邱實(shí) 曹佳懿 余雅靖

胃癌是全球第五大常見癌癥和第三大癌癥相關(guān)死亡原因，雖然部分患者可從手術(shù)、輔助化療中獲益，但大多數(shù)患者確診時(shí)已處于疾病晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療往往無效[1,2]。研究顯示包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)在內(nèi)的非編碼RNA在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，lncRNA通過與miRNA結(jié)合調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)廣泛參與細(xì)胞周期、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管生成等細(xì)胞過程，其表達(dá)改變與胃癌的腫瘤特征顯著相關(guān)，具有作為胃癌治療靶點(diǎn)的潛力[3,4]。有報(bào)道稱lncRNA TOPORS反義RNA 1(TOPORS-AS1)在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁非腫瘤組織[5]，但TOPORS-AS1在胃癌中的作用和調(diào)控機(jī)制并未有研究。研究報(bào)道m(xù)iR-718高表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，下調(diào)miR-718可通過抑制磷脂酰肌苷3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲[6]。miR-718還可作為FBXL19反義RNA 1(FBXL19-AS1)的直接靶點(diǎn)，介導(dǎo)干擾FBXL19-AS1對乳腺癌進(jìn)展的抑制作用[7]。生物信息學(xué)分析顯示TOPORS-AS1與miR-718存在相互作用，但TOPORS-AS1是否靶向miR-718調(diào)控胃癌進(jìn)展尚需驗(yàn)證。本研究探討了TOPORS-AS1在胃癌中的表達(dá)、生物學(xué)功能及其潛在機(jī)制，旨在為胃癌治療提供新的抗癌靶點(diǎn)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌組織:以2018年7月至2019年12月我院住院的43例胃癌患者，其中男23例，女20例；年齡45～76歲，平均年齡(61.3±7.5)歲，術(shù)中取人胃癌組織及癌旁組織(正常組織標(biāo)本)?；颊咝g(shù)前均未接受任何輔助治療。標(biāo)本立即冷凍，-80℃保存。本研究的開展獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者均簽訂知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞與試劑：人胃癌細(xì)胞系HGC-27、正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1購自美國ATCC；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；PrimerScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒、SYBR green Premix Ex Taq Ⅱ購自大連寶生物公司；熒光素酶報(bào)告載體、pcDNA-TOPORS-AS1、pcDNA、anti-miR-NC、anti-miR-718、miR-NC、miR-718 mimics購自廣州銳博生物公司；CCK-8試劑盒購自南京恩晶生物科技公司；Transwell板(24孔)美國BD公司；Annexin-FITC/碘化丙啶雙染凋亡檢測試劑盒購自上海銳賽生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HGC-27、GES-1細(xì)胞均接種在RPMI-1640培養(yǎng)基中在37℃、含5%CO2、濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加1%青鏈霉素混合液和10%胎牛血清。

1.2.2 RT-qPCR檢測TOPORS-AS1、miR-718表達(dá)：用TRIzol試劑提取胃癌組織和細(xì)胞系的總RNA，分別用PrimerScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用SYBR green Premix Ex Taq II進(jìn)行RT-qPCR。GAPDH上游引物5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’，下游引物5’-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3’；TOPORS-AS1上游引物5’-GCAAGCAGCAAGTAAGAAGCG-3’，下游引物5’-GCAAGCAGCAAGTAAGAAGCG-3’；U6上游引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；miR-718上游引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，下游引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。2-ΔΔCt法計(jì)算TOPORS-AS1、miR-718表達(dá)量。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：將HGC-27細(xì)胞接種6孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，即用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-TOPORS-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-718、pcDNA-TOPORS-AS1+miR-NC、pcDNA-TOPORS-AS1+miR-718 mimics至50%融合細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR分析。HGC-27細(xì)胞共分為pcDNA組、pcDNA-TOPORS-AS1組、anti-miR-NC組、anti-miR-718組、pcDNA-TOPORS-AS1+miR-NC組、pcDNA-TOPORS-AS1+miR-718組。

1.2.4 CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測增殖：CCK-8實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)接種在96孔板并在培養(yǎng)箱孵育48 h。每孔加入10 μl CCK-8試劑，再孵育4 h。酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度(A)。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)A/對照A)×100%克隆形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞(5×102個(gè)/孔)接種到6孔板置于培養(yǎng)箱孵育。每3天更換1次培養(yǎng)基。2周后，用甲醇固定細(xì)胞集落，用0.1%結(jié)晶紫染色。計(jì)數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.2.5 Transwell法檢測細(xì)胞遷移：取200 μl無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液接種于上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育24 h后，用棉簽去除未穿膜細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定穿膜細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色15 min。顯微鏡下計(jì)數(shù)膜上隨機(jī)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，用平均值表示細(xì)胞遷移數(shù)量。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞凋亡：用冷PBS洗滌轉(zhuǎn)染細(xì)胞2次，用500 μl的1×結(jié)合緩沖液(含5 μl Annexin-FITC和5 μl碘化丙啶)重懸，避光孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：將含有miR-718結(jié)合位點(diǎn)的TOPORS-AS1片段克隆到psiCHECK-2載體構(gòu)建野生型(WT)熒光素酶報(bào)告載體WT-TOPORS-AS1；將突變TOPORS-AS1片段克隆到psiCHECK-2載體構(gòu)建突變型(MUT)熒光素酶報(bào)告載體MUT-TOPORS-AS1。用Lipofectamine 2000將WT-TOPORS-AS1、MUT-TOPORS-AS1分別與miR-718 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染后48 h測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性，相對熒光素酶活性以二者的比值表示。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)：RIPA緩沖液裂解轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取總蛋白。測定蛋白濃度后，取等量變性蛋白用SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用5%脫脂牛奶溶液封閉膜后，用針對Cleaved-caspase3、GAPDH的的特異性抗體在4℃下孵育過夜。隨后，將膜與酶標(biāo)二抗在室溫下孵育1 h?；瘜W(xué)光光發(fā)法進(jìn)行顯色反應(yīng)，Image J軟件分析Cleaved-caspase3相對于GAPDH條帶灰度值表示其蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和細(xì)胞中TOPORS-AS1、miR-718表達(dá)的檢測 胃癌組織中TOPORS-AS1表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，miR-718表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)。HGC-27細(xì)胞TOPORS-AS1表達(dá)水平顯著低于GES-1細(xì)胞(P<0.05)，miR-718表達(dá)水平顯著高于GES-1細(xì)胞(P<0.05)。見表1。

表1 TOPORS-AS1、miR-718表達(dá)的檢測

2.2 TOPORS-AS1對HGC-27增殖、遷移、凋亡的影響 轉(zhuǎn)染pcDNA-TOPORS-AS與轉(zhuǎn)染pcDNA比較HGC-27細(xì)胞TOPORS-AS1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染pcDNA-TOPORS-AS1可促進(jìn)TOPORS-AS1表達(dá)。與pcDNA組比較，pcDNA-TOPORS-AS1組HGC-27細(xì)胞抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 TOPORS-AS1促進(jìn)HGC-27凋亡及Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)

表2 TOPORS-AS1抑制HGC-27增殖遷移促進(jìn)凋亡

2.3 TOPORS-AS1和miR-718靶向關(guān)系 DIANA Tools預(yù)測到TOPORS-AS1和miR-718存在互補(bǔ)核苷酸序列。miR-718+ WT-TOPORS-AS1組HGC-27的相對熒光素酶活性顯著低于miR-NC+WT-TOPORS-AS1組(P<0.05)；miR-718+MUT-TOPORS-AS1組HGC-27的相對熒光素酶活性與miR-NC+ MUT-TOPORS-AS1組比較無明顯變化。pcDNA-TOPORS-AS1組HGC-27細(xì)胞miR-718表達(dá)顯著低于miR-718組(P<0.05)。見圖2，表3、4。

圖2 TOPORS-AS1和miR-718互補(bǔ)序列

2.4 抑制miR-718對HGC-27增殖、遷移、凋亡的影響 轉(zhuǎn)染anti-miR-718與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC比較HGC-27細(xì)胞miR-718表達(dá)顯著降低，表明轉(zhuǎn)染anti-miR-718可抑制miR-718表達(dá)。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-718組HGC-27細(xì)胞抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。見圖3，表5。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表4 TOPORS-AS1調(diào)控miR-718的表達(dá)

圖3 抑制miR-718促進(jìn)HGC-27凋亡及Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)

表5 抑制miR-718抑制HGC-27增殖遷移促進(jìn)凋亡

2.5 過表達(dá)miR-718逆轉(zhuǎn)TOPORS-AS1過表達(dá)對HGC-27增殖、遷移、凋亡的影響 與pcDNA-TOPORS-AS1+miR-NC組比較，pcDNA-TOPORS-AS1+miR-718組HGC-27細(xì)胞miR-718表達(dá)、克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖4，表6。

圖4 miR-718逆轉(zhuǎn)TOPORS-AS1對HGC-27凋亡的促進(jìn)作用及Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用

表6 過表達(dá)miR-718和TOPORS-AS1對HGC-27增殖遷移凋亡的作用

3 討論

lncRNA在癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。研究顯示lncRNA在胃癌組織中的表達(dá)顯著改變，并參與多種腫瘤生物學(xué)過程，例如，LINC00511在胃癌中上調(diào)，并與晚期臨床特征和預(yù)后不良呈正相關(guān)[8]。lncRNA腫瘤易感基因11(CASC11)參與調(diào)控胃癌細(xì)胞周期阻滯、凋亡、遷移[9]。lncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)通過靶向miR-1277-5p和上調(diào)COL5A1表達(dá)來促進(jìn)胃癌的生長和轉(zhuǎn)移[10]。然而，筆者發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的lncRNA在胃癌中的作用并未完全闡明。本研究檢測到胃癌組織、細(xì)胞系中TOPORS-AS1表達(dá)顯著減少，提示TOPORS-AS1低表達(dá)可能有助于胃癌進(jìn)展。

已有研究證實(shí)TOPORS-AS1低表達(dá)乳腺癌患者總生存率較差，過表達(dá)TOPORS-AS1可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞侵襲行為[11]。為探討TOPORS-AS1在胃癌進(jìn)展中的作用，本研究轉(zhuǎn)染pcDNA-TOPORS-AS1至胃癌細(xì)胞HGC-27分析其功能，結(jié)果表明，過表達(dá)TOPORS-AS1可抑制細(xì)胞克隆形成和增殖能力，提高細(xì)胞凋亡率，這與乳腺癌中TOPORS-AS1的抑制作用一致。Cleaved-caspase3是凋亡執(zhí)行蛋白，具有促凋亡作用，Cleaved-caspase3水平被認(rèn)為是評估細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)[12,13]。本研究中過表達(dá)TOPORS-AS1能夠誘導(dǎo)Cleaved-caspase3表達(dá)上調(diào)，者進(jìn)一步證實(shí)過表達(dá)TOPORS-AS1的凋亡促進(jìn)功能。

miRNA是在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮功能的短鏈非編碼RNA分子，近年研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可結(jié)合特定miRNA進(jìn)而調(diào)控腫瘤進(jìn)展[14]。本研究證實(shí)miR-718是TOPORS-AS1的直接靶點(diǎn)。研究表明非小細(xì)胞肺癌中miR-718表達(dá)降低與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較差的總生存率顯著相關(guān)[15]。乳頭狀甲狀腺癌中miR-718表達(dá)降低，上調(diào)miR-718表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝和遷移[16]。肝癌中miR-718過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖率升高，lncRNA SEMA3B反義RNA 1(SEMA3B-AS1)靶向下調(diào)miR-718可抑制肝癌細(xì)胞增殖[17]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織、細(xì)胞系中miR-718表達(dá)顯著升高，抑制miR-718表達(dá)可下調(diào)Cleaved-caspase3水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，這與Liu等[6]報(bào)道m(xù)iR-718在胃癌致癌作用吻合。

過表達(dá)TOPORS-AS1后HGC-27細(xì)胞中miR-718是表達(dá)降低，且抑制miR-718表達(dá)和過表達(dá)TOPORS-AS1的抗胃癌作用一致，提示胃癌中存在潛在TOPORS-AS1/miR-718調(diào)控分子軸?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)miR-718還可減弱TOPORS-AS1過表達(dá)對HGC-27細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響，基本恢復(fù)HGC-27細(xì)胞惡性行為，這提示TOPORS-AS1在胃癌中至少通過部分調(diào)控miR-718表達(dá)發(fā)揮抑癌功能。

綜上所述，TOPORS-AS1在胃癌中呈低表達(dá)，TOPORS-AS1通過靶向負(fù)調(diào)控miR-718可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移并促進(jìn)凋亡。這些發(fā)現(xiàn)可為研究胃癌發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制提供新的視角，并可能為胃癌治療提供新的抗癌靶點(diǎn)。