譚延肖,韓梅梅,鄭現(xiàn)和,石 瑩,徐文勝,李騰飛,杜夢揚

(德州市農(nóng)業(yè)科學研究院,德州 253000)

植物生長調(diào)節(jié)劑是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的化學合成物質(zhì),能在較低濃度下發(fā)揮作用,促進或抑制植物生長發(fā)育。通過刺激或抑制植物內(nèi)源激素產(chǎn)生,調(diào)節(jié)植物生長或改變局部組織的微觀結(jié)構(gòu);通過調(diào)節(jié)植物中核酸、蛋白質(zhì)和酶的合成,調(diào)控植物生長的不同階段或改變植株形態(tài)[1]。研究表明,植物生長調(diào)節(jié)劑還可以影響酚類、萜類以及含氮化合物等生物活性成分在植物體內(nèi)的合成,對植物次生代謝進行調(diào)控[2]。Anastasia等[3]研究表明,扁豆植物的生長、產(chǎn)量、抗氧化活性和酚類物質(zhì)含量都會受植物生長調(diào)節(jié)劑的影響。傅華龍等[4]指出,一些植物生長調(diào)節(jié)劑能提高植物蛋白、糖等含量,增強植物的抗寒性、抗旱性、抗鹽堿性和抗蟲性。其中,植物生長調(diào)節(jié)劑對果樹的影響主要表現(xiàn)在調(diào)控營養(yǎng)生長和花芽分化,促進插條生根,提高果樹抗逆性,影響果實的生長、成熟、品質(zhì)和耐貯性等方面[5]。

“碧護”是德國科學家研制的一種植物源生長調(diào)節(jié)劑,內(nèi)含赤霉素、蕓苔素內(nèi)酯、吲哚乙酸、脫落酸、茉莉酮酸等8種植物內(nèi)源激素,10余種黃酮類催化平衡成分,20余種氨基酸和抗逆誘導劑等[6]。具有打破休眠、促進生根、強壯樹體、促進坐果、改善品質(zhì)、促進早熟、提高植株抗逆性等功能[7]。近年來,“碧護”在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于糧食[8]、蔬菜[9]、水果[10-12]、茶葉[13-14]、棉油[15]等作物生產(chǎn)中,大幅度提升了農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究以富士蘋果葉片為試材,采用黑暗誘導方式,探究施加“碧護”對蘋果葉片衰老的影響,以期為“碧護”在生產(chǎn)中用于調(diào)控植株衰老提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥劑“碧護”(0.136%蕓苔素·吲哚乙酸·赤霉酸)為德國阿格福萊農(nóng)林環(huán)境生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)。植物材料為栽植于試驗基地內(nèi)(北緯36°24′、東經(jīng)115°45′)的樹齡5年的紅富士蘋果植株。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

田間采集葉位相同、生長一致的富士蘋果當年生枝條成熟葉片,自來水沖洗后,無菌水沖洗3遍,葉柄末端用脫脂棉包裹,置于溫度21—23℃,空氣相對濕度70%的培養(yǎng)箱中。試驗設(shè)置對照組(CK,噴施蒸餾水)、處理組1(CL1,噴施“碧護”,原液稀釋15 000倍)和處理組2(CL2,噴施“碧護”,原液稀釋8 000倍),分別于光下[光照強度120 μmol∕(m2·s)]和黑暗下處理16 d,分別于0 d、4 d、8 d、12 d、16 d收集樣品,-80℃保存,備用。各處理重復3次。

1.2.2 葉綠素及可溶性蛋白含量測定

葉綠素用80%丙酮萃取,測定方法參考Li等[16]。取0.5 g葉片,投入10 mL 80%丙酮中,避光浸提24 h,用UV-2550分光光度計,分別測定波長663 nm、645 nm和470 nm下的吸光值,計算葉綠素含量。

可溶性蛋白的提取和測定方法參考Bradford[17]。取0.5 g葉片,加入2%(m∕V)聚乙烯吡咯烷酮和1.0 mL 50 mmol∕L的磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7.8,含1 mmol∕L EDTA-Na2和11% Triton X-100)研磨成勻漿。12 000 r∕min、4℃離心20 min,取上清,測定可溶性蛋白含量。

1.2.3 基因表達分析

PAO和SAG12基因表達水平通過實時熒光定量PCR進行檢測[18]。以MpActin為內(nèi)參基因,每5個處理葉片混合為1個樣本,提取RNA,進行3次生物學重復。

1.2.4 H2O2和MDA含量測定

H2O2的提取和測定方法參考王平[19]。在410 nm處測量吸光值,并根據(jù)由UV-2550分光光度計獲得的標準曲線計算H2O2濃度。

MDA含量測定方法參考Heath等[20]。取0.5 g葉片,加入1.5 mL預冷的0.1%(w∕v)TCA溶液充分研磨,12 000 r∕min、4℃離心20 min;取0.5 mL上清,加入1 mL 0.65%硫代巴比妥酸(TBA),沸水浴30 min;冰中終止反應(yīng),5 000 r∕min、4℃離心10 min。用UV-2550分光光度計分別測定532 nm和600 nm下的吸光值,計算MDA含量。

1.2.5 抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性測定

取0.5 g葉片,加入2%(m∕V)聚乙烯吡咯烷酮和1.5 mL 50 mmol∕L的磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7.8,含1 mmol∕L EDTA-Na2和11% Triton X-100)研磨成勻漿。12 000 r∕min、4℃離心20 min,取上清,測定過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性,測定方法參考殷麗華[21]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,使用Sigma Plot軟件作圖,并應(yīng)用獨立樣本的t檢驗對變量進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 “碧護”對黑暗誘導的蘋果葉片衰老過程的影響

葉片衰老是植物發(fā)育過程中重要的生命現(xiàn)象,通常利用黑暗誘導離體葉片衰老[22]。由圖1可知,黑暗下16 d后未噴施“碧護”的葉片已經(jīng)明顯失綠黃化,而噴施“碧護”的處理組葉片變化不明顯。通過測定它們的葉綠素含量和可溶性蛋白含量也驗證了這一現(xiàn)象。黑暗下處理16 d后,對照組葉片中的葉綠素和可溶性蛋白含量明顯下降,而在處理組葉片中仍保持較高的水平(圖2)。

圖1 “碧護”對黑暗誘導蘋果葉片衰老的影響Fig.1 Effects of “Bihu” on dark-induced senescence of apple leaves

圖2 “碧護”對黑暗誘導蘋果葉片衰老過程中葉綠素和可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effects of “Bihu” on the contents of chlorophyll and soluble protein during dark-induced senescence of apple leaves

2.2 蘋果葉片衰老相關(guān)基因PAO和SAG12表達情況

PAO基因與葉綠素降解相關(guān);SAG12是一個衰老過程特異表達的半胱氨酸蛋白酶基因。PAO和SAG12基因的表達水平在處理16 d的對照組中明顯上調(diào),而在處理組葉片中仍保持較低的水平(圖3)。

圖3 “碧護”對黑暗誘導蘋果葉片衰老過程中PAO和SAG12基因表達的影響Fig.3 Effects of “Bihu” on the expression of PAO and SAG12 genes during dark-induced senescence of apple leaves

2.3 蘋果葉片H2O2和MDA水平的變化

H2O2的積累是葉片衰老的一個表現(xiàn),同時H2O2的積累也會加速葉片的衰老進程。由圖4-A所示,光照條件下,對照組和處理組葉片內(nèi)H2O2的積累量都保持在較低的水平,而黑暗處理誘導H2O2大量積累,但處理組葉片中積累的H2O2相對較少(圖4-A)。

植物體積累的活性氧(ROS)可以直接與氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生反應(yīng),導致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的增加。黑暗下,對照組和處理組葉片中MDA的含量均有明顯升高,但處理組中MDA的積累量比對照組明顯要低(圖4-B)。這表明,噴施“碧護”可以有效緩解黑暗誘導的葉片衰老過程中膜脂過氧化損傷。

圖4 “碧護”對黑暗誘導蘋果葉片衰老過程中H2O2和MDA含量的影響Fig.4 Effects of “Bihu” on the contents of H2O2 and MDA in apple leaves during dark-induced senescence

2.4 蘋果葉片抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化

CAT、POD和APX可以促進H2O2的降解[23-24]。黑暗下,CAT、POD和APX的酶活性都出現(xiàn)了顯著變化,然而在處理組葉片中這些抗氧化酶的活性明顯比對照組高(圖5)。這表明,噴施“碧護”可以影響黑暗誘導的蘋果葉片衰老過程中抗氧化酶的活性。

圖5 “碧護”對黑暗誘導蘋果葉片衰老過程中抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of “Bihu” on the antioxidant enzyme activity in the process of dark-induced apple leaf senescence

3 討論

“碧護”作為植物生長調(diào)節(jié)劑,可有效增加土壤有益微生物菌群數(shù)量,平衡植物營養(yǎng),增強根系功能,促進根系發(fā)育,進而激發(fā)植物生長潛力,解決因微量元素缺乏引起的爛根、黃葉、裂果等問題,提高其抗蟲性、抗病性,進而提升作物產(chǎn)量和品質(zhì)。“碧護”在果樹上的作用主要體現(xiàn)在以下幾方面:可以提高果樹抗逆性,減輕病蟲害,預防花期凍害;促進扦插生根,提高育苗成活率;促進光合作用,促發(fā)枝,增強樹勢;促進花芽分化,?；ū９?促進果實成熟,提高商品率,延長貨架期[25-26]。

本研究結(jié)果表明,施加“碧護”可以明顯推遲黑暗誘導的蘋果葉片衰老進程。葉綠素降解導致的葉片黃化是葉片衰老的一個重要標志。在黑暗處理16 d后噴施“碧護”,葉片仍保持較高的葉綠素和可溶性蛋白水平。前人報道了一些葉綠素降解途徑的相關(guān)基因[27],PAO是其中一個關(guān)鍵基因,在未噴施“碧護”的對照組葉片衰老過程中該基因被強烈誘導表達,而在噴施“碧護”的葉片中該基因的上調(diào)表達明顯被抑制。另外,在葉片衰老過程中有些基因的表達被特異性誘導,這一類基因被稱作衰老相關(guān)基因,其中SAG12通常被視作衰老的標志性基因[28]。在本試驗中,黑暗誘導下噴施“碧護”的葉片中該基因的表達明顯被抑制,這也表明“碧護”的施用使得蘋果葉片衰老過程被推遲。

自由基假說認為,葉片衰老的發(fā)生主要是因為大量活性氧類物質(zhì)的生成所致[29]。H2O2作為穩(wěn)定的自由基在很多植物葉片衰老過程中產(chǎn)生。在本試驗中,黑暗誘導下未噴施“碧護”葉片中H2O2的積累量與噴施“碧護”的葉片相比明顯較多,而H2O2清除的關(guān)鍵酶CAT、POD和APX的活性在噴施“碧護”的葉片中明顯較高。因此,“碧護”的噴施可能參與調(diào)控植株體內(nèi)抗氧化酶活性和H2O2的平衡,進而緩解黑暗誘導的葉片衰老過程中造成的氧化損傷,最終延緩了葉片衰老進程。

4 結(jié)論

植物生長調(diào)節(jié)劑“碧護”的施加有效延緩了黑暗誘導的蘋果葉片衰老過程,緩解了衰老過程中葉綠素和葉片蛋白質(zhì)的降解。而且,“碧護”可能通過影響抗氧化酶CAT、POD和APX的活性,提高ROS的清除能力,緩解衰老過程中的氧化損傷,保護植物細胞免受自由基的傷害。因此,“碧護”的施加對蘋果葉片衰老過程具有重要作用,但是關(guān)于該植物生長調(diào)節(jié)劑參與葉片衰老過程中的具體調(diào)控機制仍需要進一步去探究。