劉麗穎，黃舉凱，李高彪，張 力，楊曉暉

（1. 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；2. 中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091；3. 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院科研處，北京 100078）

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）與糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）關(guān)聯(lián)密切，可由血糖持續(xù)升高、胰島素抵抗造成心臟功能和結(jié)構(gòu)的異常改變導致。大量研究結(jié)果顯示由DCM 導致的死亡約占DM 并發(fā)癥造成死亡的65%～80%［1］，隨著全世界DM 患者數(shù)量的持續(xù)攀升，造成DCM 的發(fā)病率不斷升高，DCM 的防治措施得以有效實施［2］。

DCM 的西醫(yī)治療措施主要有擴張血管及抗炎、改善代謝異常等，副作用較多，治療效果欠佳，而中醫(yī)藥治療可通過辨證施治，從而有效地削減胰島素抵抗、調(diào)整糖脂代謝、緩解氧化應(yīng)激、抑制心肌細胞的異常凋亡及降低心肌纖維化。楊曉暉教授是國醫(yī)大師呂仁和教授的學術(shù)繼承人，傳承呂師集眾家之長提出的DM 并發(fā)癥“微型癥瘕”的病機理念，同時融合多年診治DM 的豐富經(jīng)驗，分析總結(jié)創(chuàng)立了DCM“心絡(luò)微型癥瘕”的病變核心思想。認為心氣虛衰是本病在氣血陰陽失調(diào)基礎(chǔ)上出現(xiàn)的初步病變，進而出現(xiàn)氣滯血瘀等病變，久病入絡(luò)，心之絡(luò)脈痹阻。初聚于氣，聚散無常，成無形之“瘕”，久積在血，積而不散，痹阻于絡(luò)脈，成有形之“癥”，導致心絡(luò)微型癥瘕，癥瘕形成的關(guān)鍵因素為正氣虧虛，瘀血內(nèi)結(jié)于心之絡(luò)脈為其病理基礎(chǔ)，正如《景岳全書》所言“壯人無積，虛人則有之”。楊師根據(jù)以上論述及臨床實踐創(chuàng)立益消方，黃芪、夏枯草為本方之主藥，善用黃芪“益氣養(yǎng)心”，夏枯草祛瘀散結(jié)，善消癥瘕積聚。黃芪、夏枯草兩者相配，可補而不滯，祛瘀不傷正，延緩本病的進展和加重。有研究結(jié)果顯示對于鏈脲佐菌素誘導的DCM 大鼠，黃芪-夏枯草藥對既能明顯改善糖脂代謝紊亂，降低心肌壞死程度、抑制成纖維細胞浸潤、延緩心肌細胞肥大及減緩心肌內(nèi)微血管基底膜的增厚，也能改善心臟植物神經(jīng)功能狀態(tài)，增強心肌組織中有氧和無氧代謝酶活性［3-6］。但該藥對的化學成分較復雜，治療DCM 的作用靶點及其機制尚未完全明確。

本研究應(yīng)用生物信息學聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學，運用多個數(shù)據(jù)分析軟件和數(shù)據(jù)庫，分析整合中藥的相應(yīng)作用靶點及化學成分等信息，構(gòu)架了“成分-疾病-靶點”的分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，系統(tǒng)闡述其作用機制。其研究方法結(jié)合了中藥的多成分、多靶點、多通路等特點，與中醫(yī)整體觀、系統(tǒng)觀的醫(yī)療理念相符［7，8］。課題組運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的“成分-靶點-疾病”的理論，充分探究了黃芪-夏枯草治療DCM 的作用靶點及機制。利用分子對接研究進一步探究黃芪-夏枯草藥對發(fā)揮其治療DCM 的作用機制，并輔以體外實驗，為其在DCM 中的臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 黃芪-夏枯草的活性成分的篩選

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺 TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），檢索黃芪和夏枯草的所有化學成分，依據(jù)口服生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18 的篩選條件，篩選出黃芪和夏枯草的相關(guān)活性成分［9］。

1.2 糖尿病心肌病靶點的查找

以“diabetic cardiomyopathy”和“diabetic heart disease”為搜索關(guān)鍵詞，在GeneCards、OMIM、PharmGkb、DrugBank 數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲取糖尿病心肌病相關(guān)的疾病靶點。

1.3 藥物靶點-疾病相關(guān)基因取交集

使用PERL 軟件讀取藥物靶基因和疾病基因，提取基因名稱，繪制Venn 圖，獲得藥物與疾病的交集基因。 查找藥物成分和靶基因的對應(yīng)關(guān)系。

1.4 “成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape 3. 8. 0［10］軟件及JAVA 軟件，構(gòu)建“成分-疾病-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network Analyzer 功能對黃芪-夏枯草藥對的主要活性成分進行分析。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的建立

將共同靶點上傳到 STRING database（https：//www.string-db.org/）以構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。將蛋白質(zhì)種類設(shè)置為智人，置信水平設(shè)置為“最高置信度（0.900）”，同時將網(wǎng)絡(luò)中的孤立蛋白隱藏，以獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。將PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 3.7.2 軟件，用于構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)拓撲分析操作，篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點。核心靶點篩選參數(shù)：節(jié)度中心性（degree centrality ，DC），介度中心 性（betweenness centrality，BC），緊 密 中 心 性（closeness centrality，CC）。篩選條件：應(yīng)用R 軟件在線程序包，計算出交集基因的DC、BC、CC 數(shù)值，各組數(shù)值中大于本組中位值的基因予以保留，運行兩次R 腳本，篩選關(guān)鍵靶點。

1.6 GO 和KEGG 分 析

運 用David6.8 數(shù) 據(jù) 庫（https：//david.ncifcrf.gov/），分別進行基因本體論（GO）功能富集及KEGG 途徑富集分析，從而獲得GO 及KEGG 富集結(jié)果，其中GO 分析包括生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）。運用Clusters Profiler R 軟件包對黃芪-夏枯草作用于DCM 的潛在靶點進行GO 分析和KEGG 分析。統(tǒng)計顯著性閾值設(shè)置為P＜0.05。

1.7 成分-靶點分子對接驗證

從PDB（http：//www.rcsb.org/）下載關(guān)鍵靶點的3D 結(jié)構(gòu)，通過Chembio Office 軟件將核心成分處理為mol2 格式文件，并進行氫化、脫水和配體分離等操作。利用Autodock Vina 1.1.2 軟件，對關(guān)鍵靶點與核心成分進行分子對接［11，12］。獲得每個關(guān)鍵靶點與核心成分的結(jié)合能，結(jié)合能負值越低則化合物越能與靶點更好地結(jié)合，產(chǎn)生穩(wěn)定的構(gòu)象。將具有最佳親和力的構(gòu)象作為最終的對接構(gòu)象，并應(yīng)用PyMOL2.3 軟件將結(jié)果進行可視化。

1.8 H9c2 心肌細胞體外實驗

1.8.1 動物 成年SPF 級SD 雄性大鼠6 只，體重200～250 g，購自購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2019-0010］。動物飼養(yǎng)環(huán)境：北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院SPF 級動物房，室溫24 ℃，相對濕度（60±5）%，12 h 白夜交替，自由飲水進食。

1.8.2 黃芪-夏枯草含藥血清 大鼠灌胃黃芪-夏枯草溶液（6.0 g/kg），每天1 次，連續(xù)7 d，第7 天灌胃1 h 后，眼眶取血。3 000 r/min 離心10 min，然后分離血 清，將 血 清 放 入56 °C 水 浴 中 滅 活30 min，使 用0.22 mm 濾鏡過濾除菌，-20 °C 保存使用。本實驗符合北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院動物倫理學要求，動物實驗倫理審查批準編號為2021205。

1.8.3 細胞培養(yǎng)及分組 大鼠H9c2 心肌細胞，由萬類生物科技公司提供。將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的低糖DMEM 培養(yǎng)基（含5.5 mmol/L 葡萄糖）中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當融合度達到70%～80%時，用含0.25%乙二胺四乙酸的胰酶消化并進行傳代培養(yǎng)，最后取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

將細胞分為5 組：正常組：低糖（5.5 mmol/L）培養(yǎng)；模型組：高糖（33 mmol/L）培養(yǎng)；5%血清組：高糖+5%黃芪-夏枯草藥對血清培養(yǎng)；10%血清組：高糖+10%黃芪-夏枯草藥對血清培養(yǎng)；15%血清組：HG 高糖+15%黃芪-夏枯草藥對血清培養(yǎng)。

1.8.4 MTT 法檢測H9c2 心肌細胞存活率 選擇對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化后重懸細胞，開始進行細胞計數(shù)，將96 孔板每孔加入100 μL 約2 000個細胞。按實驗需求處理每組細胞，在細胞貼壁生長48 h 后，每孔重新?lián)Q培養(yǎng)基100 μL 后加入10 μL MTT 溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。之后每孔再加入150 μL DMSO，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育15 min 左右，直至發(fā)現(xiàn)藍紫色結(jié)晶物在顯微鏡下全部溶解后，酶標儀490 nm 波長處測定吸光度。

1.8.5 Western blot 法檢測相關(guān)蛋白表達 各組H9c2 心肌細胞中的蛋白提取，依據(jù)RIPA 裂解緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，上海中國）的說明進行，應(yīng)用BCA 蛋白檢測試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，上海中國）進行定量。使用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)（40 μg/泳道）并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。使用5%脫脂牛奶在TBST 緩沖液中于室溫下封閉2 h。將膜與以下蛋白質(zhì)特異的一抗：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT）1、p-AKT1、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK）14、p-MAPK14、β-actin，在4 ℃下孵育過夜，并用TBST 洗滌3 次，每次10 min。然后加入二抗，孵育膜1 h。用TBST洗膜3 次，每次10 min。分別使用增強化學發(fā)光系統(tǒng)和Image Pro-Plus 對蛋白質(zhì)條帶進行成像和量化。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料應(yīng)用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間計量資料比較應(yīng)用單因素ANOVA 檢驗分析，若方差齊則采用LSD 法，若方差不齊則采用鄧尼特T3 法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-夏枯草潛在活性成分及靶點的獲取

TCMSP 數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示黃芪的活性成分為20種，夏枯草的活性成分為11 種，主要活性成分見表1。黃芪的活性成分異黃酮，分子編號MOL000398，具有較高的OB 值（109.99%）。共得到藥物靶點839個，剔除重復靶點后，獲得藥物作用靶點210 個。

表1 黃芪-夏枯草藥對活性成分信息Tab 1 Main active components of Astragalus-prunella

2.2 疾病作用靶點篩選

基于GeneCards 獲得3 632 個相關(guān)基因，基于OMIM 篩選獲得304 個相關(guān)基因，基于PharmGkb獲得76 個相關(guān)基因，基于DrugBank 獲得94 個相關(guān)基因。去重后共獲得疾病相關(guān)基因3 739 個。利用韋恩軟件，將3 739 個疾病相關(guān)靶點與黃芪-夏枯草活性成分預測的210 個靶點相交，得到157 個交集靶點，可知它們可能為黃芪-夏枯草藥對治療DCM的潛在關(guān)鍵靶點，見圖1、2。

圖1 疾病數(shù)據(jù)庫交集靶點關(guān)系圖Fig 1 Intersection target diagram of disease database

圖2 黃芪-夏枯草藥對和疾病靶點韋恩圖Fig 2 Astragalus-prunella vulgaris and disease targets venn

2.3 成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建黃芪-夏枯草藥對與DCM 互作網(wǎng)絡(luò)，圖3 共包括178 個節(jié)點，530 條邊。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的主要核心指標為度中心性DC 參數(shù)，其值越大，表明節(jié)點越接近網(wǎng)絡(luò)中心［13］。黃芪-夏枯草中Degree 值排名前四的成分依次為木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、毛蕊異黃酮（calycosin）、山柰酚（kaempferol）。

圖3 黃芪-夏枯草活性成分-DCM 交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Astragalus-prunella vulgaris active ingredient-DCM intersection targets network

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

PPI 網(wǎng)絡(luò)中總共包括132 個節(jié)點和564 條線，這表明157 個靶點共產(chǎn)生564 條相互作用聯(lián)系，見圖4。依據(jù)篩選條件，篩選核心靶點的具體流程見圖5。經(jīng)篩選可得到核心靶點共13 個：JUN、TP53、MYC、MAPK1、AKT1、ESR1、FOS、MAPK14、CCND1、MAPK8、CDKN1A、RELA、RB1，見表2。這些靶點可能為黃芪-夏枯草藥對治療DCM 的核心靶點。

圖4 黃芪-夏枯草治療糖尿病心肌損傷的靶點蛋白質(zhì)交互作用圖Fig 4 Target protein interaction map of Astragalus and Prunella vulgaris in the treatment of diabetic myocardial injury

圖5 蛋白互作核心網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建Fig 5 Construction of core network diagram of protein interaction

表2 核心靶點結(jié)果Tab 2 Core target results

2.5 GO 富集分析與KEGG 富集分析

通過R 軟件對157 個疾病-藥物共同靶點進行分析，GO 結(jié)果顯示見圖6。交集基因集合共富集到2 576 條BP 通路中，基因數(shù)目＞10 的553 條通路，主要有對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細胞對化學應(yīng)激的反應(yīng)過程；交集基因集合共富集至CC 表達通路中有67 條，其中基因數(shù)目＞10 的23 條通路，主要與膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)有關(guān)；交集基因集合共富集至154個與MF 相關(guān)的過程中，富集基因數(shù)目＞10 的23 條通路，主要與DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、泛素樣蛋白連接酶有關(guān)。

圖6 黃芪-夏枯草治療DCM 作用靶點GO 富集分析結(jié)果Fig 6 Results of GO enrichment analysis of Astragalus and Prunella vulgaris in the treatment of DCM

通過R 軟件對157 個共同靶點運行后得到169條KEGG 通路，前30 的功能富集KEGG 氣泡圖結(jié)果見圖7。圖中橫坐標表示富集的數(shù)目，縱坐標代表P，P 越小顏色越紅，P 越大顏色越藍。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示共同的靶點主要富集在磷酸肌 醇 激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-AKT 信 號 通 路、MAPK 信 號 通 路、AGE-RAGE 信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、IL-17 信號通路、細胞凋亡、細胞衰老等信號通路上。

圖7 黃芪-夏枯草治療DCM 作用靶點KEGG 富集氣泡圖Fig 7 KEGG enrichment bubble map of Astragalus-prunella vulgaris in the treatment of DCM

2.6 分子對接分析

將核心活性成分木犀草素、槲皮素、毛蕊異黃酮、山 柰 酚 與 關(guān) 鍵 靶 點AKT1、FOS、MAPK1、MAPK8、JUN、MYC、MAPK14、RELA 進行分子對接。通?？紤]結(jié)合能低于-4.25 kcal/mol，表明受體與配體有相應(yīng)的結(jié)合能力，低于-5.0 kcal/mol，表明具有較好的結(jié)合活性，小于-7.0 kcal/mol 有強烈的結(jié)合活性［14］。將4 種活性成分與8 個靶蛋白分別進行對接，結(jié)果顯示木犀草素、槲皮素、毛蕊異黃酮、山 柰 酚 成 分 與AKT1、MAPK14、MAPK1、FOS、MAPK8、JUN、RELA 有強烈的結(jié)合能力，見表3，用PyMOL 軟件對有強烈結(jié)合活性（結(jié)合能≦-7 kcal/mol）的成分與靶點對接結(jié)果進行可視化，見圖8。

圖8 分子對接模式圖Fig 8 Molecular docking pattern diagram

表3 黃芪-夏枯草關(guān)鍵有效成分與靶點蛋白分子對接所需結(jié)合能（kcal/mol）Tab 3 Binding energy for Astragalus-prunella vulgaris aetine components docked with target proteins（kcal/mol）

2.7 黃芪-夏枯草藥對含藥血清干預H9c2 心肌細胞的體外實驗研究

2.7.1 黃芪-夏枯草藥對血清對正常H9c2 心肌細胞存活率的影響 黃芪-夏枯草藥對血清對正常大鼠H9c2 心肌細胞存活率的影響實驗中，設(shè)置不同濃度的黃芪-夏枯草藥對血清孵育細胞12 h/24 h/48 h，細胞存活率應(yīng)用MTT 法檢測，黃芪-夏枯草藥對血清對正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的H9c2 心肌細胞存活率的影響顯示，與正常組比較，黃芪-夏枯草藥對血清低于17.5%時，對細胞的存活率無明顯抑制作用，且黃

芪-夏枯草藥對血清低于15% 時，對正常培養(yǎng)的H9c2 心肌細胞有促進生長作用。因此將選擇黃芪-夏枯草藥對血清在5%～15%范圍內(nèi)干預高糖培養(yǎng)的細胞，根據(jù)不同濃度含藥血清干預12 h/24 h/48 h細胞的存活率及建模所需時間，后續(xù)實驗采用各濃度含藥血清干預24 h。見表4。

表4 黃芪-夏枯草藥對血清對正常心肌細胞存活率的影響（n=3，±s）Tab 4 Effect of Astragalus-prunella vulgaris containing serum on the survival rate of normal cardiomyocytes（n=3，±s）

表4 黃芪-夏枯草藥對血清對正常心肌細胞存活率的影響（n=3，±s）Tab 4 Effect of Astragalus-prunella vulgaris containing serum on the survival rate of normal cardiomyocytes（n=3，±s）

時間12 h分組存活率(%)F P正常組5%血清組10%血清組15%血清組17.5%血清組97.67±2.08 108.67±1.53 108.00±2.00 108.67±1.53 90.33±2.52 166.600＜0.001 24 h 254.577＜0.001 48 h 20%血清組正常組5%血清組10%血清組15%血清組17.5%血清組20%血清組正常組5%血清組10%血清組15%血清組17.5%血清組20%血清組59.00±4.58 96.67±3.06 107.00±3.00 108.33±2.08 107.33±3.06 80.67±2.09 45.67±2.52 94.33±3.79 103.33±3.06 104.67±4.16 106.00±3.61 76.67±3.22 158.452＜0.001 39.00±3.61

2.7.2 黃芪-夏枯草藥對血清對高糖誘導的H9c2 心肌細胞存活率的影響 黃芪-夏枯草藥對血清對高糖誘導的H9c2 心肌細胞存活率的影響實驗顯示，與正常組比較，模型組細胞的存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與模型組相比，15%血清組和10%血清組細胞的存活率顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。見表5。

表5 黃芪-夏枯草藥對血清對高糖誘導的H9c2 心肌細胞存活率的影響（n=3，±s）Tab 5 Effect of Astragalus-prunella containing serum on the survival rate of H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（n=3，±s）

表5 黃芪-夏枯草藥對血清對高糖誘導的H9c2 心肌細胞存活率的影響（n=3，±s）Tab 5 Effect of Astragalus-prunella containing serum on the survival rate of H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（n=3，±s）

組別正常組模型組5%血清組10%血清組15%血清組存活率(%)97.67±3.22 70.33±3.51 81.00±4.58 84.67±4.16 91.33±3.26 F P 22.699＜0.001

2.7.3 黃芪-夏枯草藥對血清對關(guān)鍵基因蛋白表達的影響 Western blot 結(jié)果顯示各組細胞中AKT1、MAPK14 蛋白表達無明顯變化。與正常組相比，模型組細胞中p-AKT1/AKT1、p-MAPK14/MAPK14比值均顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）；與模型組相比，15% 血清組細胞中p-AKT1/AKT1、p-MAPK14/MAPK14 比值均顯著升高，均具有統(tǒng)計學差異，見圖9、表6。結(jié)果表明，黃芪-夏枯草藥對血清可提高高糖誘導的H9c2 心肌細胞中AKT1、MAPK14 蛋白的磷酸化表達。

表6 各組H9c2 心肌細胞AKT1、p-AKT1、MAPK14、p-MAPK14 蛋白的表達情況（n=3，±s）Tab 6 Expression of AKT1，p-AKT1，MAPK14 and p-MAPK14 proteins in H9c2 cardiomyocytes in each group（n=3，±s）

表6 各組H9c2 心肌細胞AKT1、p-AKT1、MAPK14、p-MAPK14 蛋白的表達情況（n=3，±s）Tab 6 Expression of AKT1，p-AKT1，MAPK14 and p-MAPK14 proteins in H9c2 cardiomyocytes in each group（n=3，±s）

指標p-AKT1/AKT1分組F P NM 15%血清組10%血清組5%血清組53.873＜0.001 p-MAPK14/MAPK14 NM 15%血清組10%血清組5%血清組表達量0.86±0.03 0.59±0.02 0.83±0.03 0.80±0.03 0.65±0.03 0.95±0.03 0.50±0.03 0.82±0.05 0.56±0.03 0.43±0.05 113.296＜0.001

圖9 各組H9c2 心肌細胞AKT1、p-AKT1、MAPK14、p-MAPK14 蛋白的表達情況（n=3，±s）Fig 9 Expression of AKT1，p-AKT1，MAPK14，and p-MAPK14 proteins in various groups of H9c2 cardiomyocytes（n=3，±s）

3 討論

DCM 在中醫(yī)學中歸屬于“消渴病心病”范疇，氣虛為本、血瘀為標為其基本病機。研究結(jié)果顯示，黃芪作為治療DM 及其并發(fā)癥中應(yīng)用頻率較高的單味藥之一，其在治療DM 心血管并發(fā)癥中居于首要位置［15］。藥理學實驗結(jié)果證實，黃芪具有降低血糖、調(diào)節(jié)糖代謝的功效［16，17］。槲皮素是黃芪、夏枯草的主要活性成分，是典型的天然黃酮類化合物，有研究表明，槲皮素具有抑制氧化應(yīng)激，減少細胞凋亡，降低炎癥反應(yīng)，抑制心肌缺血再灌注損傷的重要作用［18］。有研究證實［19］，槲皮素可通過調(diào)控HMGB1-TLR4-NF-κB 信號通路，發(fā)揮減少炎性因子產(chǎn)生的重要作用。木犀草素作為夏枯草的主要活性成分，有研究顯示［20］，木犀草素可通過干預PI3K/AKT 信號通路來減輕心肌缺血再灌注損傷，進而可改善心功能及保護心臟。有研究證實［21］，通過H2O2誘導H9c2 心肌細胞凋亡模型，實驗組用藥選用木犀草素，研究結(jié)果顯示實驗組中AKT 和抗凋亡介質(zhì)Bcl-2 的表達均低于對照組，而促凋亡蛋白Bax、Caspase-8、Cleaved-Caspase-3 和p53 的表達增加。木犀草素能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導致的線粒體損傷，可以下調(diào)P53 蛋白的表達水平，進而使心肌細胞得到保護［22］。木犀草素可減少Ca2+進入細胞，促進Ca2+排出，提高Ca2+-Mg2+-ATPase 的活性，還可降低鈣調(diào)素、線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運蛋白的濃度［23］。木犀草素可對心肌細胞內(nèi)Ca2+的平衡進行調(diào)控，可能為其抑制心肌細胞凋亡的主要機制。

本次研究顯示，黃芪-夏枯草藥對治療DCM 的關(guān)鍵靶點蛋白分別為AKT1、MAPK14、MAPK1、FOS、MAPK8、JUN、MYC、RELA，上述靶點基因參與調(diào)控細胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)途徑。AKT1作為AKT 激酶之一，可參與調(diào)控細胞增殖、存活、代謝以及血管生成，能夠誘導葡萄糖轉(zhuǎn)運而負責調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取，調(diào)控糖尿病及并發(fā)癥［24］。AKT 在調(diào)節(jié)胰島素依賴的新陳代謝應(yīng)答方面扮演著重要角色［25］，激活AKT 后，可發(fā)揮調(diào)節(jié)糖攝取、脂質(zhì)代謝等作用，AKT 過表達可導致血糖升高，并誘導胰島素抵抗［26-28］。MAPK14 作為絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導途徑的主要組成部分，調(diào)控細胞凋亡，在細胞外刺激導致的細胞級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有學者證實MAPK 在心肌纖維化的調(diào)控中，發(fā)揮重要作用［29，30］。另有一部分學者發(fā)現(xiàn)在骨骼肌細胞中，MAPK 通路不僅參與膠原蛋白Ⅳ的表達，同時也參與基質(zhì)金屬蛋白酶家族中MMP-9 的表達，致心臟重構(gòu)及心肌纖維化［31］。研究證實［32］，在DCM中，具有誘導凋亡和促分化雙重作用的FOS 表達水平降低，有研究發(fā)現(xiàn)在DCM 的發(fā)生、發(fā)展過程中，F(xiàn)OS 的表達存在時相性的特征。眾所周知，JUN 是參與細胞增殖、凋亡過程的原癌基因，研究表明當應(yīng)用誘導劑誘導細胞凋亡時，JUN 的表達可明顯升高［33］。在DCM 中，TNF-α 可激活MAPK，上調(diào)Bax的表達，下調(diào)bcl-2 的表達，進而誘導細胞凋亡；TNF-α 可升高FOS、MYC 的表達，進而使心肌間質(zhì)纖維化。

分析GO 富集結(jié)果可得出，黃芪-夏枯草藥對治療DCM 的分子功能主要表現(xiàn)與DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、泛素樣蛋白連接酶等密切相關(guān)。分析KEGG 通路富集結(jié)果可知，黃芪-夏枯草藥對作用主要涉及PI3K/AKT 信 號 通 路、MAPK 信 號 通 路、AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、細胞凋亡、細胞衰老、IL-17信號通路等。國外學者通過動物實驗表明［34］，胰島素影響心肌細胞的糖脂代謝及收縮功能，主要是通過MAPK 通路和PI3K 信號通路。PI3K/AKT 信號通路在調(diào)控細胞生長、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄及蛋白合成途徑方面發(fā)揮重要作用［35］。PI3K 作為磷酸肌醇及肌醇的重要激酶，激活PI3K 可進一步促進AKT 的活化，活化后的AKT 磷酸化激活或抑制其下游靶蛋白，通過PI3K/AKT 信號通路調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bax、BAD、Bcl-2、Caspase-9 等 而 抑 制 細 胞 的 凋亡［36］。有研究表明，黃芪可通過激活MAPK 信號通路，進而減輕心肌損傷，發(fā)揮改善DCM 大鼠心功能的作用［37］。RAGE 與DM 及其并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)［38］。RAGE 與AGE 結(jié) 合 可 形 成AGE-RAGE 系統(tǒng)，可使NF-κB、氧化應(yīng)激、Janus 激酶等信號通路激活，從而促進生成相關(guān)的細胞因子及生長因子，進而影響糖尿病并發(fā)癥的進程。有研究顯示DM 并發(fā)癥的嚴重程度與AGE 的蛋白水平呈正相關(guān)［39］。TNF-α 使炎性細胞發(fā)生聚集、粘附，微血管擴張，進一 步 加 重 炎 性 反 應(yīng)［40，41］。有 研 究 顯 示［42］通 過 敲 除IL-17，高糖誘導的AK081284 上調(diào)被消除，從而減少心肌成纖維細胞中TGF-β1 和膠原的生成，從而達到治療DCM 的作用。

本研究中網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明黃芪-夏枯草藥對可 能 通 過 作 用 于AKT1、MAPK14、MAPK1、MAPK8 等關(guān)鍵靶點，激活PI3K/AKT、MAPK 等關(guān)鍵信號通路發(fā)揮抗心肌纖維化作用。分子對接結(jié)果提示，黃芪-夏枯草藥對活性成分木犀草素與AKT1、毛蕊異黃酮和MAPK14 結(jié)合性較好。體外細胞實驗證實，黃芪-夏枯草藥對血清對高糖誘導的H9c2 心肌細胞的增殖抑制作用有明顯改善；黃芪-夏枯草藥對血清可使高糖損傷的H9c2 心肌細胞AKT1、MAPK14 蛋白的磷酸化表達上升。

綜上，本研究通過對黃芪-夏枯草藥對與DCM疾病間的多元網(wǎng)絡(luò)成分進行研究，明確了黃芪-夏枯草藥對的潛在活性成分和關(guān)鍵作用靶點，以及與其相關(guān)的主要信號通路，為進一步深入探討其作用機制提供了新的思路與見解。

作者貢獻說明：

劉麗穎：構(gòu)思了這項研究，完成網(wǎng)絡(luò)藥理學分析，參與了實驗設(shè)計、執(zhí)行和數(shù)據(jù)統(tǒng)計；李高彪：負責指導細胞實驗操作及實驗數(shù)據(jù)分析；楊曉暉：為寫作審查和監(jiān)督做出了貢獻；張力、黃舉凱：參與論文的修改與指導。所有作者都設(shè)計了實驗、撰寫了手稿并修改了論文。所有作者都閱讀并批準了手稿的最終版本。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。