張亞光，王權(quán)勝，黃子彥，陳 露，宋吉祥，林自立

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學(xué)分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科，廣西南寧 530023）

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是存在于細(xì)胞內(nèi)的一類伴侶蛋白分子［7］，在生理?xiàng)l件和應(yīng)激狀態(tài)下，HSP 可作為分子伴侶參與細(xì)胞蛋白的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)以及刪除錯(cuò)誤蛋白［8］。HSP 在男性生殖中發(fā)揮重要作用，HSP 家族中，HSP60 參與睪丸的發(fā)育和精子發(fā)生，HSP90 可調(diào)控生精細(xì)胞的分裂和精子發(fā)生并保護(hù)精子免受氧化損傷［9，10］。前期研究表明，續(xù)斷種子方可抑制生精細(xì)胞凋亡和提高生精細(xì)胞氧化損傷后的修復(fù)能力，從而提高精子質(zhì)量，促進(jìn)精子發(fā)生［11，12］，但其潛在機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究完善。因此本研究基于少弱精子癥大鼠睪丸組織中HSP60、HSP90 表達(dá)和精子質(zhì)量分析，探究續(xù)斷種子方治療少弱精子癥的部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

40 只SD 雄性大鼠，SPF 級，體重200～220 g，購買自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證［SCXK（湘）2019-0004］，本實(shí)驗(yàn)通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)取10 只作為空白對照組，其余30 只造模成功后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對照組、左卡尼汀組和續(xù)斷種子方組，每組各10 只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

環(huán)磷酰胺粉針劑（Baxter 公司，進(jìn)口藥品注冊證號(hào)：H20160467）；左卡尼汀口服液10 mL：1 g（東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H19990372）；續(xù)斷種子方顆粒藥物組成：續(xù)斷、杜仲、菟絲子、枸杞子、女貞子、骨碎補(bǔ)、牛膝、黨參、白術(shù)、懷山藥各15 g 組成（免煎中藥，由江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，藥品許可證號(hào)：1203002）。

1.3 主要試劑與儀器

HSP60 一 抗，Affinity 公 司，批 號(hào)：AF0184；HSP90 一抗，批號(hào)：Ab203126，購于美國Abcam 公司。精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)（北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司）；半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（Thermoshandon Finesse E）；石蠟包埋機(jī)（Leica EG1150H+C）；倒置相差顯微鏡（Olympus BX43）、臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendrof 5430R）。

1.4 造模及給藥

少弱精子癥模型參照參考文獻(xiàn)［13］進(jìn)行制備，除空白組外，其余大鼠均采用腹腔注射40 mg·kg-1·d-1環(huán)磷酰胺的方法造模，連續(xù)注射1 周。造模成功后，中藥組按人體等效劑量將藥物配成水溶液灌胃給藥，給予10 g 生藥量/（kg.d）續(xù)斷種子方，西藥組給予左卡尼汀口服液0.1 g·kg-1·d-1，正常組和模型組每天給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥8 周。

1.5 精液分析

末次給藥24 h 后，給予實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，迅速取出大鼠左側(cè)附睪，并除去脂肪組織和筋膜，用生理鹽水洗去血液，稱重并置于2 mL 生理鹽水的平皿中剪碎、混勻，放37 ℃恒溫水浴箱中孵育20 min，輕輕搖晃，待精子得到充分離出后，按照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室檢查手冊》標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)運(yùn)用精子計(jì)數(shù)板對精子濃度及精子活力進(jìn)行檢測。

1.6 HE 染色

取各組取大鼠睪丸組織放置于10%的中性福爾馬林中固定24 h 后，常規(guī)石蠟包埋、石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟進(jìn)行蘇木精伊紅（HE）染色后封片，光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)變化并拍照。

1.7 免疫組化檢測陽性蛋白表達(dá)

取睪丸組織石蠟包埋切片、嚴(yán)格按照試劑說明，采用通用免疫組化法進(jìn)行，封片后鏡檢。正常情況下，染色后陽性細(xì)胞HSP60 和HSP90 細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核可被染成黃色或棕黃色。應(yīng)用Image Pro Plus 軟件進(jìn)行分析陽性細(xì)胞HSP60 和HSP90免疫組化圖片，計(jì)算陽性細(xì)胞面積。

1.8 Western Blot 檢測蛋白表達(dá)

取睪丸組織于液氮中研磨粉碎，加入蛋白裂解液，并于冰水中裂解0.5 h～1 h，用超聲粉碎儀使其充分裂解，重復(fù)5 次；4 ℃12 000 r/min 離心10 min，取上清液，加蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜，放入TBST 中震蕩洗滌，加入二抗孵育1 h，用TBST 洗膜，最后在膜上滴加化學(xué)發(fā)光液，在成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光成像，應(yīng)用Image-Pro Plus 軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析。

市政工程，所有分組固定工人的組織，每個(gè)組在都有固定的施工工序，在工作方式上對重復(fù)性和銜接性有比較高的要求，這就需要在施工過程中不斷協(xié)調(diào)相關(guān)施工方案，根據(jù)實(shí)際運(yùn)行的實(shí)際情況及可能出現(xiàn)的問題和各方面的操作來進(jìn)行班組工作的銜接，必須保證工程的完整性和協(xié)調(diào)性，工作人員才能在質(zhì)量上不斷提升，在工作效率上不斷提高。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 檢驗(yàn)，應(yīng)用Graph-Pad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖繪制，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)過程中空白對照組大鼠精神活動(dòng)、飲食、體重、毛色等均正常；造模后的各組大鼠則在不同程度上表現(xiàn)出精神萎靡、飲食減少、體重下降、毛色不澤、反應(yīng)遲鈍等癥狀，在經(jīng)藥物干預(yù)1 周后，以上癥狀出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。在實(shí)驗(yàn)給藥過程中共有3 只大鼠死亡（模型對照組1 只、左卡尼汀組1 只、續(xù)斷種子方組1 只），最終剩余37 只大鼠被納入本研究。

2.2 精子質(zhì)量對比

經(jīng)檢測，與空白對照組相比，其余各組大鼠精子濃度及活動(dòng)度均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中模型對照組檢測到少量精子且活動(dòng)率低下；與模型對照組相比，左卡尼汀組和續(xù)斷種子方組精子濃度及活動(dòng)率均有明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；左卡尼汀組與續(xù)斷種子方組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠精子質(zhì)量比較（±s）Tab 1 Semen quality comparison of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠精子質(zhì)量比較（±s）Tab 1 Semen quality comparison of rats in each group（±s）

注：與空白對照組比較，ΔΔP＜0.01，與模型對照組比較，##P＜0.01。

組別空白對照組模型對照組左卡尼汀組續(xù)斷種子方組n 精子活動(dòng)率（%）61.62±3.66 15.49±2.63ΔΔ 36.45±2.52##39.50±3.74##330.09 0.000 10 9 9 9 F P精子濃度（×106 個(gè)/mL）50.35±3.14 14.10±2.97ΔΔ 34.43±2.89##36.47±3.12##235.60 0.000

2.3 各組大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)分析

光學(xué)顯微鏡下可見空白對照組大鼠睪丸曲細(xì)小管呈圓形或卵圓形，分布規(guī)則，無萎縮、退化，生精上皮較厚，生精細(xì)胞層次豐富，排列整齊、致密，管腔內(nèi)可見大量精子。模型對照組大鼠曲細(xì)小管明顯萎縮退化且排列不規(guī)則，生精上皮呈大量空泡狀，支持細(xì)胞變性，間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎性浸潤明顯，間質(zhì)細(xì)胞增生，上皮細(xì)胞散在排列，大量脫落變性，精子少見。與模型對照組相比，左卡尼汀組和續(xù)斷種子方組以上病變得到明顯改善，生精小管結(jié)構(gòu)相對規(guī)整，排列有序，較模型對照組致密，支持細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞明顯增多，生精上皮較模型組增厚，層次豐富，管腔內(nèi)可見大量精子。見圖1。

圖1 光鏡下各組大鼠睪丸組織HE 染色切片（HE 染色，200×）Fig 1 Pathological results of testis in each group（HE，200×）

2.4 各組大鼠免疫組化法檢測分析

染色后陽性細(xì)胞HSP60 和HSP90 細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核可被染成黃色或棕黃色，相對于空白對照組，模型對照組HSP60 和HSP90 表達(dá)明顯降低（圖2B、圖3B）；左卡尼汀組和續(xù)斷種子方組經(jīng)藥物干預(yù)后相對于模型對照組HSP60 和HSP90 表達(dá)得到明顯提高（圖2C、圖2D；圖3C、圖3D）。

圖2 免疫組化檢測各組大鼠睪丸HSP60 的表達(dá)（免疫組化，200×）Fig 2 Expression of HSP60 in testis of rats in each group（IHC，200×）

圖3 免疫組化檢測各組大鼠睪丸HSP90 的表達(dá)（免疫組化，200×）Fig 3 Expression of HSP90 in testis of rats in each group（IHC，200×）

2.5 各組大鼠Western Blot 檢測分析

與空白對照組相比，模型對照組HSP60 和HSP90 在睪丸組織中的表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與模型對照組相比左卡尼汀組和續(xù)斷種子方組HSP60 和HSP90 在睪丸組織中的表達(dá)均有明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），左卡尼汀組和續(xù)斷種子方組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），（表2、圖4）。

表2 各組大鼠睪丸組織HSP90 和HSP90 的表達(dá)（±s）Tab 2 Expression of HSP90 and HSP90 in testicular tissue of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠睪丸組織HSP90 和HSP90 的表達(dá)（±s）Tab 2 Expression of HSP90 and HSP90 in testicular tissue of rats in each group（±s）

注：與空白對照組比較，ΔΔP＜0.01，與模型對照組比較，##P＜0.01。

HSP90 相對表達(dá)量1.06±0.05 0.59±0.08ΔΔ 0.85±0.05##0.87±0.06##86.58 0.000組別n空白對照組模型對照組左卡尼汀組續(xù)斷種子方組10 9 9 9 FP HSP60 相對表達(dá)量0.73±0.05 0.53±0.02ΔΔ 0.82±0.02##0.88±0.07##83.25 0.000

圖4 Western Blot 檢測HSP60 和HSP90 在睪丸組織中的表達(dá)Fig 4 Expression of HSP60 and HSP90 in testis（Western Blot）

3 討論

少弱精子癥是導(dǎo)致男性不育癥的主要原因，以精子數(shù)量減少和精子活力減弱為主要臨床表現(xiàn)。導(dǎo)致少弱精子癥的常見病因有男性生殖系感染、內(nèi)分泌因素、精索靜脈曲張、隱睪癥等等［14］。臨床上西醫(yī)主要針對病因治療少弱精子癥，多以雌激素受體拮抗劑、左旋肉堿、抗氧化劑等為主，但是療效不確切以及在治療過程中存在諸多不良反應(yīng)，在臨床應(yīng)用中常具有局限性［15，16］。中醫(yī)無少弱精子癥病名，根據(jù)其臨床癥狀表現(xiàn)一般認(rèn)為屬精少、精薄、無子等范疇，中醫(yī)藥在治療的過程中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，而且具有費(fèi)用低廉、副作用少等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方改善精子質(zhì)量的效果優(yōu)于化學(xué)藥物［17］。

中醫(yī)認(rèn)為少弱精子癥與肝、脾、腎三臟密切相關(guān)，主要以腎虛為主，另外兼有肝郁、脾虛、血瘀、濕熱等，因此在治療的過程中在補(bǔ)腎的同時(shí)兼顧疏肝、健脾、活血、祛濕等［18］。本課題組在臨床及科研的過程中治療應(yīng)用以通為用、和營生精的續(xù)斷種子方，在臨床治療中也確已取得了較好療效［19，20］。“續(xù)斷種子方”源于明代醫(yī)家岳甫嘉所著《醫(yī)學(xué)正印》。方中續(xù)斷、人參兩者合用具有補(bǔ)腎健脾、補(bǔ)血生精；菟絲子、枸杞子、女貞子合用可補(bǔ)肝腎、益精血；牛膝、杜仲、骨碎補(bǔ)、紅藤補(bǔ)腎生精、活血通絡(luò)?，F(xiàn)代藥理研究，續(xù)斷具有抗氧化作用［21］；淫羊藿中的淫羊藿苷可增加生精小管厚度和精子數(shù)量，淫羊藿生物堿可提升動(dòng)物性欲且明顯增加精子活力和活率［22］；杜仲、牛膝可抑制大鼠睪丸的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等，進(jìn)而改善精子質(zhì)量［23，24］。菟絲子和枸杞子都具有改善生殖功能的作用［25］，枸杞子中的枸杞子多糖可顯著修復(fù)受損的生精細(xì)胞，菟絲子含有的菟絲子黃酮可以促進(jìn)下丘腦-垂體性腺軸功能、抑制生精上皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)具有抗氧化損傷作用［26-28］。諸藥合用，共奏益腎健脾、活血生精通絡(luò)之功效。

HSP60 是一種高度保守伴侶蛋白，具有促凋亡和抗凋亡的雙向調(diào)節(jié)作用［29］。在精原細(xì)胞有絲分裂的過程中HSP60 的表達(dá)量明顯上調(diào)，這也顯示精原細(xì)胞有絲分裂活性與HSP60 表達(dá)量呈現(xiàn)相關(guān)性，同時(shí)，相關(guān)研究也表明睪丸中HSP60 表達(dá)水平越低，生精能力相應(yīng)越差［30-32］。HSP90 在細(xì)胞中含量豐富，占細(xì)胞蛋白總含量的1%～2%，參與精子的發(fā)生和獲能，相關(guān)研究顯示HSP90 缺失可造成精子減數(shù)分裂停滯和睪丸萎縮［33-36］。本研究結(jié)果顯示模型大鼠在經(jīng)過藥物干預(yù)后，HE 染色結(jié)果可見，與空白對照組相比，模型組對照組大鼠曲細(xì)小管明顯萎縮退化且排列不規(guī)則，生精上皮呈大量空泡狀，支持細(xì)胞變性，間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎性浸潤明顯，間質(zhì)細(xì)胞增生，上皮細(xì)胞散在排列，大量脫落變性，精子少見。續(xù)斷種子方干預(yù)后以上病變得到明顯改善，生精小管結(jié)構(gòu)相對規(guī)整，排列有序，較模型組致密，支持細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞明顯增多，生精上皮較模型組增厚，層次豐富，管腔內(nèi)可見大量精子。免疫組化和Western Blot 檢測顯示，模型大鼠經(jīng)續(xù)斷種子方干預(yù)后HSP60、HSP90 表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）。精子質(zhì)量檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型對照組精子濃度和活動(dòng)率明顯降低（P＜0.01）。經(jīng)續(xù)斷種子方干預(yù)后，模型大鼠精子濃度及活動(dòng)率均有明顯提高（P＜0.01）。

綜上所述，續(xù)斷種子方促進(jìn)少弱精子癥模型大鼠精子發(fā)生的機(jī)制可能是通過上調(diào)HSP60 和HSP90 的表達(dá)量，從而抑制生精細(xì)胞的凋亡、改善精子發(fā)生微環(huán)境和精子質(zhì)量，相關(guān)潛在機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張亞光：指標(biāo)檢測、分析數(shù)據(jù)、撰寫論文；黃子彥：建立模型、指標(biāo)檢測；陳露：建立模型、指標(biāo)檢測；宋吉祥：建立模型、取材；林自立：建立模型、取材；王權(quán)勝：研究總負(fù)責(zé)人、指導(dǎo)老師。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。