王軼 王婷玉 王君 閻禹廷 呂瑞 熊文婕 邱錄貴 易樹(shù)華

毛細(xì)胞白血?。╤airy cell leukemia，HCL）和毛細(xì)胞白血病變異型（hairy cell leukemia-variant，HCL-v）是兩種罕見(jiàn)的慢性B 細(xì)胞增殖性疾?。˙-cell lymphoproliferative diseases，BLPD），約占整個(gè)成人白血病的2%[1]。HCL-v 在過(guò)去的很多年中被認(rèn)為是HCL的一個(gè)變種，2016 版世界衛(wèi)生組織造血與淋巴組織腫瘤分型標(biāo)準(zhǔn)（2016WHO 分型）將其歸類(lèi)于“脾B 細(xì)胞淋巴瘤，不能分類(lèi)”[2]，成為區(qū)別于HCL 的一個(gè)疾病亞類(lèi)。由于十分罕見(jiàn)，HCL 和HCL-v 的臨床、生物學(xué)特征和預(yù)后之間的關(guān)系尚無(wú)明確定論。

這是從入錯(cuò)的角度對(duì)責(zé)任原因進(jìn)行排序，還需要從出錯(cuò)的角度對(duì)責(zé)任原因進(jìn)行排除，即并非屬于責(zé)任產(chǎn)生的原因進(jìn)行排除的緣由。這個(gè)方面需要進(jìn)行充分地論證，而非僅僅只是簡(jiǎn)單帶過(guò)，減少并避免說(shuō)情打招呼的現(xiàn)象導(dǎo)致漏網(wǎng)之魚(yú)的出現(xiàn)。

B 細(xì)胞受體（B cell receptors，BCR）及其信號(hào)通路激活是B 細(xì)胞腫瘤發(fā)生和演變過(guò)程中關(guān)鍵的分子靶標(biāo)，其中免疫球蛋白重鏈可變區(qū)（immunoglobulin heavy chain variable region,IGHV）基因的分子特征與B 細(xì)胞淋巴瘤的特定臨床特征及預(yù)后相關(guān)。數(shù)項(xiàng)基于歐美人群的研究顯示，HCL 和HCL-v 對(duì)VH3和VH4 基因家族有偏向性使用，而IGHV 未突變狀態(tài)（IGHV-unmutated，IGHV-UM）和使用VH4-34 片段（VH4-34 rearrangement，VH4-34+）是兩種疾病的不良預(yù)后因素[3-6]。本研究回顧性分析中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院29 例HCL 和15 例HCL-v 患者IGHV 分子特征及其與臨床表現(xiàn)、預(yù)后的相關(guān)性，旨在探索國(guó)內(nèi)HCL 和HCL-v 患者IGHV 的特征和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

研究對(duì)象為2004 年12月至2020 年1月在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院診療并完善IGHV 檢測(cè)的44例患者，其中HCL 為29 例，HCL-v 為15 例。所有患者均完善骨髓/外周血多色流式免疫分型、病理細(xì)胞形態(tài)及免疫組織化學(xué)、靶向測(cè)序等多種檢測(cè)，并由高年資醫(yī)師根據(jù)2016WHO 分型[2]及《B 細(xì)胞慢性淋巴增殖性疾病診斷與鑒別診斷中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)（2018 年版）》[7]進(jìn)行診斷復(fù)核。

1.2 方法

1.2.1 IGHV 突變狀態(tài)及重排片段檢測(cè) 抽取患者骨髓或外周血標(biāo)本并提取基因組DNA，按照試劑盒（購(gòu)于美國(guó)InVivoScribe 公司，IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0）說(shuō)明書(shū)對(duì)IGHV 基因片段進(jìn)行多重PCR 技術(shù)擴(kuò)增，隨后回收純化擴(kuò)增片段并進(jìn)行雙向測(cè)序。所得序列與IMGT（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest）和IgBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比以獲取突變狀態(tài)及重排片段信息。IGVH 序列同源性≥98%定義為未發(fā)生體細(xì)胞突變，同源性＜98%則定義為發(fā)生體細(xì)胞突變。

44 例患者的中位年齡為54.5（33～86）歲，男女比為3.4∶1。與既往報(bào)道相一致，HCL 患者發(fā)病年齡更輕且男性患者更為多見(jiàn)、血細(xì)胞減少表現(xiàn)更為明顯，而HCL-v 患者更易出現(xiàn)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和β2 微球蛋白（β2microglobulin，β2-MG）水平升高、脾大及核型異常（表1）。治療方面，28 例HCL 患者和14 例HCL-v 患者具備治療指征。超過(guò)70%患者一線(xiàn)接受核苷類(lèi)似物聯(lián)合或不聯(lián)合利妥昔單抗治療，5 例HCL 患者和2 例HCL-v 患者接受干擾素治療，1 例HCL 患者和2 例HCL-v 患者采用瘤可燃或中藥治療，2 例HCL 患者于藥物治療前接受切脾治療。

1.2.2 隨訪(fǎng) 通過(guò)門(mén)診、住院病歷資料及電話(huà)進(jìn)行隨訪(fǎng)。對(duì)隨訪(fǎng)期間死亡的病例，根據(jù)病歷記錄或與患者家屬電話(huà)聯(lián)系確認(rèn)。隨訪(fǎng)時(shí)間截至2021 年5月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間36（5～188）個(gè)月?？偵鏁r(shí)間（overall survival，OS）為治療開(kāi)始至因任何原因所致的死亡時(shí)間或末次隨訪(fǎng)時(shí)間。無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間（progressionfree survival，PFS）定義為治療開(kāi)始至疾病復(fù)發(fā)/進(jìn)展、任何原因?qū)е碌乃劳龌蚰┐坞S訪(fǎng)時(shí)間。

將HCL 患者按照VH 基因分為VH1、VH3 和VH4 3 組，發(fā)現(xiàn)使用VH4 基因的患者出現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少的比例偏低（ VH1vs.VH3vs.VH4 為100.0%vs.88.9%vs.50.0%，χ2=5.370，P=0.070），而使用VH1基因的患者則更少發(fā)生脾腫大（VH1vs.VH3vs.VH4為50.0%vs.100.0%vs.90.0%，χ2=5.560，P=0.041）。以重排片段是否為VH4-34 對(duì)HCL 患者進(jìn)行分組，VH4-34+的HCL 患者LDH（VH4-34+vs.VH4-34-為205.2 U/Lvs.160.5 U/L，t=2.063，P=0.049）及β2-MG（VH4-34+vs.VH4-34-為4.45 mg/Lvs.2.20 mg/L，U=3.000，P=0.039）水平更高。進(jìn)一步以IGHV 突變狀態(tài)對(duì)患者進(jìn)行分組，未突變的HCL 患者也表現(xiàn)為更高腫瘤負(fù)荷特征，具有更高的LDH（IGHV-UMvs.IGHV-M 為197.2 U/Lvs,.155.3 U/L，t=2.440，P=0.022）及β2-MG（IGHV-UMvs,.IGHV-M 為3.71 mg/Lvs,.2.11 mg/L，U=5.000，P=0.036）水平。25 例HCL患者通過(guò)Sanger 測(cè)序或二代測(cè)序?qū)RAF V600E 基因突變進(jìn)行檢測(cè)，其突變陽(yáng)性率為72.0%（18/25）。VH4-34+患者BRAF V600E 突變率明顯低于VH4-34-患者［20.0%（1/5）vs.85.0%（17/20），P=0.012］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

HCL-v 患者的年齡分布、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）水平、生化指標(biāo)（LDH、β2-MG 等）、脾腫大、B 癥狀等在以常見(jiàn)VH 家族基因、是否使用VH4-34 片段或IGHV 突變狀態(tài)為分組依據(jù)的亞組中無(wú)明顯差異。

2 結(jié)果

2.1 患者基線(xiàn)及治療資料

據(jù)自然正家的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在服務(wù)過(guò)程中換用公司自發(fā)研制的清潔套組后，員工的工作效率提升了17%，客戶(hù)滿(mǎn)意率達(dá)到98%以上。好品質(zhì)的清潔套組和高口碑的服務(wù)在客戶(hù)群中口口相傳，公司的訂單也就越來(lái)越多。

表1 基線(xiàn)特征及治療情況

2.2 VH 基因使用情況和突變狀態(tài)

44 例患者均檢測(cè)出重排，共涉及23 種重排片段。HCL 和HCL-v 的VH 基因使用存在明顯的偏向性和相似性（圖1A）。7 個(gè)VH 基因家族中，VH4、VH3、VH1 基因依次為兩種疾病最常使用的3 種基因，86.2%（25/29）的HCL 患者和93.3%（14/15）的 HCL-v患者均集中于這3 種基因。具體到VH 基因片段（圖1B），HCL 最常見(jiàn)的兩種重排片段為VH4-34（17.2%）和VH3-23（10.3%）；HCL-v 最常見(jiàn)的兩種重排類(lèi)型則為VH4-34（20.0%）和VH4-39（13.3%）。

IGHV 基因?yàn)橥蛔儬顟B(tài)（IGHV-mutated，IGHV-M）的患者在HCL 和HCL-v 中分別占72.4%（21/29）和66.7%（10/15），中位突變值分別為3.8（0～13.2）%和4.1（0～12.0）%。不同VH 基因家族的突變率呈不均一分布（圖1A），使用VH4 基因的患者中，50%的HCL 患者和60% 的患者為IGHV-UM，突變率顯著低于其他基因家族（P=0.032）。對(duì)常見(jiàn)VH 基因片段的分析顯示，VH4-34 在HCL 和HCL-v 中的突變率分別為20%（1/5）和0（0/3），明顯低于其他基因片段（P＜0.001）。

圖1 IGHV 基因家族和常見(jiàn)重排片段的分布情況

2.3 IGHV 分子特征與臨床特征相關(guān)性

目前，奶牛場(chǎng)常用消毒液有碘伏、次氯酸鈉和新潔爾滅等[15]，均需用水稀釋后使用，藥浴后蒸發(fā)較快，作用持續(xù)時(shí)間短，易造成乳房的重復(fù)感染，且對(duì)奶牛皮膚有一定的刺激和影響[16]。其中聚維酮碘是由聚乙烯毗咯烷酮與碘結(jié)合形成的一種無(wú)定形復(fù)合物，對(duì)皮膚有比較好的濕潤(rùn)和保護(hù)作用，因此廣泛應(yīng)用于奶牛場(chǎng)的乳頭消毒。但碘制劑消毒液有一定的殘留作用，Bogdan等人發(fā)現(xiàn)，碘消毒和乳房乳頭藥浴將增加平均牛奶碘含量從（44±1.6）～（59.3±2.3）μg/1000 mL[3]。

VH4-34+克隆性B 細(xì)胞可見(jiàn)于多種淋巴瘤及自身免疫病。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，約 5%的正常B 細(xì)胞為VH4-34+，而其在多發(fā)性骨髓瘤、CLL、濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L）、套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）和彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）的使用率分別為0、4%～22%、9%～23%、11%～16% 和15%～65%，即整體上侵襲性淋巴瘤中VH4-34 的使用率更高[10,13-16]。而針對(duì)多種淋巴瘤亞型的分子病理學(xué)研究顯示，特定的IGHV 分子特征對(duì)應(yīng)特定的遺傳學(xué)異常及信號(hào)通路活性改變，如VH4-34+眼附屬器黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤TNFAIP3 突變率更高[17]，而VH4-34+FL 則與低IGH/BCL2 易位率相關(guān)[13]。BRAF V600E 突變是HCL 發(fā)生發(fā)展早期出現(xiàn)的重要驅(qū)動(dòng)性遺傳學(xué)事件[1]。同前期研究相一致[18]，本研究證實(shí)VH4-34+HCL 患者BRAF V600E 突變陰性率更高。基于中國(guó)HCL 患者更高的VH4-34 使用率，另一項(xiàng)國(guó)內(nèi)HCL患者特征研究[19]所顯示的較低BRAF V600E 突變率也一定程度上支持中國(guó)與歐美HCL 患者間存在病理生理學(xué)差異。

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分類(lèi)變量組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率法，計(jì)量資料的組間比較采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney 非參數(shù)檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 法計(jì)算PFS 和OS 并繪制生存曲線(xiàn)，單因素分析采用Log-rank 檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 IGHV 分子特征的預(yù)后意義

38 例患者于本院接受系統(tǒng)治療并具備隨訪(fǎng)信息（HCL 25 例，HCL-v 13 例）。中位隨訪(fǎng)時(shí)間36（5～188）個(gè)月，HCL 患者的PFS 明顯長(zhǎng)于HCL-v 患者[3年P(guān)FS 率HCLvs.HCL-v 為（90.2±6.6）%vs.（60.0±16.7）%，P=0.042]，OS 無(wú)顯著性差異［3 年OS 率HCLvs.HCL-v 為（100.0±0）%vs.（90.0±9.5）%，P=0.224；圖2A～B］。對(duì)可能影響預(yù)后的因素進(jìn)行單因素分析，LDH 水平升高（PFSP＜0.001，OSP=0.025）和VH4-34+（PFSP=0.001，OSP=0.004；圖2C ～D）的HCL 患者PFS 和OS 更短；Hb＜100 g/L（P=0.023）、脾 大（P=0.025）和IGHV-UM（P=0.038，圖2E）為HCL-v 患者PFS 的不良預(yù)后因素，IGHV-UM 的HCLv 患者OS 也有縮短趨勢(shì)（P=0.060，圖2F）。白細(xì)胞增多、淋巴細(xì)胞增多、血小板減少、β2-MG 水平升高、復(fù)雜核型、確診時(shí)外周血/骨髓流式細(xì)胞比例在本研究中未顯示出明顯預(yù)后意義。

圖2 患者生存曲線(xiàn)

3 討論

本研究對(duì)近15 年來(lái)本院收治的HCL 和HCL-v患者的IGHV 分子特征進(jìn)行回顧性分析。與國(guó)外報(bào)道相一致，國(guó)內(nèi)HCL 和HCL-v 患者最常見(jiàn)的VH 基因家族集中于VH4、VH3 和VH1，這也與正常B 細(xì)胞和多種BLPD 的VH 基因家族分布大致相似。但相較于兩項(xiàng)美國(guó)研究[3，5]中HCL 對(duì)VH3（57%）和VH3-23（21%）的偏向性使用，本隊(duì)列中HCL 患者VH4（34.5%）及VH4-34（17.2%）的使用比例明顯增高。事實(shí)上，在既往本課題組和其他團(tuán)隊(duì)的研究中，VH4基因家族（尤其是VH4-34）在國(guó)內(nèi)BLPD 患者中的使用比例較歐美國(guó)家更高，其在慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）、淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤/華氏蛋白血癥、脾邊緣區(qū)淋巴瘤等多種BLPD中的使用率均居首位或前3 位[10-12]。該現(xiàn)象或可反映種族及環(huán)境中特定的抗原選擇過(guò)程，提示中西方疾病差異的潛在機(jī)制。

B 細(xì)胞在發(fā)育成熟過(guò)程中會(huì)先后經(jīng)歷IGHV 重排、體細(xì)胞高頻突變和類(lèi)別轉(zhuǎn)換等過(guò)程，最終獲得具有多樣性和高抗體親和性的BCR。BCR 可識(shí)別抗原參與免疫反應(yīng)，其信號(hào)通路活化也是B 細(xì)胞腫瘤發(fā)生發(fā)展和克隆演變的驅(qū)動(dòng)因素。每個(gè)B 細(xì)胞均具備特定的BCR 特征。因此，IGHV 使用片段和突變狀態(tài)能夠反映B 細(xì)胞的來(lái)源和生物特征，目前已用于闡釋多種自身免疫病、B 細(xì)胞腫瘤的病理機(jī)制或應(yīng)用于診斷、預(yù)后評(píng)估或微小殘留病監(jiān)測(cè)等[8-9]。既往較少研究關(guān)注HCL 和HCL-v 的IGHV 分子特征。作為兩種非常罕見(jiàn)的BLPD，國(guó)內(nèi)患者的IGHV 基因分布、突變狀態(tài)及其與臨床特征、預(yù)后的關(guān)系有待進(jìn)一步探索。

從小受到藍(lán)寶石文化熏陶的劉海在從藝二十多年里，一直專(zhuān)注于通過(guò)雕刻這種藝術(shù)形式，傳播藍(lán)寶石文化。世上無(wú)難事，只怕有心人。

基于歐美人群的研究[3,5]顯示，VH4-34+HCL 患者具備獨(dú)特的臨床特征，如初診時(shí)高白細(xì)胞數(shù)、低IGHV 突變率等。在本隊(duì)列中，VH4-34+HCL 也表現(xiàn)出高LDH 和β2-MG 水平等高腫瘤負(fù)荷特征，并與IGHV-UM 相關(guān)。事實(shí)上，VH4-34+腫瘤細(xì)胞在不同淋巴瘤中的IGHV 突變率也不盡相同。一項(xiàng)中國(guó)多中心CLL 患者IGHV 特征的研究[10]顯示，VH4-34+與高IGHV 突變率相關(guān)（P=0.001）。而本研究所顯示的VH4-34+在HCL 和HCL-v 患者中有更高未突變率（P＜0.001）與既往研究一致[3,5]。即綜合IGHV 片段使用和突變信息能夠提供更豐富的腫瘤細(xì)胞起源和演進(jìn)信息，有助于加深對(duì)特定組群患者疾病特征的理解。

IGHV 特征也是淋巴瘤的重要預(yù)后因素。目前，IGHV-UM 已在CLL、MCL 和DLBCL 等淋巴瘤中均被證實(shí)是不良預(yù)后因素[8,16,20]。而特定片段使用也與預(yù)后相關(guān)，如使用VH3-21 的突變型CLL 患者預(yù)后并未優(yōu)于未突變型CLL 患者等[21]。本研究中，VH4-34+和IGHV-UM 分別是HCL 和HCL-v 的不良預(yù)后因素。受限于病例數(shù)，本研究未進(jìn)一步行多因素預(yù)后分析確定這兩種疾病的獨(dú)立預(yù)后因素?？紤]到VH4-34+HCL 對(duì)克拉屈濱單藥不敏感及免疫化療在這兩種疾病中的有效性[3,22]，臨床上對(duì)VH4-34+HCL 患者宜首選核苷類(lèi)似物聯(lián)合利妥昔單抗治療，未來(lái)也應(yīng)繼續(xù)探索更優(yōu)治療策略。

由于疾病的罕見(jiàn)性，前期和本研究的部分發(fā)現(xiàn)仍有待更深入的探究。如VH4-34+HCL 所顯現(xiàn)的高腫瘤負(fù)荷、特定基因突變譜以及更差預(yù)后與VH4-34+HCL-v 存在明顯一致性，共同反映了VH4-34+腫瘤細(xì)胞的特殊起源及腫瘤演進(jìn)過(guò)程。對(duì)于這類(lèi)臨床表現(xiàn)、病理形態(tài)和免疫表型相似的淋巴瘤亞型，依據(jù)分子分型的診療模式或許優(yōu)于疾病分型，而該觀點(diǎn)的合理性還有賴(lài)于更多多組學(xué)研究的證據(jù)支持。此外，VH4-34+和IGHV-UM 均被認(rèn)為是HCL 和HCL-v的不良預(yù)后因素，而考慮到兩者的高度共現(xiàn)性，特定基因片段和IGHV 突變狀態(tài)的獨(dú)立預(yù)后意義有待被證實(shí)。

空氣源熱泵熱水系統(tǒng)具有高效節(jié)能、安全環(huán)保的巨大優(yōu)勢(shì)，雖然目前該系統(tǒng)還存在著一些缺陷，但隨著研究的深入，該系統(tǒng)必將成為未來(lái)最主要的熱水供應(yīng)形式之一。

綜上所述，本研究顯示中國(guó)HCL 和HCL-v 患者對(duì)VH4 基因家族，尤其是VH4-34 存在使用偏向性，而這類(lèi)患者更易為IGHV-UM。VH4-34+HCL 患者具有更高腫瘤負(fù)荷、更低BRAF V600E 突變的特征。同時(shí)，IGHV 的分子特征與HCL 和HCL-v 患者不同預(yù)后相關(guān)。