金麗霞，張曉東，潘 超，欒仲秋，宋淑娟，尹麗穎，王文凱

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150006）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者最重要且最多見的合并癥，數(shù)據(jù)顯示45%左右的1 型糖尿病、30%左右的2 型糖尿病患者會出現(xiàn)糖尿病腎病［1］，被稱為是導(dǎo)致慢性腎臟病和終末期腎病的主要原因［2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其發(fā)病機(jī)理的研究仍不明確，除了包括糖脂代謝紊亂、血流動力學(xué)因素，遺傳背景、免疫炎癥反應(yīng)等多方面因素外，糖尿病病人體內(nèi)氧化應(yīng)激水平明顯增高已被大量研究證明，具有豐富血管系統(tǒng)的腎臟，最容易受到氧化應(yīng)激的損傷，是氧化應(yīng)激的靶器官之一。氧化應(yīng)激可直接損害足細(xì)胞、系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，或間接地激活其他致病途徑造成傷害，進(jìn)而促進(jìn)DN 的發(fā) 生 和 發(fā) 展［3，4］。DN 主 要 病 理 特 征 是 以 腎 小 球 肥大、硬化，腎小管損傷、纖維化形成為主［5］。已有研究［6］表明機(jī)體內(nèi)存在一套復(fù)雜的系統(tǒng)可以抵抗氧化應(yīng)激損害，核因子E2 相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件（Nrf2-ARE）是其中最重要的一條信號通路。當(dāng)人體受到氧化應(yīng)激刺激時，會產(chǎn)生一系列保護(hù)性蛋白保護(hù)細(xì)胞。在正常狀態(tài)下，細(xì)胞溶質(zhì)阻遏物Kelch樣ECH 相關(guān)蛋白1（Keap1）將Nrf2 保留在細(xì)胞質(zhì)中并促進(jìn)其泛素化，與活性氧（ROS）形成動態(tài)平衡［7］。在高糖狀態(tài)下，由于ROS 生成過多會引起氧化應(yīng)激反應(yīng)［8］，Nrf2 脫離Keap1 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，與Maf 蛋白構(gòu)成異二聚體，與其靶基因的啟動子區(qū)域中的ARE 結(jié)合，編碼其下游的抗氧化劑、第二解毒酶和相關(guān)蛋白的基因，包括超氧化物歧化酶（SOD）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS），從而提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2-ARE 信號通路可減輕糖尿病小鼠腎小球氧化應(yīng)激損傷，延緩腎纖維化，起到腎保護(hù)的作用［9-13］。但中藥復(fù)方對調(diào)控該通路防治糖尿病腎病的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱街饕S芪、酒蒸大黃、菟絲子、貓須草、丹參、積雪草、生牡蠣、淫羊藿、蒲公英等中藥，是臨床多年應(yīng)用總結(jié)的經(jīng)驗方，可有效減少DN 患者蛋白尿，改善腎功能。本課題組前期研究［14］發(fā)現(xiàn)芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱娇筛深A(yù)Nrf2 及下游相關(guān)蛋白血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)以減輕氧化應(yīng)激的損傷。γ-GCS 和SOD 同樣作為Nrf2 下游非常重要的抗氧化蛋白，推測芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱娇梢哉{(diào)控Nrf2 及其下游蛋白γ-GCS 和SOD，改善DN 氧化應(yīng)激狀態(tài)，具有成為臨床治療相關(guān)疾病新靶點(diǎn)的潛能。本研究旨在為早期臨床干預(yù)治療DN 提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞、動物和試劑

人腎小球系膜細(xì)胞（HMC，上海富衡生物科技有限公司），Wistar 大鼠（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心SYXK（黑）2013-010）。厄貝沙坦（安博維，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司批號H20040494，）。芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱接珊邶埥嗅t(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備。SOD1（Wanleibio，中國，貨號WL01846），γ-GCS（Wanleibio，中國，貨號DF8550），生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG（Beyotime，中國，貨號A0277），DAB 顯色液（Solarbio，中國，貨號DA1010），蘇木精（Solarbio，中國，貨號H8070），山羊血清（Solarbio，中國，貨號SL038），辣根酶標(biāo)記鏈酶親合素（Beyotime，中國，貨號A0303）。

1.2 制備血清

60 只Wistar 大 鼠，喂 養(yǎng)1 周 后，隨 機(jī) 分 為4 組，即：對照組、高糖組、厄貝沙坦組、芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M。厄貝沙坦組、芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M分別給予厄貝沙坦（按照13.5 mg·kg-1·d-1配制1.35 mg/mL 的厄貝沙坦）、芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱剑?.324 g·kg-1·d-1）灌胃。對照組、高糖組則給予等體積的生理鹽水灌胃。所有大鼠每日灌胃1 次，連續(xù)7 d，于末次灌胃2 h 麻醉，經(jīng)腹主動脈采血，滅活補(bǔ)體，過濾、滅菌，分裝后保存在-80 ℃以便后用。

1.3 HMC 培養(yǎng)與分組

4～5 代HMC 細(xì)胞株分別用含10% FBS、不含F(xiàn)BS 的RPMI1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下，傳代24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分成4 等份：對照組、高糖組、厄貝沙坦組、芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M。對照組在含10% 正常大鼠血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖組在含10% 正常大鼠血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，厄貝沙坦組與芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M在含10%對應(yīng)藥物的含藥大鼠血清的高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L 葡萄糖）中培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h，用于實驗后細(xì)胞生成蛋白提取及指標(biāo)檢測。

1.4 Real-time PCR 定量分析的方法檢測各組細(xì)胞Nrf2、γ-GCS 與SOD 的mRNA 表達(dá)

提取各組HMC 中總RNA 后，遵照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并在PCR 儀器上擴(kuò)增。添加試劑，放入熒光定量PCR 儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，收集熒光定量數(shù)據(jù)并分析，以ACTIN 為內(nèi)參照。引物序列設(shè)計見（表1、2）。

表1 目的基因引物序列Tab 1 primer sequence of target genes

表2 總引物序列Tab 2 Total primer sequences

1.5 Western blot 測定各組系膜細(xì)胞中γ-GCS、SOD 蛋白的表達(dá)

提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，將蛋白提取物放入PBS 緩沖液，按1∶19 混勻制備成蛋白質(zhì)待測液。BCA 反應(yīng)：將A 液∶B 液體積比50∶1 配制好，加入各孔中，充分混勻后，放于37 ℃環(huán)境下，反應(yīng)20 min，溶液由綠色變?yōu)樽仙?。掃描膠片，用Gel-Pro-Analyzer 軟件分析光密度值。

1.6 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測γ-GCS、SOD 的表達(dá)

0.1% TritonX-100 孵育，3%過氧化氫孵育，血清封閉，一抗孵育，二抗孵育，辣根酶標(biāo)記，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，鏡檢。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR 定量分析的方法檢測各組系膜細(xì)胞Nrf2、γ-GCS、SOD 的mRNA 表達(dá)水平

實時定量PCR 結(jié)果顯示：各組HMC 培養(yǎng)48 h后，對照組中Nrf2、γ-GCS、SOD的mRNA 有一定的表達(dá)，與對照組相比，高糖組48 h 可見細(xì)胞內(nèi)Nrf2、γ-GCS、SODmRNA 表達(dá)減少（P＜0.05）；與高糖組比較，厄貝沙坦組與芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M細(xì)胞中Nrf2、γ-GCS、SODmRNA 的 表 達(dá) 上 調(diào)（P＜0.05），且以芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M增多更明顯（P＜0.05）（表3，圖1）。

圖1 各組HMC 48 h 末Nrf2、γ-GCS、SOD mRNA 表達(dá)相對值比較Fig 1 Comparison of relative values of Nrf2，γ-GCS and SOD mRNA expression after 48 h of HMC culture among different groups

表3 各組HMC 48 h 末Nrf2、γ-GCS、SOD mRNA 表達(dá)相對值比較（±s，n=8）Tab 3 Comparison of relative values of Nrf2，γ-GCS and SOD mRNA expression after 48 h of HMC culture among different groups（±s，n=8）

表3 各組HMC 48 h 末Nrf2、γ-GCS、SOD mRNA 表達(dá)相對值比較（±s，n=8）Tab 3 Comparison of relative values of Nrf2，γ-GCS and SOD mRNA expression after 48 h of HMC culture among different groups（±s，n=8）

注：與對照組相比，#P＜0.05；與高糖組相比，*P＜0.05。

組別對照組高糖組厄貝沙坦組芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇MSOD 0.99±0.06 0.60±0.04#1.37±0.09*2.42±0.20*344.401 0.000 F P Nrf2 0.99±0.08 0.52±0.05#2.55±0.21*3.51±0.31*394.166 0.000 γ-GCS 0.97±0.10 0.48±0.04#1.63±0.15*2.73±0.25*300.249 0.000

2.2 Western blot 測定各組系膜細(xì)胞中γ-GCS、SOD 蛋白的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示：各組HMC 培養(yǎng)48 h后，高糖組與對照組相比γ-GCS、SOD 相對表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）；厄貝沙坦與芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱礁深A(yù)后，與高糖組比較，厄貝沙坦組與芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M表達(dá)均有所增高（P＜0.05），表明γ-GCS、SOD蛋白表達(dá)上調(diào)。且以芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M上調(diào)最明顯（P＜0.05）（圖2、3，表4）。

表4 各組HMC 48 h末γ-GCS、SOD 蛋白的表達(dá)相對值比較（n=8，±s）Tab 4 The relative values of γ-GCS and SOD protein expressions of HMC in each group at 48 h（n=8，±s）

表4 各組HMC 48 h末γ-GCS、SOD 蛋白的表達(dá)相對值比較（n=8，±s）Tab 4 The relative values of γ-GCS and SOD protein expressions of HMC in each group at 48 h（n=8，±s）

注：與對照組相比，#P＜0.05；與高糖組相比,*P＜0.05。

組別γ-GCS/β-actin SOD/β-actin對照組0.26±0.02 0.40±0.04高糖組0.17±0.02#0.20±0.01#厄貝沙坦組0.41±0.03*0.75±0.05*芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M0.65±0.06*1.10±0.13*F P 249.450 258.476 0.000 0.000

圖2 Western blot 測定48 h 末各組HMC 中γ-GCS、SOD蛋白的表達(dá)Fig 2 The expressions of γ-GCS and SOD proteins in HMC of all groups at the end of 48 h were determined by Western blot

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測γ-GCS、SOD 的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示：各組HMC 培養(yǎng)48 h 后，高糖組與對照組相比γ-GCS、SOD 表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）；厄貝沙坦與芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱礁深A(yù)后，與高糖組比較，厄貝沙坦組與芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M表達(dá)均有所增高（P＜0.05），表明γ-GCS、SOD 表達(dá)上調(diào)。且以芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M上調(diào)最明顯（P＜0.05）（圖4）。

圖4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測48 h 末各組HMC γ-GCS、SOD 表達(dá)結(jié)果Fig 4 The expression levels of HMC γ-GCS and SOD at 48 h by immunohistochemistry

圖3 各組HMC 48 h 末γ-GCS、SOD 蛋白的表達(dá)Fig 3 The expressions of γ-GCS and SOD proteins in HMC of all groups at 48 h

3 討論

糖尿病腎病是臨床常見病，癥狀比較隱匿，早期可表現(xiàn)為尿白蛋白排泄率升高，癥狀不典型，容易被忽視，如早期未發(fā)現(xiàn)，未得到有效控制病情會迅速進(jìn)展，一旦出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿，將不可避免地進(jìn)展為終末期腎?。?5］。雖然糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中還沒有明確的認(rèn)識，但是近年來很多相關(guān)研究表明，在DN 發(fā)生、發(fā)展的過程中，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)起著十分重要的作用［4］。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡狀態(tài)［16］。正常生理情況下，體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡。糖尿病狀態(tài)下，ROS 過量產(chǎn)生，機(jī)體抗氧化能力下降［17］，氧化應(yīng)激不僅直接攻擊DNA、對蛋白質(zhì)或脂質(zhì)進(jìn)行氧化修飾還可以激活各信號通路破壞腎組織清除自由基的能力［18］，使腎組織的形態(tài)和功能發(fā)生改變，最終形成小管間質(zhì)纖維化和蛋白尿［3］，繼而發(fā)展為DN。人機(jī)體內(nèi)存在著一套防御機(jī)制應(yīng)對自由基和毒物質(zhì)的損害，其原理是一套復(fù)雜的抗氧化應(yīng)答機(jī)制。這套抗氧化應(yīng)答機(jī)制中最重要的一條通路是Nrf2-ARE，其抗氧化應(yīng)激、保護(hù)腎功能的作用已被大量實驗研究證明。ARE 作為細(xì)胞保護(hù)蛋白基因上的啟動子結(jié)合序列，可以被轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 激活，該過程在生理狀態(tài)下相對穩(wěn)定，應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核識別并與ARE 結(jié)合，形成Nrf2-ARE 通路，進(jìn)一步產(chǎn)生SOD、γ-GCS 等抗氧化蛋白發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激作用，改善腎臟病理學(xué)的改變和糖脂代謝紊亂，同時可抑制ROS 蓄積導(dǎo)致 的 腎 臟 炎 癥 反 應(yīng)［19，20］。SOD 是 體 內(nèi) 主 要 的 抗 氧化酶，也是評估氧化應(yīng)激的一個重要指標(biāo)。SOD 可通過促使超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，阻斷其損傷腎細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)，發(fā)揮抗氧化作用［21］。γ-GCS是體內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）合成的一種限速酶，在Nrf2-ARE 通路眾多的下游蛋白中最受關(guān)注，其含量與活性直接決定GSH 合成速度與數(shù)量，GSH數(shù)量的增加可使機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力進(jìn)一步增強(qiáng)［22］。所以調(diào)控Nrf2-ARE 信號通路，促進(jìn)SOD、γ-GCS 的轉(zhuǎn)錄應(yīng)對氧化應(yīng)激，可能成為治療DN 的新靶點(diǎn)。

在本研究中，通過觀察高糖培養(yǎng)下人腎小球系膜細(xì)胞Nrf2-ARE 信號通路的Nrf2 及其下游抗氧化蛋白γ-GCS、SOD mRNA、蛋白的表達(dá)程度，以完善芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱綔p輕氧化應(yīng)激，防治糖尿病腎病進(jìn)展的分子機(jī)制。本研究結(jié)果顯示：Western blot 及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示正常大鼠血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞的γ-GCS、SOD 少量表達(dá)。加入高糖刺激后其表達(dá)減少明顯，加入厄貝沙坦及芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱剿幬镅搴罂刹煌潭鹊脑黾应?GCS、SOD 的表達(dá)。Real-time PCR 結(jié)果顯示：厄貝沙坦及芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱溅?GCS、SODmRNA 的表達(dá)相對高糖組可有不同程度的提高。無論從基因?qū)用孢€是蛋白層面，藥物干預(yù)后，SOD 及γ-GCS 的表達(dá)增高，且以芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱浇M明顯。

綜上所述，氧化應(yīng)激反應(yīng)可促進(jìn)DN 發(fā)生、發(fā)展，芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱娇烧{(diào)節(jié)高糖培養(yǎng)下HMC 中Nrf2、γ-GCS 及SOD mRNA 及蛋白的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷。因此我們推測芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱娇筛深A(yù)Nrf2-ARE 信號通路，促進(jìn)抗氧化蛋白的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而保護(hù)腎臟，延緩DN 進(jìn)展。為芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱脚R床應(yīng)用，早期干預(yù)DN，提供實驗依據(jù)。

糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，本實驗初步探討了中藥復(fù)方干預(yù)Nrf2-ARE 信號通路及其相關(guān)蛋白抗氧化應(yīng)激的機(jī)制，接下來將進(jìn)一步深入研究糖尿病腎病及其相關(guān)信號通路，并用中藥復(fù)方進(jìn)行干預(yù)。為中藥防治糖尿病腎病提供更多的理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

金麗霞、王文凱：全程參與、指導(dǎo)實驗操作并撰寫論文；張曉東、潘超：飼養(yǎng)動物，檢測實驗相關(guān)指標(biāo)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，參與論文撰寫；欒仲秋、宋淑娟、尹麗穎：進(jìn)行免疫組化、Western Blot、Real-time PCR 法檢測相關(guān)指標(biāo)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。