鄒瑞基 鄒忠晴 熊艷秋 饒進(jìn) 張麗

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是血液系統(tǒng)第二常見腫瘤，其發(fā)病率日益增加。近年來，在MM 免疫功能障礙和免疫抑制微環(huán)境方面的研究取得了重大進(jìn)展，調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在骨髓微環(huán)境中誘導(dǎo)免疫抑制的機(jī)制逐步被闡明[1]。同時(shí)，調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞也開始進(jìn)入MM 臨床實(shí)踐，其數(shù)量或比例變化可能有助于MM 早期診斷和療效評(píng)估，并補(bǔ)充現(xiàn)有的預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)。單克隆抗體、雙特異性抗體、嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）治療等療法使用標(biāo)志著MM 進(jìn)入免疫治療時(shí)代，患者的預(yù)后得到顯著改善，但MM 仍不可治愈，為了延長復(fù)發(fā)難治性MM 患者的生存期，闡明抗腫瘤免疫功能障礙的機(jī)制和探索新的免疫治療策略至關(guān)重要。目前的基礎(chǔ)研究已深入揭示了MM 免疫抑制微環(huán)境的形成及功能狀態(tài)。本文未局限于探討誘導(dǎo)MM 免疫抑制的生物學(xué)機(jī)制，而是聚焦調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在MM 臨床診治中的價(jià)值，以期為MM 早期診斷、預(yù)后及療效評(píng)估提供新的思路，引發(fā)對(duì)MM 免疫療法的思考。

1 調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞參與MM 抑制性免疫微環(huán)境形成

調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞主要包括調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）、調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞（regulatory B cells，Bregs）、骨髓來源的抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）等，其功能是抑制其他細(xì)胞群對(duì)自身或異體抗原的免疫反應(yīng)，在腫瘤、自身免疫性疾病、器官移植等領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在MM 免疫抑制微環(huán)境的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，廣泛參與MM 細(xì)胞的免疫逃逸、增殖和耐藥[2]。

Tregs 是CD4+T 淋巴細(xì)胞的一個(gè)特殊亞群，其特征是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3（Forkhead box P3，F(xiàn)oxP3），并能進(jìn)一步分為多種亞型。在MM 免疫微環(huán)境中，Tregs 不僅通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）等細(xì)胞因子和顆粒酶、穿孔素等溶細(xì)胞顆粒抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的增殖活化，還可通過其表面的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）與效應(yīng)細(xì)胞直接結(jié)合，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[1]。MM 免疫微環(huán)境中也存在多種生物學(xué)機(jī)制誘導(dǎo)Tregs 激活和擴(kuò)增，從而促進(jìn)抑制性免疫微環(huán)境的形成。研究發(fā)現(xiàn)，促使MM 細(xì)胞生存的增殖誘導(dǎo)配體（a proliferation-inducing ligand，APRIL）可顯著促進(jìn)Tregs 的增殖和存活；MM 細(xì)胞通過分泌Ⅰ型干擾素促進(jìn)Tregs 的活化和擴(kuò)增[3-4]。人類Bregs 表型被定義為CD19+CD24hiCD38hi，產(chǎn)生IL-10 是識(shí)別Bregs 的標(biāo)記。在MM 患者骨髓微環(huán)境中，IL-10 顯著促進(jìn)B 細(xì)胞增殖，參與B 細(xì)胞向漿細(xì)胞的最終分化，并且能誘導(dǎo)惡性漿細(xì)胞血管生成，有利于MM 的發(fā)病和進(jìn)展[5]；同時(shí)，Bregs能夠抑制自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）針對(duì)MM 細(xì)胞的抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC），從而導(dǎo)致MM 免疫逃逸[6]。此外，MM 細(xì)胞可以誘導(dǎo)骨髓微環(huán)境中MDSCs 的產(chǎn)生，MDSCs 通過抑制效應(yīng)T 細(xì)胞、促進(jìn)Tregs 增殖、誘導(dǎo)NK 細(xì)胞無能等方式促進(jìn)MM 的免疫耐受和免疫逃逸[7]。MSCs 和TAM也作為具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，其與MM 細(xì)胞的相互作用促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖、擴(kuò)散、耐藥性產(chǎn)生以及骨髓瘤骨病的發(fā)生。在免疫治療的背景下，調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞亟待從基礎(chǔ)研究走入臨床實(shí)踐。

2 調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在MM 中的臨床價(jià)值

2.1 Tregs 在MM 診斷、治療、預(yù)后預(yù)測(cè)中的價(jià)值

對(duì)于新診斷多發(fā)性骨髓瘤（newly diagnosed multiple myeloma，NDMM）患者，疾病的異質(zhì)性使得在治療反應(yīng)和生存方面存在較大差異。因此，個(gè)體化危險(xiǎn)分層至關(guān)重要，Tregs 可能成為新的預(yù)后標(biāo)志。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)外周血Tregs 增高與疾病負(fù)荷相關(guān)，國際預(yù)后分期（international staging system，ISS）Ⅲ期患者Tregs 較Ⅰ、Ⅱ期增高，并且外周血Tregs 增高的患者疾病進(jìn)展時(shí)間（time to progression，TTP）及總生存期（overall survival，OS）更短[8-10]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，擁有更高骨髓Tregs 比例（＞3.31%）的NDMM 患者無進(jìn)展生存期（progress-free survival，PFS）顯著縮短，并伴隨以高表達(dá)PD-1 為特征的CD4+效應(yīng)T 細(xì)胞（CD4effPD-1hi），CD4effPD-1hi增高和CD4eff/Tregs 降低是MM早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[11]。Kitadate 等[12]提出，MM 復(fù)發(fā)患者外周血CD38+Tregs 數(shù)量明顯高于意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥（monoclonal gammopathy of unknown significance，MGUS）、無癥狀骨髓瘤（smoldering multiple myeloma，SMM）、NDMM 組，提示CD38+Tregs 在骨髓瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。目前，多數(shù)研究認(rèn)為MM 患者骨髓與外周血Tregs 比例通常增加，且Tregs 水平與更高的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；Tregs 變化與MM 疾病狀態(tài)、進(jìn)展和預(yù)后無顯著關(guān)聯(lián)，這種差異可能是由于不同中心對(duì)于Tregs 分選以及實(shí)驗(yàn)方法不同所致，今后還需更大樣本量的研究來探索Tregs 對(duì)于MM 預(yù)后分層的作用。

MGUS 被認(rèn)為是MM 發(fā)展過程中的初始階段，并可進(jìn)展為一種更接近MM 的狀態(tài)，即SMM。絕大部分MGUS/SMM 患者可保持長期疾病穩(wěn)定狀態(tài)，通常認(rèn)為這類患者無需治療，而識(shí)別其中的高危人群，采取早期干預(yù)措施，是延緩向MM 進(jìn)展的重要手段[13]。Marsh-Wakefield 等[14]對(duì)MGUS 和NDMM 患 者中CD39-Tregs 亞群進(jìn)行區(qū)分，發(fā)現(xiàn)CD45RO+CD49d+CD62L+和CD69+CD62L-CD49d-亞群主要在NDMM患者中出現(xiàn)，可作為區(qū)分MGUS 和NDMM 的指標(biāo)，并推測(cè)這種差異可能促進(jìn)了惡性漿細(xì)胞的生長，代表MGUS 向MM 轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵免疫改變。Wang 等[15]也通過對(duì)MGUS 患者、NDMM 患者和健康志愿者外周血與骨髓中Tregs 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MM 患者CD4+CD28-FoxP3+Treg 樣細(xì)胞明顯高于MGUS 患者。CD4+CD28-FoxP3+Treg 樣細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞亞群，其可能參與導(dǎo)致MGUS 進(jìn)展為MM 的免疫受損。了解這些Tregs 亞群的調(diào)控特性有助于識(shí)別MM 進(jìn)展高危人群，實(shí)現(xiàn)MM 早期診斷與治療。

免疫調(diào)節(jié)劑（immunomodulatory drugs，IMiDs）和蛋白酶體抑制劑（proteasome inhibitor，PI）已成為MM 治療的基石，Tregs 作為免疫微環(huán)境的生物標(biāo)志物，在療效評(píng)估價(jià)值也有待被發(fā)掘。有研究發(fā)現(xiàn)在38 例對(duì)BRD 方案（硼替佐米、來那度胺、地塞米松）誘導(dǎo)治療有反應(yīng)的NDMM 患者中，達(dá)到完全緩解（complete remission，CR）的患者總Tregs 水平較低，但CTLA-4+DR+終末效應(yīng)Tregs 水平顯著升高[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)18 例患者經(jīng)RD 方案治療后，外周血Tregs 比例降低，且療效在非常好的部分緩解（very good partial remission，VGPR）以上的患者更顯著，提示Tregs 與應(yīng)答質(zhì)量相關(guān)[16]。在達(dá)到部分緩解（partial remission，PR）以上療效患者的維持治療中，Nozaki 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在含來那度胺方案治療3 個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，患者外周血CD45RA-CD4+FoxP3hi效應(yīng)Tregs（effector Tregs，eTregs）較基線值均顯著增加，進(jìn)一步對(duì)eTregs 免疫表型分析發(fā)現(xiàn)，其中糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）陽性eTregs 比例降低，并且這種改變?cè)赩GPR 療效以上患者中更為明顯。因此，推測(cè)GITR+eTregs 可能起到功能性Tregs 的作用。未來亟需精確分析Tregs 亞型，以期預(yù)測(cè)臨床結(jié)局，針對(duì)不同免疫特征實(shí)施個(gè)體化治療策略。

免疫治療的應(yīng)用為復(fù)發(fā)難治性MM 患者帶來了希望，尋找新的免疫靶標(biāo)是當(dāng)前的重點(diǎn)方向。通過靶向作用于Tregs 從而改善宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答，有望成為MM 新的治療方法。CD38 單抗daratumumab 的問世標(biāo)志著MM 進(jìn)入免疫治療時(shí)代。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)daratumumab 治療的MM 患者骨髓和外周血CD38+Tregs 顯著減少，同時(shí)伴隨著效應(yīng)T 細(xì)胞數(shù)量及活性的增加，提示腫瘤微環(huán)境中免疫抑制的減輕[18]。并且，循環(huán)CD38+Tregs 數(shù)目較高的患者對(duì)daratumumab 有更持久應(yīng)答，治療前CD38+Tregs 水平可能是daratumumab 療效的預(yù)測(cè)因素[12]。信號(hào)傳導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化分子家族成員7（signaling lymphocyte activated molecular family 7，SLAMF7）單抗elotuzumab 是第二種獲批MM 免疫治療的藥物，除了能夠通過NK 細(xì)胞介導(dǎo)殺傷MM 細(xì)胞，最近還有研究發(fā)現(xiàn)能通過消除SLAMF7+CD8+Tregs 促進(jìn)抗腫瘤免疫的恢復(fù)[19]。

2.2 Bregs 在MM 診斷、治療、預(yù)后預(yù)測(cè)中的價(jià)值

近年來，Bregs 在MM 免疫微環(huán)境中的作用開始得到關(guān)注，深入了解Bregs 與MM 發(fā)病和進(jìn)展的關(guān)系，并探索相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制，可能是MM 早期診斷、預(yù)后評(píng)估和靶向干預(yù)的潛在途徑。本研究前期工作[6]首次通過流式細(xì)胞術(shù)從MM 患者骨髓樣本中確認(rèn)了CD19+CD24hiCD38hiBregs，并發(fā)現(xiàn)MM 患者外周血Bregs 比例與健康人無顯著性差異，而NDMM 患者骨髓和外周血Bregs 比例明顯高于緩解后維持治療者。有小樣本量研究顯示，在MGUS 向MM 的轉(zhuǎn)變中，骨髓Bregs 比例開始增加，而在MM 進(jìn)展過程中趨于下降[20]。Bartosińska 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，隨著疾病分期的增加，骨髓中Bregs 的比例呈下降趨勢(shì)，ISS Ⅲ期患者骨髓Bregs 的比例顯著低于ISS I 期患者，并且Bregs 產(chǎn)生IL-10 的水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，ISS Ⅲ期患者Bregs 所產(chǎn)生的IL-10 顯著升高。

目前，MM 常用的分期系統(tǒng)結(jié)合生化指標(biāo)和細(xì)胞遺傳學(xué)，反映了機(jī)體腫瘤負(fù)荷，卻不能體現(xiàn)免疫微環(huán)境異常的因素，在MM 患者診治流程中納入Bregs 分析，有望構(gòu)建更加精準(zhǔn)的危險(xiǎn)分層模型。在一項(xiàng)NMDD 患者的真實(shí)世界研究中，研究者分析Bregs 與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)骨髓CD19+B 細(xì)胞中CD19+CD24hiCD38hiBregs＜10%患者有更短的OS，并且PFS 也呈縮短的趨勢(shì)，但不同分期NDMM 患者Bregs 比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，Bregs 在CD19+B 細(xì)胞中的百分比也與骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）中CD19+B 細(xì)胞的比例呈正相關(guān)。推測(cè)更高的Bregs 提示更高的B 細(xì)胞比例，反映了機(jī)體免疫功能，與患者更佳的生存結(jié)局相關(guān)[22]。同一中心還研究了PET-CT 聯(lián)合Bregs 比例預(yù)測(cè)治療反應(yīng)和生存結(jié)局的作用，分析52 例基于BD 方案誘導(dǎo)的患者治療前的骨髓樣本，其中Bregs 相對(duì)于CD19+B 細(xì)胞中位比值為7.5%（1.1%～27.2%）。24 例（46.2%）患者Bregs 比例＜10%，并且PFS 和OS 更短，這些患者經(jīng)誘導(dǎo)治療，23.1%無法達(dá)到PR，而Bregs≥10%的患者均達(dá)到PR 及以上療效。研究者同時(shí)發(fā)現(xiàn)，基線PET-CT 最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值（maximum standard uptake value，SUVmax）＞4.2 并且Bregs 比例＜10% 能作為高危NDMM 患者的分層指標(biāo)，提示更差的治療反應(yīng)和PFS、OS[23]。需要進(jìn)行更大樣本量和長時(shí)間隨訪的研究，進(jìn)一步證實(shí)Bregs 在NDMM 患者預(yù)后與療效評(píng)估中的價(jià)值。

特別值得關(guān)注的是，daratumumab 治療復(fù)發(fā)難治性MM 可快速使CD19+CD24hiCD38hiBregs 下降[24]。消除具有免疫抑制作用的Bregs，可能改變MM 免疫微環(huán)境，重新激活免疫系統(tǒng)抗腫瘤功能，增強(qiáng)CD38 單抗、SLAMF7 單抗以及其他免疫療法對(duì)MM 細(xì)胞的活性。前期的研究也發(fā)現(xiàn)Bregs 可以抑制NK 細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)MM 細(xì)胞的ADCC 作用[6]，而上述提到的Bregs 比例高提示NDMM 患者更好的生存和療效，可能與Bregs 的免疫抑制作用相矛盾，推測(cè)由于Bregs比例高的患者B 細(xì)胞總數(shù)也高，其免疫抑制狀態(tài)較輕，并且真正具有免疫抑制作用的Bregs 可能為其中一部分。未來的研究需進(jìn)一步分析Bregs 的各種亞型以及在MM 不同階段的作用，并探索新的免疫治療靶點(diǎn)。

2.3 其他調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在MM 中的臨床價(jià)值

MDSCs、MSCs、TAM 等調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞也參與MM 的發(fā)展，具有治療及預(yù)后意義。MDSCs 是骨髓來源的一群異質(zhì)性細(xì)胞，正常情況下能分化為樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成熟粒細(xì)胞，而在腫瘤、炎癥等病理狀態(tài)下則分化受阻，成為具有負(fù)性免疫調(diào)控作用的細(xì)胞群體。MDSCs 主要有兩個(gè)亞群：單核MDSCs（monocyte MDSCs，M-MDSCs）和粒細(xì)胞MDSCs（granulocyte MDSCs，G-MDSCs），人類M-MDSCs 表型被定義為CD33+CD11b+HLA-DRlow/-CD14+，G-MDSCs 為CD33+CD11b+HLA-DRlow/-CD15+[25]。MDSCs 的水平與MM 疾病嚴(yán)重程度和治療反應(yīng)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，ISS Ⅲ期和腎功能損害患者外周血M-MDSCs 水平明顯升高，硼替佐米治療后M-MDSCs 顯著降低[26]；復(fù)發(fā)難治性患者經(jīng)3 個(gè)周期RD 方案治療后，M-MDSC 頻率增加與未能達(dá)到VGPR 及以上療效有關(guān)[27]。骨髓G-MDSCs 比例低的患者腫瘤負(fù)荷也較低（ISSⅠ/Ⅱ期），且G-MDSCs 增高提示OS 更短[28]。MDSCs 水平升高提示不良預(yù)后，抑制MDSCs 在MM 中的功能可能是具有前景的免疫治療策略。

MSCs 是骨髓中主要的干細(xì)胞群體，MM 患者的MSCs 表現(xiàn)出異常的細(xì)胞因子分泌水平和基因表達(dá)特點(diǎn)，對(duì)MM 細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，而MM 細(xì)胞與MSCs 的相互作用也可誘導(dǎo)MSCs 生長和獲得異常表型，這可能有助于MM 免疫微環(huán)境的發(fā)展和骨病的發(fā)生[29-30]。已有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 基因表達(dá)模式可以將MM 患者與MGUS、SMM 以及健康對(duì)照者區(qū)分，基于3 個(gè)MSCs 特異性基因COL4A1、NPR3 和ITGBL1 的表達(dá)，能夠預(yù)測(cè)MGUS/SMM 患者向MM 的進(jìn)展以及MM 患者的PFS，COL4A1 過表達(dá)、NPR3和ITGBL1 低表達(dá)提示不良預(yù)后[31]。成骨分化能力受損是MM-MSCs 的顯著特征，通過靶向骨髓MSCs 改善MM 誘導(dǎo)的骨損傷是近年來的研究熱點(diǎn)，體外實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)多種靶向MSCs 的分子能調(diào)節(jié)MSCs 成骨分化，改善MM 骨質(zhì)破壞[30]。

此外，以表達(dá)CD163 為特征的TAM 也與MM預(yù)后密切相關(guān)，其數(shù)量增多提示較差的臨床特征、治療反應(yīng)和PFS、OS[32-34]，有助于在初診時(shí)識(shí)別高危患者和補(bǔ)充現(xiàn)有的預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)。

調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在MM 中的臨床研究尚處在起步階段，其對(duì)于MM 診斷、治療、預(yù)后的重要價(jià)值尚在認(rèn)識(shí)階段。Tregs、Bregs、MDSCs、MSCs、TAM 作為MM 免疫微環(huán)境中主要的調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞群體，其數(shù)量及功能變化是腫瘤演變情況的反映指標(biāo)，具有診斷、治療、預(yù)后的相關(guān)臨床價(jià)值?？偨Y(jié)近5 年調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在MM 患者中臨床意義的研究，見表1。

表1 近5 年調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在MM 患者中臨床意義的研究匯總

表1 近5 年調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在MM 患者中臨床意義的研究匯總 （續(xù)表1）

3 結(jié)語與展望

在MM 患者診療過程中納入對(duì)骨髓和外周血調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞的分析，可能是早期診斷、高危患者干預(yù)及個(gè)體化治療的途徑。目前，調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在MM 中的臨床意義多局限于單中心、小樣本量研究，對(duì)調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞的分選及各種亞型的定義也缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)歷了傳統(tǒng)化療和靶向新藥時(shí)代，免疫治療已成為MM 最具潛力的治療策略，未來還需要高質(zhì)量的基礎(chǔ)和臨床研究來進(jìn)一步揭示調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在MM 中的復(fù)雜作用機(jī)制，并探索針對(duì)調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞的新治療策略，以期突破MM 慢性進(jìn)程中復(fù)發(fā)難治的瓶頸。