王文晴，馬 飛，王帆均，楊志遠，范 珊，竇桂芳，甘 慧，馮素香，孟志云

1河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046；2軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850；3長春金賽藥業(yè)有限責任公司，吉林 長春130000

良性前列腺增生（BPH）是中老年男性常見的泌尿系統(tǒng)疾病，前列腺異常增大導致尿路收縮，進而使排尿頻率增加、尿急和排尿遲緩，影響患者的日常生活，降低患者的生活質量［1］。據(jù)報道高達80%的人在50歲時有一定程度的前列腺腫大［2］。其發(fā)病機制復雜，已有研究表明，急性和慢性炎癥通過各種途徑刺激細胞生長，特別是氧化應激，從而促進BPH 的發(fā)展［3-6］。此外，在Minutoli等［7］的一項研究中，白藜蘆醇、硒和番茄紅素聯(lián)合使用可通過誘導Caspase3的表達促進細胞凋亡，從而有效地減輕睪酮誘導的BPH大鼠的前列腺重量和生長。治療良性前列腺增生的傳統(tǒng)藥物主要包括5-α還原酶抑制劑和α1-腎上腺素受體拮抗劑，但這兩種制劑均具有嚴重的副作用如陽痿、直立型低血壓、頭暈等，不適宜長期使用［8,9］。近些年來，植物提取物在前列腺增生治療方面的應用逐漸廣泛［10］。越來越多的BPH患者尋求使用天然、低毒的植物藥預防和治療良性前列腺增生。

文冠果花來源于無患子科文冠果屬植物文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）［11,12］?；ㄐ虼笄一ǘ涿?，課題組前期使用70%乙醇對文冠果花進行回流提取得到文冠果花提取物，采用高效液相色譜法測定其中成分，發(fā)現(xiàn)文冠果花提取物中含有多種黃酮類化合物，其中主要成分為異槲皮苷和蘆丁。異槲皮苷和蘆丁廣泛分布于飲食和藥用植物中，具有抗氧化、抗炎和抗增殖等多種生物學特性，并且主要通過多種信號通路誘導細胞凋亡和細胞周期停滯，表現(xiàn)出對惡性細胞的抑制作用［13-16］。因此，我們推測文冠果花提取物可能通過抗氧化、抗炎、誘導細胞凋亡等途徑發(fā)揮抑制良性前列腺增生的作用。已有研究表明,文冠果花總黃酮提取物對DPPH和ABTS的清除能力遠大于蘆丁,且對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有很強的抑制活性［17］。阿拉木斯［18］采用經(jīng)典藥理學方法建立BPH動物模型并對文冠果花水提物和醇提物的藥效進行了初步研究，研究發(fā)現(xiàn)文冠果花水提取物可以緩解大鼠前列腺的增生程度但作用機制尚不明確?；诖耍狙芯窟x擇良性前列腺增生細胞BPH-1進行體外活性研究，結合動物實驗探究文冠果花提取物對前列腺增生的影響及可能的機制，為開發(fā)治療良性前列腺增生的植物制劑提供潛在選擇。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 文冠果花提取物（軍事醫(yī)學研究院抗輻射藥物研究室自提）；Bcl-2、Bax、Caspase3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 抗體（Abcam）；ECL 發(fā)光液、BCA蛋白定量試劑（北京普利萊基因技術有限公司）。ES-2001P型電子天平（長沙湘平科技發(fā)展有限公司）；DZTW型調(diào)溫電熱套（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；LGJ-10D型凍干機（北京四環(huán)科學儀器廠有限公司）；BIO-TEK酶標儀（美谷分子儀器）；二氧化碳培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.1.2 實驗細胞與動物 人前列腺增生細胞（BPH-1）細胞株保存于軍事醫(yī)學研究院抗輻射藥物研究室；SPF級雄性SD大鼠36只，體質量180±10 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK（京）2016-0011]，飼養(yǎng)于軍事科學院軍事醫(yī)學研究院動物實驗中心，溫度控制在23±2 ℃，明暗循環(huán)12 h。動物飼養(yǎng)采用標準飲食和水，并在實驗開始前1周進行適應性喂養(yǎng)。所有實驗均按照軍事科學院軍事醫(yī)學研究院動物實驗倫理委員會的要求進行（實驗動物管理與使用審查編號：IACUC-DWZX-2020-503）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) BPH-1細胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，以備后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞生存率 將BPH-1細胞均勻分散于完全培養(yǎng)基，按照1×104/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁。棄去完全培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基。各組濃度分別為：125、250、500、1000 μg/mL，并設置不含藥的空白對照組。藥物分別作用細胞12、24、48 h 后，棄去上清液，每孔加入50 μL 1 mg/mL 的MTT 溶液，孵育4 h 后棄上清，每孔加入100 μL異丙醇，震蕩15 min至沉淀完全溶解。酶標儀于570 nm、650 nm（校準波長）處測定吸光度A。

1.2.3 Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡 細胞以2×105/孔接種于6 孔板中培養(yǎng)24 h，貼壁后更換含藥培養(yǎng)基給藥孵育24 h，各組濃度分別為：125、250、500、1000 μg/mL，并設置不含藥的空白對照組。使用胰酶消化并收集不同濃度藥物處理后的細胞，300 g 離心5 min棄去上清，用0.5 mL 1×Annexin V（膜聯(lián)蛋白V）結合緩沖液洗滌后再次以300 g離心5 min，棄去上清。用100 μL1×AnnexinV結合緩沖液重懸細胞，加入Annexin V-FITC5μL/管進行熒光素標記，避光孵育5min。每管加入10 μL PI（碘化丙啶）和400 μL 1×Annexin V 結合緩沖液繼續(xù)避光孵育10 min，用流式細胞儀檢測。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 細胞以2×105/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，貼壁后更換含藥培養(yǎng)基給藥孵育24 h，各組濃度分別為：125、250、500、1000 μg/mL，并設置不含藥的空白對照組。胰酶消化并收集細胞后300 g離心5 min 棄去上清，用70%酒精重懸分散細胞，孵育2 h。孵育結束后500 g 離心5 min棄上清，用2 mL 1×PBS重懸細胞，500 g離心5 min棄上清。每管加入400 μL PI 染色液和100 μL RNaseI（核糖核酸酶A），37 ℃避光孵育30 min。加入2 mL PBS洗滌細胞，500 g離心5 min棄上清。加入0.5 mL PBS重懸細胞，用流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western blot 法檢測BPH-1 細胞蛋白表達水平細胞以2×105/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，貼壁后更換含藥培養(yǎng)基，各組濃度分別為：空白對照組、500 μg/mL、1000 μg/mL。給藥孵育24 h后收集細胞，PBS洗滌3次后加入細胞裂解液在冰上裂解，12 000×g離心15 min收集上清液，使用BCA法測定蛋白濃度后，上清液加上樣緩沖液，100 ℃水浴15 min，-20 ℃保存。蛋白質樣品使用10%SDS-PAGE電泳分離，轉移到0.22 μm PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、Caspase3（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、p-PI3K（1∶500）、AKT（1∶1000）、p-AKT（1∶500）、β-Actin（1∶5000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入羊抗兔抗體（1∶5000）和羊抗鼠IgG抗體（1∶5000），室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，ECL發(fā)光顯影，Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度值。

1.2.6 動物模型的建立與分組 雄性正常SD 大鼠36只，隨機分為6組，異氟烷麻醉后，其中1組行手術處理作為空白對照，其余5組行去勢手術。術后恢復7 d，去勢大鼠連續(xù)28 d每日皮下注射丙酸睪酮5 mg/kg，假手術組皮下注射相同體積橄欖油溶液。注射后1 h，陽性藥物組給予非那雄胺5 mg/kg，文冠果花提取物低、中、高劑量組給藥劑量分別為50、200、600 mg/kg，假手術組給予等體積生理鹽水，每周稱體質量后調(diào)整給藥劑量，連續(xù)灌胃給藥28 d。

1.2.7 組織病理學檢查 給藥28 d后處死大鼠，取大鼠前列腺組織使用4%多聚甲醛固定48 h，脫水浸蠟，石蠟包埋后使用石蠟切片機切成4 μm組織切片，脫蠟后分別使用蘇木精和伊紅染色2 min，脫水封片并使用顯微鏡采集圖像并分析。

1.2.8 Western blot法檢測大鼠前列腺組織蛋白表達水平 稱取各組大鼠前列腺組織加入組織裂解液在冰上裂解，12 000×g離心15 min收集上清液，使用BCA法測定蛋白濃度后，上清液加上樣緩沖液，100 ℃水浴15 min，-20 ℃保存。蛋白質樣品使用10%SDS-PAGE電泳分離，轉移到0.22 μm PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、Caspase3（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、p-PI3K（1∶500）、AKT（1∶1000）、p-AKT（1∶500）、β-Actin（1∶5000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入羊抗兔抗體（1∶5000）和羊抗鼠IgG抗體（1∶5000），室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，ECL發(fā)光顯影，Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結果采用均數(shù)±標準差表示。組間差異分析采用t檢驗，當P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.2PASI評分 在進行治療前,兩組PASI分數(shù)接近,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在經(jīng)過治療后,兩組病患的分數(shù)都有所下降,研究組比對照組的分數(shù)更低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2 結果

2.1 文冠果花提取物對BPH-1細胞生存率的影響

藥物濃度在125 μg/mL時，藥物處理12 h未見抑制作用，隨著藥物干預時間的延長，逐漸表現(xiàn)出抑制作用，細胞存活率降低至82.8%，且隨著給藥濃度從125 μg/mL增加至1000 μg/mL，細胞存活率出現(xiàn)明顯的下降趨勢，同一時間不同濃度給藥組組間存活率下降出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（P＜0.05），細胞存活率與給藥濃度和給藥時間呈負相關（圖1）。

圖1 文冠果花提取物對BPH-1細胞存活率的影響Fig.1 Effect of the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge on cell proliferation of BPH-1 cells(n=6,*P＜0.05).

2.2 文冠果花提取物對BPH-1細胞凋亡率的影響

與空白對照組相比，給藥濃度125 μg/mL時，凋亡率無統(tǒng)計學差異，隨著給藥濃度的進一步增加，細胞的早期和晚期凋亡程度相應增加，凋亡率明顯升高（圖2）。

圖2 文冠果花提取物對BPH-1細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge on apoptosis of BPH-1 cells.**P＜0.01 vs control group(n=3).

2.3 文冠果花提取物對BPH-1細胞周期的影響

與空白對照組相比，經(jīng)藥物處理過的BPH-1細胞G0/G1期比率上升，且G0/G1期比率與給藥濃度呈正相關。S期比率下降，與給藥濃度呈負相關。而G2/M期變化不具有統(tǒng)計學意義（圖3）。

圖3 文冠果花提取物對BPH-1細胞周期的影響Fig.3 Effect of the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge on cell cycle of BPH-1 cells.*P＜0.05 vs control group(n=3).

2.4 文冠果花提取物對BPH-1 細胞中Bcl-2/Bax/Caspase3的蛋白表達水平的影響

與空白對照組相比，BPH-1細胞在文冠果花提取物作用24 h后，Bax和Caspase3蛋白表達水平顯著提高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平明顯下調(diào)（P＜0.05），隨著給藥濃度從500 μg/mL 提升至1000 μg/mL，Bax 和Caspase3蛋白表達水平提升以及Bcl-2蛋白表達水平的下調(diào)的趨勢進一步加大（圖4）。

圖4 文冠果花提取物對BPH-1細胞Bcl-2/Bax/Caspase3蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge on protein express levels of Bcl-2/Bax/Caspase3 in BPH-1 cells by Western blotting.A:Bcl-2,Bax and Caspase3 expressions by Western blotting.B: The relative expression of Bcl-2,Bax and Caspase3.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group(n=3).

2.5 文冠果花提取物對BPH-1細胞中PI3K/AKT蛋白表達水平的影響

與空白對照組相比，BPH-1細胞在文冠果花提取物作用24 h后，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值顯著降低（P＜0.05），隨著給藥濃度從500 μg/mL 提升至1000 μg/mL，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值降低的趨勢進一步加大（圖5）。

圖5 文冠果花提取物對BPH-1細胞PI3K/AKT蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge on protein express levels of PI3K/AKT in BPH-1 cells by Western blotting.A: PI3K,p-PI3K,AKT and p-AKT expressions by Western blotting.B: The relative expression of PI3K.C:The relative expression ofAKT.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group(n=3).

2.6 文冠果花提取物對大鼠前列腺病理組織切片

假手術組大鼠前列腺組織內(nèi)腺體結構較緊密，未見炎癥細胞浸潤；腺體上皮細胞層厚度正常，排列整齊，未見脫落。模型組大鼠前列腺組織內(nèi)部分大量腺體上皮細胞增生，上皮細胞呈乳頭狀突起。陽性組大鼠前列腺組織中部分腺體腺腔內(nèi)可見炎性細胞彌散性浸潤。文冠果花提取物低劑量組大鼠前列腺組織內(nèi)部分腺體上皮細胞增生，上皮細胞層增厚，部分腺體腔內(nèi)可見炎性細胞彌散性浸潤。文冠果花提取物中劑量組大鼠前列腺組織內(nèi)部分腺體上皮細胞增生，上皮細胞層增厚，部分上皮細胞水腫，細胞腫脹、胞漿淡染。文冠果花提取物高劑量組大鼠前列腺組織內(nèi)局部腺體間隙增大，未見明顯炎癥細胞浸潤，部分腺體上皮細胞脫落（圖6）。

圖6 大鼠前列腺組織的病理變化Fig.6 Histopathological changes of rat prostate tissue(HE staining,scale bar=100 μm).C:sham operation group.M:model group.F:positive group.FL:low dose group of the flower extract.FM:medium dose group.FH:high dose group.Red arrows:Epithelial cell hyperplasia.Black arrows:Diffuse infiltrates of inflammatory cells.Blue arrows:Epithelial cells fall off.

2.7 文冠果花提取物對大鼠前列腺組織中Bcl-2/Bax/Caspase3蛋白表達水平的影響

與假手術組相比，模型組Bax和Caspase3蛋白表達量顯著降低（P＜0.01），Bcl-2蛋白量顯著提高（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥物組和文冠果花提取物低中高劑量組Bax和Caspase3蛋白表達水平顯著提高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平明顯下調(diào)（P＜0.05），隨著文冠果花提取物給藥劑量增大，Bax和Caspase3蛋白表達水平提升以及Bcl-2蛋白表達水平的下調(diào)的趨勢進一步加大（圖7）。

圖7 文冠果花提取物對大鼠前列腺組織中Bcl-2/Bax/Caspase3蛋白表達水平的影響Fig.7 Effects of drugs on the expression level of Bcl-2/Bax/Caspase3 protein in prostate tissue of rats in each group.A:Bcl-2,Bax and Caspase3 expressions by Western blotting.B: The relative expression of Bcl-2.C: The relative expression of Bax.D: The relative expression of Caspase3.*P＜0.05,**P＜0.01 vs model group(n=3).

2.8 文冠果花提取物對大鼠前列腺組織中PI3K/AKT蛋白表達水平的影響

與假手術組相比，模型組p-PI3K、p-AKT蛋白表達量顯著增大（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥物組p-PI3K和p-AKT表達水平均顯著降低（P＜0.01），文冠果花提取物高劑量組中p-PI3K和p-AKT表達水平降低（P＜0.05，P＜0.01），文冠果花提取物低劑量組和中劑量組p-AKT表達水平降低（P＜0.05，圖8）。

圖8 文冠果花提取物對大鼠前列腺組織中PI3K/AKT蛋白表達水平的影響Fig.8 Effects of drugs on the expression level of PI3K/AKT protein in prostate tissue of rats in each group.A:PI3K,p-PI3K,AKT and p-AKT expressions by Western blotting.B:The relative expression of PI3K.C:The relative expression of AKT.*P＜0.05,**P＜0.01 vs model group(n=3).

3 討論

前期許多研究結果表明，當良性前列腺增生發(fā)生時，前列腺組織往往會伴隨著細胞的異常增殖［19,20］。抑制前列腺細胞的異常增殖，促進其凋亡是治療良性前列腺增生的一種方式。本研究結果表明，文冠果花提取物能有效降低BPH-1細胞的存活率，提示文冠果花提取物對良性前列腺增生細胞具有抑制作用，這種抑制作用可能與文冠果花提取物調(diào)控細胞周期和促進細胞凋亡有關。

凋亡是由多基因介導的細胞程序性死亡，也是細胞增殖抑制的重要原因［21］。細胞凋亡的程序異常是導致良性前列腺增生的另一因素。本研究結果表明，BPH-1細胞經(jīng)文冠果花提取物處理24 h后，凋亡水平顯著增加，隨給藥濃度增加，可顯著提高早期凋亡水平，提示誘導凋亡可能是文冠果花提取物發(fā)揮抗良性前列腺增生疾病的作用方式。

前列腺基質細胞和上皮細胞的生長和分裂均受細胞周期的調(diào)節(jié)［22］。細胞周期可分為四個階段：DNA合成前期（G1）、DNA合成期（S）、DNA合成后期（G2）和細胞分裂期（M），G1期涉及控制細胞周期進程的主要信號通路［23］。本研究結果顯示，文冠果花提取物處理過的BPH-1細胞G0/G1期細胞百分比顯著上升，S期細胞百分比明顯下降，這些結果表明，文冠果花提取物通過G0/G1期的細胞周期阻滯來抑制細胞增殖。

良性前列腺增生細胞中觀察到的抗凋亡因子Bcl-2的減少和凋亡因子Bax的增加可能是由于前列腺組織增生的抑制［19,24］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路影響各種細胞生物學過程，如增殖、生長、細胞凋亡和細胞骨架重排［25,26］，而AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，作為主要的細胞內(nèi)信號通路發(fā)揮重要作用［27］。細胞凋亡的機制可由細胞應激引起，主要分為外在和內(nèi)在的凋亡途徑［27,28］。Caspase-9 激活是內(nèi)在凋亡途徑過程中必不可少的起始蛋白。在內(nèi)在途徑中，caspase-9 的活性形式通過刺激效應caspase 執(zhí)行者（如caspase-3 和caspase-7）介導細胞凋亡事件［29,30］。從實驗中可以觀察到，文冠果花提取物上調(diào)BPH-1細胞中Bax和Caspase3的表達水平，下調(diào)Bcl-2的表達水平，同時下調(diào)PI3K/AKT蛋白的磷酸化水平，提示文冠果花提取物通過調(diào)控PI3K/AKT 和Bcl-2/Bax/Caspase3 信號通路來抑制BPH-1細胞的異常增殖進而抑制良性前列腺增生。

我們進一步通過動物實驗驗證文冠果花提取物對良性前列腺增生的抑制作用。前列腺增生機制可能與前列腺中的DHT積累有關，DHT與核激素受體結合并刺激細胞生長。大多數(shù)增生由腺體增生引起，但間質也會增厚［31,32］。組織病理學結果表明，與假手術組相比，BPH大鼠的前列腺組織病理學顯示上皮增生，上皮厚度增加。與睪酮誘導的BPH大鼠相比，經(jīng)文冠果花提取物處理的大鼠前列腺上皮增生狀態(tài)減輕，上皮厚度降低。然后我們進一步對前列腺組織蛋白表達水平進行分析，結果表明，文冠果花提取物組大鼠前列腺組織中PI3K/AKT信號通路磷酸化水平下調(diào)，Bcl-2表達水平下調(diào)，Bax和Caspase3蛋白表達水平上升，這一變化趨勢與細胞蛋白表達趨勢相符，進一步驗證文冠果花提取物在減輕前列腺增生方面非常有效且通過該通路介導對良性前列腺的抑制。

綜上所述，文冠果花提取物在細胞水平上抑制了BPH-1細胞的增生，動物水平上顯著改善了睪酮誘導的大鼠良性前列腺增生的組織病理狀態(tài)，這種抑制作用受PI3K/AKT和Bcl-2/Bax/Caspase3信號通路介導，這種作用結果可能與文冠果花提取物中含有的抗增殖和抗腫瘤的黃酮類成分有關，后期我們將對文冠果花提取物的活性成分進行驗證。