鐘江龍，王潔琪，葉秀華，范 松，王友元，陳偉良

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 廣州510120

頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是口腔癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式，也是影響患者預(yù)后的重要因素。舌鱗癌是最常見(jiàn)的口腔癌，由于舌體淋巴引流豐富且舌的運(yùn)動(dòng)頻繁，舌鱗癌發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性尤為突出［1］。前哨淋巴結(jié)中是否發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞是對(duì)癌癥患者預(yù)后評(píng)估的關(guān)鍵預(yù)測(cè)指標(biāo)［2］。淋巴脈管系統(tǒng)曾被認(rèn)為在對(duì)抗腫瘤轉(zhuǎn)移中起到積極作用，然而基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床病理研究已經(jīng)證實(shí)腫瘤周圍淋巴管發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化有利于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這些動(dòng)態(tài)變化包括淋巴管增生和淋巴管的擴(kuò)張，主要發(fā)生在腫瘤或腫瘤的周圍。這些淋巴管的改變被認(rèn)為是有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管道［3-6］。關(guān)于通向前哨淋巴結(jié)的二級(jí)淋巴管擴(kuò)張的發(fā)生過(guò)程，有學(xué)者認(rèn)為主要是由于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，但也有觀點(diǎn)認(rèn)為主要是淋巴管相關(guān)的平滑肌細(xì)胞的改變所致。但是這些觀點(diǎn)都認(rèn)為這些淋巴管的改變是利于腫瘤細(xì)胞播散的［7,8］。更重要的是，腫瘤引流區(qū)域淋巴結(jié)相關(guān)的淋巴管增生將增加腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)［9］。

除了VEGFR2/VEGFR3信號(hào)通路還有其他幾種信號(hào)通路對(duì)淋巴系統(tǒng)的發(fā)育有一定的影響作用，比如有文獻(xiàn)報(bào)道CCBE1是斑馬魚胚胎期重要的淋巴管生成因子，但其在腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移中是否起一定作用尚不明確［10］。CCBE1是一種新發(fā)現(xiàn)的淋巴管生成因子，其機(jī)制可能是CCBE1 能顯著增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGF-C）的表達(dá)，從而促進(jìn)淋巴管的生成［11］。文獻(xiàn)報(bào)道CCBE1的缺失可以引起淋巴管生成的障礙，比如人的CCBE1基因突變與Hennekam綜合征有關(guān)，這是一種全身性淋巴發(fā)育不良的疾病，伴有嚴(yán)重的全身淋巴水腫［23］。此外CCBE1被報(bào)道為心血管發(fā)育中的一個(gè)重要蛋白，尤其是與冠狀動(dòng)脈的形成關(guān)系密切［29-31］。目前對(duì)于CCBE1 在腫瘤轉(zhuǎn)移中所起的作用尚不清楚［12］。本研究旨在探究CCBE1在舌鱗癌癌旁組織中的表達(dá)與癌周淋巴管增生、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 受試者

本研究經(jīng)中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。本研究受試者納入標(biāo)準(zhǔn)為：所有患者為初次病理確診的舌鱗癌，術(shù)前行臨床捫診、B超及CT/MRI檢查為T1-2N0M0，采用2010年AJCC臨床分期標(biāo)準(zhǔn)；患者年齡16歲至78歲；體力狀況分級(jí)（ZPS）0～2級(jí)，卡式評(píng)分（KPS）≥60；患者自愿參加本研究并簽署知情同意書；所有患者均無(wú)頭頸癌手術(shù)治療史及放化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)為：已有頸淋巴轉(zhuǎn)移的中晚期舌鱗癌患者；年齡低于16歲及高于78歲的患者；有頭頸癌手術(shù)治療史及放化療史的患者；因精神心理因素?zé)o法生活自理的患者。

按照以上納入標(biāo)準(zhǔn)本研究納入了2014年4月1日～2015年6月30日于我院口腔頜面外科接受診治的44名cT1-2N0舌鱗癌患者?；颊咂骄挲g56.9歲（28～76歲），其中男26名，女18名。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 對(duì)該44例舌鱗癌癌旁組織病理切片標(biāo)本進(jìn)行淋巴管密度定量分析 采用D2-40作為淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物標(biāo)定淋巴管并進(jìn)行計(jì)數(shù)［13］。淋巴管密度（LVD）定量分析方法［14］：先在低倍鏡（×100）下選擇淋巴管最豐富區(qū)域，在高倍鏡下計(jì)數(shù)5 個(gè)視野的淋巴管數(shù)，取其均值作為該切片的淋巴管密度（LVD）。將淋巴管密度高的22例納入A組，淋巴管密度相對(duì)低的22例納入B組。

1.2.2 使用免疫組化的方法對(duì)兩組標(biāo)本中膠質(zhì)和鈣結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子域1（CCBE1）這個(gè)因子的表達(dá)情況進(jìn)行了測(cè)定 免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［15］：（參照Monteiro標(biāo)準(zhǔn)）高倍鏡（×400）下取5個(gè)不同視野；染色強(qiáng)度：無(wú)，0 分；弱（淡黃色），1 分；中（棕黃色），2 分；強(qiáng)（黃褐色），3 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：＜10%，0分；10%～25%，1分；25%～49%，2分；50%～75%，3分；＞75%，4分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘為該視野評(píng)分值，5個(gè)視野平均得分為該切片最終得分。將評(píng)分值≤5分定為陰性（低表達(dá)），＞5 分定為陽(yáng)性（高表達(dá)）。

免疫熒光“雙標(biāo)”實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組舌鱗癌癌旁組織病理切片標(biāo)本CCBE1的表達(dá)分布區(qū)域與淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物D2-40表達(dá)區(qū)域是否接近。Western blot 檢測(cè)兩組舌鱗癌癌旁組織標(biāo)本中CCBE1與VEGF-C蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 選取2009年6月～2011年6月中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔頜面外科經(jīng)手術(shù)切除的90例舌鱗狀細(xì)胞癌病理標(biāo)本，免疫組化檢測(cè)CCBE1的表達(dá)量，并完善隨訪信息，隨訪截止日期2015年12月30日。將90例患者的年齡、性別、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、CCBE1表達(dá)、T分期、腫瘤分化程度等因素分別采用單因素Cox回歸分析。如果單因素回歸分析結(jié)果有意義（P＜0.05），再將其納入多因素Cox回歸模型檢驗(yàn)其對(duì)患者術(shù)后生存率的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用的統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 17.0（SPSS,IBM Corp.,Armonk,NY,USA），兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線進(jìn)行生存分析，對(duì)影響患者預(yù)后的多種因素采用Cox回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者年齡、性別、腫瘤大小、分化程度和T分期

兩組臨床資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，P＞0.05）。

表1 44名舌鱗癌患者臨床資料Tab.1 Clinical data of 44 patients with tongue squamous cell carcinoma(TSCC)

2.2 免疫組化

根據(jù)免疫組化結(jié)果可明顯發(fā)現(xiàn)（圖1）：A組淋巴管普遍呈稀疏分布，B組淋巴管則分布相對(duì)密集。

圖1 以D2-40作為淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物在A、B兩組中標(biāo)記出淋巴管的情況Fig.1 Immunohistochemistry of the adjacent tissues of TSCC showing lymphatic vessels labeled with D2-40 as the lymphatic vessel endothelial marker in groups A and B(DAB method).A,B：Lymphatic vessels in group A are more sparse.C,D:Group B has relatively dense lymphatic vessels.

同時(shí)我們也對(duì)兩組標(biāo)本中膠質(zhì)和鈣結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子域1（CCBE1）這個(gè)因子的表達(dá)情況進(jìn)行了測(cè)定（圖2），可見(jiàn)CCBE1多表達(dá)于胞質(zhì)中，呈黃褐色。A組中有11例的CCBE1高表達(dá)，11例低表達(dá)，高表達(dá)率為50%；B組CCBE1高表達(dá)21例，低表達(dá)1例，高表達(dá)率為95.4%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 CCBE1在A、B兩組中的表達(dá)情況Fig.2 Immunohistochemistry for detecting CCBE1 expression in groups Aand B(DAB method).A,B:CCBE1 is lowly expressed in group A.C,D:CCBE1 is highly expressed in group B.

2.3 免疫熒光

免疫熒光“雙標(biāo)”實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CCBE1的表達(dá)分布區(qū)域與淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物D2-40表達(dá)區(qū)域接近，甚至可發(fā)現(xiàn)一定的“共定位”現(xiàn)象（圖3）。

圖3 CCBE1與VEGF-C免疫熒光“雙標(biāo)”實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of CCBE1 and VEGF-C immunofluorescence double-labeling assay(Original magnification: ×100).A:Dapi dyed nuclei.B:CCBE1 expression in paraneoplastic tissues showing red fluorescence.C:D2-40 labeling of the lymphatic vessels in paracancerous tissue showing green fluorescence.D:CCBE1 and D2-40 are expressed in close proximity to each other,and yellow colored co-localized regions can be seen.

2.4 Western blot

Western blot 檢測(cè)兩組CCBE1與VEGF-C蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，A組CCBE1和VEGF-C蛋白表達(dá)量均明顯低于B組（圖4，P＜0.001）。

圖4 Western blot檢測(cè)A、B兩組CCBE1和VEGF-C的表達(dá)Fig.4 Western blotting for detecting CCBE1 and VEGF-C expressions in groups A and B.A: VEGF-C and CCBE1 protein expression in TSCC detected by Western blotting.B,C:Quantitative analysis of VEGF-C and CCBE1 protein expression levels.***P＜0.001.

2.5 免疫組化檢測(cè)CCBE1表達(dá)量與舌鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

90 例標(biāo)本中，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有30 例，其中CCBE1高表達(dá)者28例，CCBE1低表達(dá)者2例；未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的60 例，其中CCBE1 高表達(dá)者21 例，CCBE1 低表達(dá)者39 例；轉(zhuǎn)移組CCBE1 高表達(dá)率為93.3%，未轉(zhuǎn)移組CCBE1 高表達(dá)率為35.0%，兩組CCBE1高表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，圖5，表2）。根據(jù)隨訪信息（失訪8例），CCBE1高表達(dá)組中存活者13例，死亡33例；CCBE1低表達(dá)組中存活29例，死亡7例；所以CCBE1 高表達(dá)組患者的五年生存率為28.2%，CCBE1低表達(dá)組患者五年生存率為80.6%，兩組患者五年生存率有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），從繪制的生存曲線圖也可直觀地看出兩組間生存預(yù)后的差別（圖6）。

圖6 生存分析Fig.6 Overall survival(A)and five-year survival rate(B)of 90 patients with TSCC.The five-year survival rate was significantly higher in low CCBE1 expression group than in high CCBE1 expression group(80.6%vs 28.2%,P＜0.05).

表2 90例舌鱗癌標(biāo)本中CCBE1的表達(dá)情況Tab.2 Expression of CCBE1 and survival outcomes in 90 patients with TSCC

圖5 90例標(biāo)本中CCBE1的表達(dá)情況Fig.5 Immunohistochemistry for CCBE1 expression in specimens from 90 TSCC cases(DAB method).A,B:CCBE1 is lowly expressed in non-metastatic group.C,D:CCBE1 is highly expressed in lymph node metastasis group.

將90 例患者的年齡、性別、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、CCBE1表達(dá)、T分期、腫瘤分化程度等因素分別采用單因素Cox回歸分析。如果單因素回歸分析結(jié)果有意義（P＜0.05），再將其納入多因素Cox回歸模型檢驗(yàn)其對(duì)患者術(shù)后生存率的影響，本文所有比較均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cox 回歸分析結(jié)果顯示CCBE1表達(dá)和T分期為本組90例舌鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（P＜0.05，表3）。

表3 90例舌鱗癌患者的預(yù)后影響因素的Cox回歸分析結(jié)果Tab.3 Results of Cox regression analysis of prognostic factors in 90 patients with TSCC

3 討論

認(rèn)識(shí)到淋巴管增生和淋巴管的重塑改變?cè)谀[瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用使得阻斷淋巴管增生信號(hào)通路以阻斷腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)得到重視。阻斷淋巴管增生的信號(hào)通路無(wú)疑將是限制腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的有效治療手段［16］。腫瘤相關(guān)的淋巴管增生和淋巴管重構(gòu)有賴于復(fù)雜但協(xié)調(diào)有序的細(xì)胞性活動(dòng)，包括增殖、萌發(fā)、遷移和小管形成等［17］，這些程序和血管形成的過(guò)程非常類似［18］。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生成、增殖和遷移是淋巴管增生的核心環(huán)節(jié)，該過(guò)程依賴于由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGF-C）或者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D(VEGF-D)所驅(qū)動(dòng)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3（VEGFR3）信號(hào)通路，VEGF-C和VEGF-D可作用于蛋白激酶C依賴的細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1（ERK1）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶2（ERK2）信號(hào)通路的激活蛋白激酶AKT的磷酸化作用［19-22］。此外VEGFR3的共受體神經(jīng)氈蛋白2（NRP2）也可因?yàn)槭艿絍EGF-C和VEGF-D的作用而調(diào)控上述通路［7］。這些調(diào)控淋巴管增生的信號(hào)通路與VEGFR2和神經(jīng)氈蛋白1（NRP1）介導(dǎo)的VEGF-A 信號(hào)通路調(diào)控血管生成非常類似。

目前關(guān)于CCBEl在腫瘤中的作用尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)CCBEl基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑及遷移功能，其表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和存活［24］。但也有研究者發(fā)現(xiàn)CCBEl在卵巢癌細(xì)胞株和卵巢原發(fā)癌中顯著下調(diào)。Bos等［25］發(fā)現(xiàn)人類CCBEl基因編碼蛋白能夠顯著增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGF-C）介導(dǎo)的淋巴管生成，認(rèn)為該基因在哺乳動(dòng)物淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞出芽及遷移過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A組中CCBE1的高表達(dá)率為50%，B組CCBE1高表達(dá)率為95.4%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CCBE1的表達(dá)跟淋巴管的增生密切相關(guān)。免疫熒光“雙標(biāo)”實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CCBE1的表達(dá)分布區(qū)域與淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物D2-40表達(dá)區(qū)域接近，甚至可發(fā)現(xiàn)一定的“共定位”現(xiàn)象，進(jìn)一步說(shuō)明了CCBE1可能在淋巴管的生長(zhǎng)發(fā)育中起了重要作用。本研究的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CCBEl與VEGF-C蛋白在舌鱗癌組織中的高表達(dá)，均與癌旁淋巴管增生情況密切相關(guān)，而且CCBEl表達(dá)與VEGF-C表達(dá)呈正相關(guān)，提示CCBEl可能通過(guò)誘導(dǎo)VEGF-C表達(dá)上調(diào)參與舌鱗癌癌旁組織中淋巴管的增生。然而有意思的是不同文獻(xiàn)報(bào)道的CCBE1在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用是相互矛盾的。最早有報(bào)道稱，CCBE1在卵巢癌和乳腺癌中的表達(dá)是下調(diào)的，CCBE1的缺失被證實(shí)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，因而其被認(rèn)為是一種抑癌因子［24,25］。而最近則有研究發(fā)現(xiàn)CCBE1通過(guò)促進(jìn)腫瘤的血管增生使其對(duì)伊馬替尼產(chǎn)生耐藥性［26,27］。另外一項(xiàng)臨床病理研究報(bào)告稱CCBE1在結(jié)腸癌中的高表達(dá)與較差的預(yù)后有相關(guān)性［28］。從本研究的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，CCBE1確實(shí)與癌周的淋巴管增生高度相關(guān)，而舌鱗癌主要通過(guò)增生的淋巴管向頸部轉(zhuǎn)移，因而我們傾向于推測(cè)CCBE1的高表達(dá)是促進(jìn)舌鱗癌轉(zhuǎn)移，這也意味著其與患者較差的預(yù)后可能相關(guān)。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)90名舌鱗癌患者CCBE1表達(dá)情況的免疫組化檢測(cè)及對(duì)患者的隨訪觀察，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及隨訪結(jié)果的分析證實(shí)了CCBE1的表達(dá)情況與舌鱗癌患者是否發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組30例，頸淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組60例，轉(zhuǎn)移組CCBE1的高表達(dá)率較高，兩組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯然CCBE1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生具有密切相關(guān)的聯(lián)系；因而CCBE1高表達(dá)的病例生存預(yù)后較差是合乎邏輯的，本研究中死亡組CCBE1的高表達(dá)率也高于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步印證了這一推論。將90例患者的年齡、性別、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、CCBE1表達(dá)、T分期、腫瘤分化程度等因素分別采用單因素Cox回歸分析，分析結(jié)果顯示CCBE1表達(dá)和T分期為本組90例舌鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。這進(jìn)一步證實(shí)了我們的推測(cè)：CCBE1通過(guò)激活舌鱗癌癌周淋巴管的增生，促使舌鱗癌通過(guò)淋巴管向頸部轉(zhuǎn)移，從而影響患者的生存預(yù)后。

綜上所述，我們可以認(rèn)為CCBE1在舌鱗癌中的表達(dá)與癌周淋巴管的增生情況、患者是否發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的生存預(yù)后情況都密切相關(guān)，因而我們認(rèn)為CCBE1的檢測(cè)將有望成為判斷舌鱗癌患者預(yù)后的一個(gè)新指標(biāo)。