馬真 宋海亮 謝然尖措 趙吉彪

神經(jīng)病理性疼痛是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷或疾病引起的一種慢性疾病，影響30%至50%的世界人口，是患者、社會(huì)和醫(yī)療領(lǐng)域的重要負(fù)擔(dān)[1,2]。神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有發(fā)病率高、現(xiàn)有治療方案不足、臨床干預(yù)效率較低等特點(diǎn)，是一件非常棘手的問(wèn)題，因此需要進(jìn)一步研究以確定和驗(yàn)證潛在的靶點(diǎn)[2,3]。多項(xiàng)研究表明神經(jīng)病理性疼痛與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，機(jī)體炎性因子的大量釋放嚴(yán)重?fù)p害神經(jīng)細(xì)胞及非神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，影響神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)，最終引起機(jī)體的痛覺(jué)異常[4,5]，因此從降低機(jī)體炎性反應(yīng)、緩解疼痛等方面尋找相關(guān)的治療靶點(diǎn)是有效的。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)中相關(guān)基因的表達(dá)，在維持神經(jīng)系統(tǒng)功能等方面發(fā)揮重要作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥來(lái)影響神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[6]。miR-338-3p是miRNA家族成員之一，參與炎性反應(yīng)等多種生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)控。鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱα，CaMKⅡα)是細(xì)胞內(nèi)傳遞Ca2+信號(hào)的關(guān)鍵分子，具有α、β、γ和δ四種異構(gòu)體。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)miR-338-3p通過(guò)阻止炎癥信號(hào)通路的異常激活而抑制促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，并認(rèn)為可能是miR-338-3p的直接靶點(diǎn)，但關(guān)于miR-338-3p與CaMKⅡγ之間的研究較少，因此本研究通過(guò)構(gòu)建神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，探究miR-338-3p調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 55只SD雄性大鼠購(gòu)于上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，均為SPF級(jí)，體重約為240 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0012。大鼠均在本院動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，動(dòng)物房通風(fēng)、光照條件良好，溫度約25℃，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食進(jìn)水，每周清潔1次鼠籠并更換新鮮墊料，每天清潔1次飲水瓶。大鼠背根神經(jīng)元細(xì)胞(貨號(hào)：CP-R126)購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)ELISA試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：R1200、RP1105、SEKR-0009、SEKR-0008、SEKR-0002、D0010)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；miR-388-3p類(lèi)似物(mimic)及其陰性對(duì)照物(mimic NC)均油廣州銳博生物科技有限公司合成；CaMKⅡγ抗體、GAPDH抗體、羊抗兔IgG(貨號(hào)：ab262701、ab181602、ab6721)購(gòu)自美國(guó)Abcam；EnVision多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于PerkinElmer公司；I-U-004爪觸覺(jué)測(cè)試儀、38450電子觸覺(jué)測(cè)量?jī)x購(gòu)于意大利UGO BASILE公司等。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備及分組處理：參考文獻(xiàn)[8]制備神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，將55只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組(10只)和造模組(45只)。將大鼠麻醉后進(jìn)行表皮常規(guī)消毒，縱向切開(kāi)大鼠腰部5～6間隙后逐層分開(kāi)，使L5白色椎板暴露，用針頭刺破髂棘(L5～L6棘突間隙)部位，將PE-10導(dǎo)管從刺破處置入約2 cm，再將導(dǎo)管外端經(jīng)皮下移至頸部并固定，大鼠出現(xiàn)甩尾、抖動(dòng)反射、有清亮腦脊液流出等現(xiàn)象表明置管成功，置管成功后3 d剔除癱瘓、狀態(tài)不佳或運(yùn)動(dòng)障礙的大鼠；再次將大鼠麻醉，于大鼠背部正中做切口，暴露L5和L6脊神經(jīng)，分離并采用4-0縫線結(jié)扎L5、L6脊神經(jīng)，當(dāng)出現(xiàn)小腿肌肉輕度顫動(dòng)時(shí)表明結(jié)扎強(qiáng)度適宜，隨后縫合大鼠肌肉及皮膚，假手術(shù)組僅分離L5和L6脊神經(jīng)，不做結(jié)扎處理。造模過(guò)程中觀察并記錄大鼠一般情況，當(dāng)大鼠出現(xiàn)舔舐后爪、后爪收縮、跛行、足趾并攏等現(xiàn)象表明神經(jīng)病理性疼痛模型構(gòu)建成功。造模過(guò)程中，造模組出現(xiàn)3只大鼠置管后狀態(tài)不佳，2只死亡，共造模成功40只。

1.3.2 將造模成功的40只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為模型組、陰性對(duì)照組、miR-338-3p組、miR-338-3p+CaMKⅡγ組，每組10只。參考文獻(xiàn)[9]，miR-338-3p組在造模第3、5、7天鞘內(nèi)注射4 mg/kg的miR-338-3p mimic，miR-338-3p+CaMKⅡγ組共注射miR-338-3p mimic、CaMKⅡγ mimic，陰性對(duì)照組鞘內(nèi)注射等量mimic NC，模型組及假手術(shù)組注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 大鼠行為學(xué)測(cè)定 分別在造模第0、2、6、10、14天測(cè)定大鼠機(jī)械痛覺(jué)閾值(mechnical withdrawal threshold，MWT)及熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。提前將大鼠放入爪觸覺(jué)測(cè)試儀中30 min，待其適應(yīng)環(huán)境后用電子觸覺(jué)測(cè)量針刺激大鼠的足底部，在大鼠縮足時(shí)記錄儀器中電子觸覺(jué)測(cè)量針刺激力度，即為大鼠MWT值。將大鼠置于足底熱刺激儀透明塑料籠中適應(yīng)30 min，用熱輻射刺激儀透過(guò)玻璃板照射大鼠足底部，記錄大鼠從照射開(kāi)始到其縮足的時(shí)間，即為大鼠TWL值，為防止?fàn)C傷大鼠，將時(shí)間上限設(shè)置為30 s，每只大鼠重復(fù)測(cè)量5次，每次間隔5 min[10]。

1.5 大鼠背根神經(jīng)節(jié)標(biāo)本采集 行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，將大鼠麻醉，用含有多聚甲醛及戊二醛的磷酸緩沖液進(jìn)行心臟灌注，灌注至大鼠四肢僵硬，無(wú)菌環(huán)境下取出大鼠L5～L6背根神經(jīng)節(jié)，低溫保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.6 大鼠背根神經(jīng)節(jié)中miR-338-3p、CaMKⅡγ mRNA表達(dá)情況 取1.5中大鼠部分背根神經(jīng)節(jié)組織，用總RNA提取試劑盒提取其中的總RNA，取1.5 μl背根神經(jīng)節(jié)組織RNA提取液，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，對(duì)miR-338-3p、CaMKⅡγ進(jìn)行擴(kuò)增，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定，反應(yīng)體系共20 μl：10 μl 2×SYBR Mix，8 μl H2O，上下游引物各0.5 μl，1 μl 10×cDNA模板；反應(yīng)條件：95℃(5 min)、95℃(1 min)、62℃(1 min)、72℃(2 min)，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCT算法分析miR-338-3p、CaMKⅡγ的表達(dá)水平，U6：上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-338-3p：上游引物5’-UUUGCGGAAUUUUAA AUGCUGGA-3’，下游引物5’-GUUGUUUUAGUGACUACGACCU-3’；CaMKⅡγ：上游引物5’-ATGGCCACCACCGCCACCT-3’，下游引物5’-CTGCAGCGGTGCGGCAGGG-3’。

1.7 大鼠背根神經(jīng)節(jié)中CaMKⅡγ蛋白表達(dá)情況 取1.5中大鼠部分背根神經(jīng)節(jié)組織，用RIPA裂解液提取其中的總蛋白，用BCA試劑盒對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行定量。取30 μg蛋白沸水浴變性后，上樣經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入CaMKⅡγ抗體(1∶1 500)、GAPDH抗體(1∶1 500)并4℃孵育過(guò)夜，加入二抗羊抗兔IgG(1∶2 000)于室溫下孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色顯影，掃描圖像，分析條帶灰度值，計(jì)算CaMKⅡγ蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值。

1.8 大鼠背根神經(jīng)節(jié)中炎性因子表達(dá)水平測(cè)定 取1.5中大鼠部分背根神經(jīng)節(jié)組織，加入適量生理鹽水，研磨成10%的組織勻漿，離心取上清液，根據(jù)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素1β(IL-1β)相關(guān)試劑盒的操作步驟進(jìn)行背根神經(jīng)節(jié)組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.9 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 在TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)中分析預(yù)測(cè)miR-338-3p與CaMKⅡγ的靶向作用位點(diǎn)。構(gòu)建突變型(MUT)和野生型(WT)基因靶點(diǎn)CaMKⅡγ的3’-UTR熒光素酶表達(dá)載體，將購(gòu)買(mǎi)的大鼠背根神經(jīng)元細(xì)胞快速融化，經(jīng)過(guò)消化、傳代后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，采集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將CaMKⅡγ-MUT、CaMKⅡγ-WT重組載體分別與miR-338-3p mimic及mimic NC共轉(zhuǎn)染至大鼠背根神經(jīng)元細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 假手術(shù)組大鼠健康狀況良好，行為學(xué)觀察無(wú)明顯變化；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠出現(xiàn)甩足、舔足、足趾并攏等現(xiàn)象；與假手術(shù)組比較，miR-338-3p組大鼠行為學(xué)得到一定改善。

2.2 miR-338-3p與CaMKⅡγ靶向關(guān)系預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，miR-338-3p在CaMKⅡγ mRNA 3’UTR存在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)；熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CaMKⅡγ WT+mimic NC組比較，CaMKⅡγ WT+miR-338-3p mimic組大鼠背根神經(jīng)元細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，CaMKⅡγ MUT+mimic NC組、CaMKⅡγ MUT+miR-338-3p mimic組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-338-3p與CaMKⅡγ的靶向作用關(guān)系

2.3 5組大鼠MWT、TWL值比較 假手術(shù)組大鼠手術(shù)前后MWT、TWL值無(wú)明顯變化，其余組大鼠造模后MWT、TWL值明顯降低，之后隨著時(shí)間的推移逐漸升高。造模第0天，5組大鼠MWT、TWL值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模第2天，與假手術(shù)組比較，模型組、陰性對(duì)照組、miR-338-3p組、miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠MWT、TWL值均顯著降低(P<0.05)。造模第6、10、14天，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠MWT、TWL值均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-338-3p組及miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠MWT、TWL值均顯著升高(P<0.05)；與miR-338-3p組比較，miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠MWT、TWL值均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠MWT、TWL值比較

2.4 5組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中miR-338-3p、CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達(dá)情況比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中miR-338-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-338-3p組及miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中miR-338-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與miR-338-3p組比較，miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表3。

圖1 大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中CaMKⅡγ表達(dá)情況

表3 5組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中miR-338-3p、CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達(dá)情況比較

2.5 5組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中炎性因子表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-338-3p組及miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與miR-338-3p組比較，miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 5組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β表達(dá)水平比較

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)病變或疾病引起的，有痛覺(jué)過(guò)敏、感受異常、自發(fā)性疼痛、異常疼痛等臨床特征，自身免疫性疾病、物理性機(jī)械損傷、神經(jīng)毒性藥物等均是其常見(jiàn)誘因，由于神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，導(dǎo)致其臨床治療效果不佳，因此，找出神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制的具體分子機(jī)制對(duì)于治療這種慢性疾病具有重要意義[11,12]。研究中常用脊神經(jīng)結(jié)扎等方式構(gòu)建神經(jīng)病理性疼痛模型，王裕生等[13]通過(guò)此方法構(gòu)建的神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠出現(xiàn)明顯的痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象，且能更好的模擬神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠出現(xiàn)甩足、舔足、足趾并攏等行為學(xué)異?，F(xiàn)象，MWT、TWL值顯著升高，提示神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型構(gòu)建成功。

多項(xiàng)研究表明，神經(jīng)病理性疼痛與機(jī)體炎性反應(yīng)聯(lián)系密切，當(dāng)脊神經(jīng)受到損害后，損害部位、背根神經(jīng)節(jié)、脊髓等迅速產(chǎn)生較多的促炎因子，從而導(dǎo)致大量炎性因子的產(chǎn)生，參與多種傷害性信息的傳遞，神經(jīng)生長(zhǎng)因子、促炎性細(xì)胞因子等均可作用于神經(jīng)元細(xì)胞，從而增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性、進(jìn)一步放大神經(jīng)炎性反應(yīng)[14,15]。Ghasemzadeh等[16]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)病理性疼痛大鼠體內(nèi)TNF-α等炎性因子水平顯著升高，而迷迭香的抗炎作用能有效減輕模型大鼠的痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象，因此靶向神經(jīng)炎性反應(yīng)可能是神經(jīng)病理性疼痛治療的新方向。近年來(lái)的研究表明miRNA參與調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的炎性反應(yīng)，Bao等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-28-5p過(guò)表達(dá)能顯著抑制神經(jīng)病理性疼痛大鼠體內(nèi)IL-1β、IL-6等炎性因子表達(dá)水平并緩解大鼠痛覺(jué)異常等不良表現(xiàn)。Lu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a-5p可通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中的TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)的表達(dá)來(lái)減輕炎性反應(yīng)，進(jìn)而減輕脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。miR-338-3p是miRNA的一員，與機(jī)體炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)[19]研究發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的miR-338-3p能激活內(nèi)皮細(xì)胞炎癥信號(hào)通路，而過(guò)表達(dá)miR-338-3p能顯著抑制相關(guān)炎癥通路的激活，可能與神經(jīng)病理性疼痛疾病聯(lián)系密切[20,21]。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達(dá)水平顯著升高，提示神經(jīng)病理性疼痛與神經(jīng)炎性反應(yīng)密切相關(guān)；與模型組比較，miR-338-3p組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中炎性因子表達(dá)水平、MWT、TWL值均顯著降低，提示過(guò)表達(dá)miR-338-3p能顯著降低神經(jīng)病理性疼痛引起的神經(jīng)炎性反應(yīng)，并具有一定的緩解神經(jīng)病理性疼痛的作用。

采用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果對(duì)miR-338-3p靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示miR-338-3p在CaMKⅡγ mRNA 3’UTR存在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，CaMKⅡγ是CaMKⅡ家族成員之一，與神經(jīng)元損傷、中樞神經(jīng)痛覺(jué)過(guò)敏等方面聯(lián)系密切[22,23]，Pan等[24]研究發(fā)現(xiàn)完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的慢性炎癥痛小鼠脊髓中CaMKⅡγ表達(dá)水平顯著升高，miR-219過(guò)表達(dá)可顯著降低CaMKⅡγ的表達(dá)，并顯著減輕小鼠的痛反應(yīng)異常等行為。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，miR-338-3p組及miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達(dá)水平、背根神經(jīng)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達(dá)水平均顯著降低，熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-338-3p過(guò)表達(dá)能顯著下調(diào)野生型CaMKⅡγ-3’UTR熒光素酶活性，表明在脊根神經(jīng)節(jié)中miR-338-3p可直接作用于CaMKⅡγ的3’UTR區(qū)，進(jìn)而調(diào)控CaMKⅡγ的基因表達(dá)。與miR-338-3p組比較，miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達(dá)水平、背根神經(jīng)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達(dá)水平均顯著升高，表明miR-338-3p可能通過(guò)靶向抑制CaMKⅡγ表達(dá)，進(jìn)而降低神經(jīng)病理性疼痛引起的神經(jīng)炎性反應(yīng)。

綜上所述，miR-338-3p可能通過(guò)抑制CaMKⅡγ的表達(dá)緩解神經(jīng)病理性疼痛大鼠的痛覺(jué)過(guò)敏及神經(jīng)炎性反應(yīng)，這可能為臨床治療神經(jīng)病理性疼痛提供新思路，但本研究并未采用CaMKⅡγ相關(guān)干擾技術(shù)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，因此仍需深入研究。