徐華 張海萍 王虹伊 趙欽 郭巧寧 馬蕾 陸軍

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、最具侵襲性的原發(fā)腫瘤，約占腦腫瘤原發(fā)惡性腫瘤的80%[1]。盡管手術(shù)切除后放療和化療的聯(lián)合治療取得了進(jìn)展，但患者的預(yù)后仍然很差，診斷后的中位生存期約為15個月[2]。因此，有必要識別特定于膠質(zhì)瘤階段或膠質(zhì)瘤對抗癌藥物易感性的新生物標(biāo)記物，為膠質(zhì)瘤的治療管理提供重要的見解。在眾多被證實參與膠質(zhì)瘤的分子中，lncRNA因其在癌變過程中的異常表達(dá)越來越受到關(guān)注[3,4]。LncRNA通常被定義為長度在200 bp～100 kbp的非蛋白質(zhì)編碼RNA分子[5]。研究表明lncRNA以通過多種方式調(diào)控基因表達(dá)，包括染色體重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工，并參與細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控[6]。此外，lncRNA的失調(diào)越來越多地與許多人類疾病，特別是癌癥有關(guān)[7,8]。如高表達(dá)lncRNA CCND2-AS1通過Wnt/β-catenin信號促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[9]。另外發(fā)現(xiàn)lncRNA CCAT1通過海綿化miR-181b促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生[10]。目前研究表明LncRNA GAS6-AS1參與了乳腺癌、肺腺癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展[11]。然而，關(guān)于LncRNA GAS6-AS1在膠質(zhì)瘤中的特異性表達(dá)模式尚未有全面的研究報道，LncRNA GAS6-AS1參與膠質(zhì)瘤發(fā)展的潛在作用和機(jī)制尚不清楚，因此本研究主要揭示了LncRNA GAS6-AS1在膠質(zhì)瘤增殖過程中的作用及其影響放療敏感性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 腦膠質(zhì)瘤樣本均來自本院經(jīng)病理確診的腦膠質(zhì)瘤患者。所有患者術(shù)前未接受化療或放療。所有標(biāo)本切除后立即用液氮冷凍，并在-80℃保存直到使用。本研究經(jīng)本院的倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得所有患者的書面知情同意。腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞來自武漢普諾賽生命科技有限公司。CCK-8檢測試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)公司。DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基)來自美國ATCC。TRIzol試劑來自美國Invitrogen公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。GAS6-AS1 siRNA質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒來自上海生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞在添加10%胎牛血清Dulbecco’s-modified Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2濕化培養(yǎng)箱中。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 T98G細(xì)胞鋪于12孔板，查看細(xì)胞匯合至75%，根據(jù)制造商的說明利用Lipofectamine 2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至T98G細(xì)胞中，并用X射線垂直照射細(xì)胞，48 h后進(jìn)行檢測。

1.4 T98G細(xì)胞增殖能力測定 6孔板中的T98G細(xì)胞稀釋后接種到96孔板中，同時設(shè)置6 Gy X射線照射細(xì)胞作為實驗組，將10 μl CCK-8溶液加入96孔板中并在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。實驗重復(fù)3次后分析細(xì)胞吸光度值。

1.5 雙熒光素酶報告基因活性檢測 包含miR-324-3p結(jié)合位點的GAS6-AS1序列克隆到pmirGlO雙熒光素酶載體中制備GAS6-AS1 wt質(zhì)粒，利用點突變試劑盒制備GAS6-AS1 mut質(zhì)粒。按照說明書取Lipofectamine 2000將LncRNA GAS6-AS1 wt、LncRNA GAS6-AS1 mut分別與miR-324-3p mimics、mimics NC轉(zhuǎn)染至T98G細(xì)胞，檢測雙熒光素酶活性。

1.6 細(xì)胞侵襲實驗 取Transwell上室加入Matrigel并在37℃下使其干燥，取含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入，將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞懸液加入上室中。48 h后用4%多聚甲醛固定，并加入0.1%結(jié)晶紫染色，利用顯微鏡隨機(jī)選取視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.7 實時定量PCR 使用TRIzol試劑從組織或培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑試劑盒(Takara，遼寧大連，中國)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA (cDNA)。其合成是按照說明書在37℃孵育15 min，然后85℃孵育5 s。采用ABI7500系統(tǒng)進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。實時聚合酶鏈反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行3次。以GAPDH作為內(nèi)參基因。見表1。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測T98G細(xì)胞凋亡率 取轉(zhuǎn)染48 h后的T98G細(xì)胞，消化后將細(xì)胞進(jìn)行離心，并取流式緩沖液加入細(xì)胞中，取5 μl Annexin V-APC置于其中，靜置30 min，取5 μl PI置于其中,靜置5 min用上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.9 Western blot 使用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，并提取總蛋白，所有步驟均按照廠家的操作規(guī)程進(jìn)行。隨后將細(xì)胞裂解液放入5× SDS-PAGE上樣緩沖液中煮沸10 min，用12% SDS-PAGE溶液溶解并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜中。一抗和二抗分別孵育蛋白后用ECL試劑盒檢測蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞增殖、侵襲及放療敏感性比較 與癌旁正常組織比較，腦膠質(zhì)瘤組織中LncRNA GAS6-AS1 mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。2、4、6 Gy X射線照射T98G細(xì)胞后中GAS6-AS1 mRNA表達(dá)低于0 Gy劑量X射線照射(P<0.05)。下調(diào)LncRNA GAS6-AS1表達(dá)后，GAS6-AS1 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。下調(diào)GAS6-AS1表達(dá)后，T98G細(xì)胞活力降低(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目減少。6 Gy X射線照射細(xì)胞后活力明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；下調(diào)GAS6-AS1表達(dá)后并用6 Gy X射線照射細(xì)胞，活力明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見圖1，表2、表3。

圖1 下調(diào)LncRNA GAS6-AS1影響T98G細(xì)胞增殖、侵襲及放療敏感性；A 下調(diào)LncRNA GAS6-AS1表達(dá)后檢測細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色，×200)；B 下調(diào)LncRNA GAS6-AS1表達(dá)后用6 Gy X射線照射檢測細(xì)胞凋亡率

表2 LncRNA GAS6-AS1 mRNA表達(dá)

表3 4組細(xì)胞增值、侵襲能力比較

2.2 4組雙熒光素酶活性比較 GAS6-AS1 wt+miR-324-3p mimics組熒光素酶活性顯著低于mimics NC+GAS6-AS1 wt組(P<0.01)，GAS6-AS1 mut+miR-324-3p mimics組熒光素酶活性與mimics NC+GAS6-AS1 mut組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4,圖2。

表4 4組雙熒光素酶活性比較

圖2 LncRNA GAS6-AS1與miR-324-3p的結(jié)合位點

2.3 上調(diào)LncRNA GAS6-AS1通過miR-324-3p影響T98G細(xì)胞增殖、侵襲及放療敏感性 與癌旁正常組織比較，腦膠質(zhì)瘤組織中miR-324-3p mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)。2、4、6 Gy X射線照射T98G細(xì)胞后中miR-324-3p mRNA表達(dá)高于0 Gy劑量X射線照射(P<0.05)。上調(diào)GAS6-AS1和miR-324-3p表達(dá)后，GAS6-AS1、miR-324-3p mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組比較，pcDNA-GAS6-AS1+mimics NC組T98G細(xì)胞活力和侵襲數(shù)目顯著升高(P<0.05)，pcDNA-3.1(+)+miR-324-3p mimics組細(xì)胞活力和侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-324-3p mimics組比較，pcDNA-GAS6-AS1+miR-324-3p mimics組細(xì)胞活力和侵襲數(shù)目顯著升高(P<0.05)。與pcDNA-3.1(+)+mimics NC+6 Gy組比較，pcDNA-GAS6-AS1+mimics NC+6 Gy組細(xì)胞活力明顯上升，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；pcDNA-3.1(+)+miR-324-3p mimics +6 Gy組細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-324-3p mimics +6 Gy組比較，pcDNA-GAS6-AS1+miR-324-3p mimics +6 Gy組細(xì)胞活力明顯上升，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見表5～7，圖3。

表5 miR-324-3p mRNA表達(dá)

表6 4組細(xì)胞增值、侵襲能力比較

表7 4組細(xì)胞增值能力和凋亡率比較

圖3 上調(diào)LncRNA GAS6-AS1通過miR-324-3p影響T98G細(xì)胞增殖、侵襲及其放療敏感性；A Transwell實驗檢測上調(diào)LncRNA GAS6-AS1通過miR-324-3p對T98G細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色×200)；B 流式細(xì)胞儀檢測同時LncRNA GAS6-AS1和miR-324-3p表達(dá)且用6 Gy處理細(xì)胞后對T98G細(xì)胞凋亡的影響

2.4 miR-324-3p對Wnt/β-catenin信號通路的影響 與mimics NC組比較，miR-324-3p mimics組細(xì)胞內(nèi)β-catenin和CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，β-catenin/GAPDH、CyclinD1/GAPDH比值顯著降低(P<0.01)。與inhibitor NC組比較，miR-324-3p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)β-catenin和CyclinD1蛋白表達(dá)顯著升高，β-catenin/GAPDH、CyclinD1/GAPDH比值顯著升高(P<0.01)。見表8，圖4。

表8 4組細(xì)胞CyclinD1/GAPDH、β-catenin/GAPDH比較

圖4 Western blot檢測過表達(dá)及下調(diào)miR-324-3p表達(dá)對A549細(xì)胞內(nèi)CyclinD1、β-catenin表達(dá)的影響

2.5 下調(diào)miR-324-3p通過Wnt/β-catenin信號通路對T98G細(xì)胞增殖、侵襲及放療敏感性的影響 與inhibitor NC組比較，miR-324-3p inhibitor轉(zhuǎn)染T98G細(xì)胞48 h后增殖活力顯著上調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)；與miR-324-3p inhibitor組比較，miR-324-3p inhibitor+XAV939組細(xì)胞增殖活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)。用6 Gy X射線照射T98G細(xì)胞后，與inhibitor NC組比較，miR-324-3p inhibitor組細(xì)胞增殖活力顯著上調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)，與miR-153-3p inhibitor組比較，miR-153-3p inhibitor+XAV939組細(xì)胞增殖活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。見圖5，表9、10。

表9 3組細(xì)胞增值、侵襲能力比較

表10 3組細(xì)胞增值能力和凋亡率比較

3 討論

在本研究中，我們首先發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS6-AS1在膠質(zhì)瘤惡性組織中較鄰近正常組織高表達(dá)。我們的研究表明，LncRNA GAS6-AS1靶向miR-324-3p激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)了T98G細(xì)胞增殖和侵襲，降低了放療敏感性。

lncRNA具有不同的功能，包括基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制中的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后RNA剪接調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控[12]。隨著對lncRNA功能屬性的研究不斷研究，lncRNA可能在生理過程和病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用[13]。在以往的研究中，許多l(xiāng)ncRNA已被證實為腫瘤抑制基因和預(yù)后生物標(biāo)志物。例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和p53參與lncRNA meg3誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡[14]。LncRNA TNRC6C-AS1作為miR-129-5p的競爭性內(nèi)源性RNA，調(diào)節(jié)甲狀腺癌中的UNC5B，影響細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[15]。lncRNA GAS6-AS1作為一種重要的lncRNA參與各種癌癥發(fā)展，如長鏈非編碼RNA GAS6-AS1作為microRNA-585的ceRNA，從而增加EIF5A2的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞癌的致癌性[16]。lncRNA GAS6-AS1通過靶向miR-324-3p/SETD1A軸激活PI3K/AKT通路，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。然而lncRNA GAS6-AS1在膠質(zhì)瘤中的作用尚未見報道。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了lncRNA GAS6-AS1在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，而在X射線照射的T98G細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，這是之前在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域未見報道的。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA GAS6-AS1可以顯著抑制細(xì)胞增殖和侵襲，增強(qiáng)細(xì)胞的放療敏感性。這些結(jié)果表明，高表達(dá)的lncRNA GAS6-AS1促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和生長。

研究表明，lncRNA調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)展的作用機(jī)制可能會通過靶向miRNA實現(xiàn)，如LncRNA NFIA-AS2通過調(diào)節(jié)miR-655-3p/ZFX軸促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展[17]。另外還有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，lncRNA KTN1AS1通過負(fù)調(diào)控miR-505-3p促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲[18]。受上述觀點啟發(fā)，我們通過軟件預(yù)測了lncRNA GAS6-AS1的作用位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS6-AS1能夠靶向miR-324-3p。我們還發(fā)現(xiàn)，miR-324-3p在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)，而在X射線照射的T98G細(xì)胞中表達(dá)明顯上升。接下來的功能研究提示我們上調(diào)lncRNA GAS6-AS1靶向miR-324-3p可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，降低細(xì)胞的放療敏感性。據(jù)相關(guān)研究結(jié)果所知，Wnt/β-catenin信號通路在多種腫瘤中被激活，在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、生長和存活中起著至關(guān)重要的作用，膠質(zhì)瘤也是如此[19,20]。我們的研究結(jié)果揭示了下調(diào)miR-324-3p激活了Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)細(xì)胞生長的機(jī)制。但miR-324-3p調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在目前的研究中，我們證實了lncRNA GAS6-AS1在膠質(zhì)瘤組織中普遍上調(diào)，并且這種表達(dá)模式發(fā)揮了致癌作用。高表達(dá)的lncRNA GAS6-AS1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS6-AS1靶向miR-324-3p調(diào)控Wnt/ β-catenin信號通路影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和放療敏感性。這些結(jié)果表明，lncRNA GAS6-AS1在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮了重要作用，找出其機(jī)制可能是治療膠質(zhì)瘤的一種潛在的新策略。