(xì)胞后用40 μmol/L異澤蘭黃素處理，記為異澤蘭黃素+pcDNA-DCST1-AS1組。

1.3 CCK-8檢測細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值(OD)。

1.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測集落形成數(shù) 將各組細(xì)胞消化后以適宜濃度接種于6孔板中，約培養(yǎng)2周有肉眼可見克隆時(shí)停止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液后用PBS將細(xì)胞洗滌2遍，甲醇固定，吉姆薩染色 30 min，干燥后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.5 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 用無血清培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞12 h，然后制備細(xì)胞懸液；將200 μl細(xì)胞懸液加入 Transwell 上室，下室加入600 μl含血清培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，甲醛固定30 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干；用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用PBS洗3遍；風(fēng)干后倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，記數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：基質(zhì)膠稀釋后平鋪于 Transwell 上室，凝固后同遷移操作。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加入結(jié)合緩沖液重懸，加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入Cleaved-caspase3一抗(1∶500)于4℃孵育過夜，倒掉一抗，洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶3 000)，室溫?fù)u床孵育2 h，洗膜，顯影，分析蛋白條帶灰度值。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測DCST1-AS1和miR-138-5p的表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總RNA，合成cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR，相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，DCST1-AS1上游引物序列：5’-CGGTTTTCTCCTCA

GCTTTG-3’，下游引物序列：5’-CCCATGTTTGGGGAT

AGATG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-ATTCCATGGC

ACCGTCAAGGCTGA-3’，下游引物序列：5’-TTCTCCA

TGGTGGTGAAGACGCCA-3’；miR-138-5p上游引物序列：5’-TGCAATGGGTTTGGCGTAGAAC-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCCGCAGGGTAGGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將DCST1-AS1野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC或miR-138-5p共轉(zhuǎn)染至SW-1990細(xì)胞，按照試劑盒說明檢測SW-1990細(xì)胞的熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 異澤蘭黃素對SW-1990增殖凋亡遷移侵襲的影響 與對照組比較，異澤蘭黃素2.5、10、40 μmol/L組SW-1990細(xì)胞活性降低，集落形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase3表達(dá)水平升高，呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 異澤蘭黃素誘導(dǎo)SW-1990凋亡；A 異澤蘭黃素誘導(dǎo)SW-1990凋亡；B 異澤蘭黃素促進(jìn)SW-1990中Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)(1 對照組；2 異澤蘭黃素2.5 μmol/L組；3 異澤蘭黃素10 μmol/L組；4 異澤蘭黃素40 μmol/L組)

表1 異澤蘭黃素抑制SW-1990增殖遷移侵襲誘導(dǎo)凋亡

2.2 異澤蘭黃素對SW-1990中DCST1-AS1、miR-138-5p表達(dá)的影響 與對照組比較，異澤蘭黃素2.5、10、40 μmol/L組SW-1990細(xì)胞中DCST1-AS1表達(dá)水平降低，miR-138-5p表達(dá)水平升高，呈濃度依賴性(P<0.05)。見表2。

表2 異澤蘭黃素對SW-1990中DCST1-AS1、miR-138-5p表達(dá)的檢測

2.3 DCST1-AS1靶向miR-138-5p Starbase預(yù)測顯示DCST1-AS1和miR-138-5p有互補(bǔ)序列；wt-DCST1-AS1與miR-138-5p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性低于wt-DCST1-AS1與miR-NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(P<0.05)；而mut-DCST1-AS1與miR-138-5p或miR-NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性無差異(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 DCST1-AS1和miR-138-5p的互補(bǔ)序列

2.4 沉默DCST1-AS1對SW-1990增殖凋亡遷移侵襲的影響 與si-NC組比較，si-DCST1-AS1組DCST1-AS1表達(dá)水平降低，miR-138-5p表達(dá)水平升高，SW-1990細(xì)胞活性降低，集落形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase3表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖3，表4。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖3 沉默DCST1-AS1誘導(dǎo)SW-1990凋亡；A 沉默DCST1-AS1誘導(dǎo)SW-1990凋亡；B 沉默DCST1-AS1促進(jìn)SW-1990中Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)(1 si-NC組；2 si-DCST1-AS1組)

2.5 過表達(dá)DCST1-AS1對異澤蘭黃素處理的SW-1990增殖、凋亡、遷移侵襲的影響 與異澤蘭黃素組相比，異澤蘭黃素+pcDNA-DCST1-AS1組DCST1-AS1表達(dá)水平升高，miR-138-5p表達(dá)水平降低，SW-1990細(xì)胞活性升高，集落形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase3表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述指標(biāo)在對照組與異澤蘭黃素組間亦均有差異(P<0.05)。見圖4，表5。

表4 沉默DCST1-AS1抑制SW-1990增殖遷移侵襲誘導(dǎo)凋亡

圖4 過表達(dá)DCST1-AS1可逆轉(zhuǎn)異澤蘭黃素對SW-1990凋亡的誘導(dǎo)作用；A 過表達(dá)DCST1-AS1可逆轉(zhuǎn)異澤蘭黃素對SW-1990凋亡的誘導(dǎo)作用；B 過表達(dá)DCST1-AS1可逆轉(zhuǎn)異澤蘭黃素對SW-1990中Cleaved-caspase3表達(dá)的促進(jìn)作用(1 對照組；2 異澤蘭黃素組；3 異澤蘭黃素+pcDNA-DCST1-AS1組)

表5 過表達(dá)DCST1-AS1可逆轉(zhuǎn)異澤蘭黃素對SW-1990增殖、遷移、侵襲、凋亡的作用

3 討論

黃酮類化合物具有抗氧化性，抗病毒，抗腫瘤等多種生物活性，開發(fā)抗腫瘤的含黃酮類中藥對治療各種癌癥具有重要意義[11]。異澤蘭黃素作為一種重要的黃酮類活性成分，研究報(bào)道異澤蘭黃素通過促進(jìn)HeLa和Caski宮頸癌細(xì)胞株的凋亡和細(xì)胞周期阻滯來抑制增殖[12]。異澤蘭黃素可促進(jìn)上皮性卵巢癌的細(xì)胞凋亡[13]，可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖，遷移和侵襲[14]，可通過調(diào)節(jié)PTEN和NF-κB信號傳導(dǎo)抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[15]。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的異澤蘭黃素的處理胰腺癌細(xì)胞SW-1990，結(jié)果顯示，SW-1990細(xì)胞的活性降低，集落形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase3表達(dá)水平升高，呈濃度依賴性；表明異澤蘭黃素可濃度依賴性的抑制SW-1990細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道DCST1-AS1通過靶向miR-605-3p來調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖，遷移，侵襲和凋亡[16]。DCST1-AS1通過AKT/mTOR信號通路加速肝癌細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移和自噬[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默DCST1-AS1后，SW-1990細(xì)胞活性降低，集落形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase3表達(dá)水平升高；表明沉默DCST1-AS1可抑制SW-1990細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；提示DCST1-AS1在胰腺癌中作用與在其他癌癥中相似。且本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DCST1-AS1靶向調(diào)控miR-138-5p；而上調(diào)miR-138-5p水平可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲[18]。提示，DCST1-AS1可通過調(diào)控miR-138-5p影響胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異澤蘭黃素可降低DCST1-AS1表達(dá)水平降低，提高miR-138-5p表達(dá)水平；而過表達(dá)DCST1-AS1可逆轉(zhuǎn)異澤蘭黃素對SW-1990細(xì)胞的作用。

綜上所述，異澤蘭黃素通過調(diào)控DCST1-AS1/miR-138-5p軸抑制胰腺癌細(xì)胞SW-1990的惡性生物學(xué)行為。