韓曉玉，李慶倫，姜興林，王 賀，楊靈玲，史亞娟，李洪連，陳琳琳，楊 雪，施 艷

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

大麥黃矮病毒(Barleyyellowdwarfviruses，BYDVs)可以感染各種禾本科作物，例如小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)和燕麥(Avenasativa)等[1-2]，對(duì)禾本科作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[3]，是世界范圍內(nèi)禾本科作物上的重要病毒[4-5]。BYDVs引起的小麥黃矮病是我國(guó)小麥生產(chǎn)上重要的病毒病[6]，目前該病毒主要分布在西北、華北、東北、華中、西南及華東等冬麥區(qū)、春麥區(qū)及冬春麥混種區(qū)。小麥感病后植株矮化，葉尖出現(xiàn)倒“V”字形黃化，一般減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重的可達(dá)到50%以上，個(gè)別地塊甚至可造成絕產(chǎn)。病毒感染會(huì)導(dǎo)致宿主植物顯示葉片變黃的癥狀，這種現(xiàn)象通常與葉綠素生物合成功能損害有關(guān)，導(dǎo)致光合作用減弱[7-9]。病毒編碼蛋白質(zhì)在病毒侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此，研究BYDVs編碼蛋白質(zhì)的功能將為后續(xù)解析該病毒的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

BYDVs是一組由黃癥病毒屬、馬鈴薯卷葉病毒屬和未歸屬的種組成的正單鏈RNA病毒[3]，通過(guò)蚜蟲進(jìn)行持久非增殖型傳播，基于蚜蟲介體的特異性和病毒的序列，BYDVs可分為10個(gè)典型株系，分別為：黃癥病毒屬的BYDV PAV、PAS、MAV、kerⅡ和kerⅢ株系，馬鈴薯卷葉病毒屬的谷類黃矮病毒(Cerealyellowdwarfvirus，CYDV)RPV和RPS株系，以及玉米黃矮病毒(Maizeyellowdwarfvirus，MYDV)RMV株系和黃癥病毒科未歸屬的BYDV GPV和SGV株系[10-12]。在我國(guó)，目前報(bào)道的BYDVs株系有4個(gè)，分別為：BYDV GPV、GAV、PAV和RMV。其中，BYDV GAV與美國(guó)MAV有著相同的血清學(xué)反應(yīng)，全基因組序列一致性最高，為90.4%[10]，但是二者傳播介體不同，GAV可以由麥長(zhǎng)管蚜和麥二叉蚜傳播，MAV僅能通過(guò)麥長(zhǎng)管蚜傳播，因此，GAV是我國(guó)特有的一種BYDVs，已成為我國(guó)小麥黃矮病的主要病原[13-15]。

BYDVs基因組全長(zhǎng)約5.7 kb，5′端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3′端無(wú)poly(A)尾，編碼7個(gè)閱讀框，分別為：ORF1和ORF2編碼與復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)P1和P2；ORF3編碼外殼蛋白(CP)；ORF4編碼移動(dòng)蛋白(MP)，有研究表明，MP還可以作為沉默抑制子發(fā)揮功能[16]；ORF5編碼CP通讀蛋白，該蛋白質(zhì)與病毒粒子的穩(wěn)定性和蚜蟲傳播有關(guān)[17]；ORF6編碼P6蛋白，其在黃癥病毒中變異較大，目前的研究認(rèn)為，該蛋白質(zhì)是BYDV GAV的沉默抑制子蛋白[18]；ORF3a編碼P3a蛋白，其是由非AUG起始的一個(gè)40～50 個(gè)氨基酸的小蛋白質(zhì)，研究表明，該蛋白質(zhì)能夠影響馬鈴薯卷葉病毒屬蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)的系統(tǒng)移動(dòng)[19]。

目前，BYDV GAV編碼蛋白質(zhì)MP和P6已有相關(guān)研究[18，20]，而有關(guān)P1、P2和CP的功能研究較為缺乏，3個(gè)病毒蛋白是否通過(guò)與其他病毒蛋白協(xié)作參與病毒侵染，是否參與病毒的致病過(guò)程尚不清楚。鑒于此，本研究對(duì)3個(gè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、互作情況和致病相關(guān)功能進(jìn)行研究，分析P1、P2和CP與BYDV GAV編碼蛋白質(zhì)的互作情況和對(duì)病毒致病性的影響，旨在為研究該病毒的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

病毒序列來(lái)源：BYDV GAV病毒編碼蛋白序列來(lái)源于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院土傳病害實(shí)驗(yàn)室保存的BYDVGAV病毒性克隆質(zhì)粒。

供試植物：本氏煙(Nicotianabenthamiana)種植于本實(shí)驗(yàn)室溫室。

菌株與載體：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞及農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于莊盟生物公司，保存于-80 ℃冰箱。pEG104載體用于亞細(xì)胞定位的觀察，pGR106載體即馬鈴薯X病毒(PotatovirusX，PVX)載體，用于致病因子的測(cè)定，cYFP和nYFP載體用于雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular fluorescent complimentary，BiFC)試驗(yàn)。以上載體均保存在本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 BYDV GAV編碼P1、P2和CP蛋白的同源進(jìn)化分析

在NCBI網(wǎng)站查找BYDVs不同株系BYDV GAV、GPV、PAV和RMV的基因組，將編碼蛋白質(zhì)P1、P2和CP的核苷酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)，對(duì)同源性高的核苷酸序列采用鄰接法(Neighbor joining，NJ)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用Mega 7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 載體構(gòu)建所用引物的設(shè)計(jì)

通過(guò)DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，送由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 BYDV GAV編碼P1、P2和CP蛋白的亞細(xì)胞定位觀察

用Gateway方法利用BPBYDVP1F/BPBYDVP1R、BPBYDVP2F/BPBYDVP2R和BPBYDVCPF/BPBYDVCPR分別構(gòu)建BP-P1、BP-P2和BP-CP中間載體。用中間載體分別和pEG104載體進(jìn)行LR反應(yīng)構(gòu)建P1-YFP，P2-YFP和CP-YFP熒光表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，挑取單菌落驗(yàn)證正確后搖菌。將含有P1-YFP、P2-YFP和CP-YFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌用MMA緩沖液(10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，200 μmol/L 乙酰丁香酮，pH值5.6)懸浮后，OD600值定為1，靜置2 h后浸潤(rùn)健康本氏煙葉片(第7，8片葉)下表皮，接種2 d后在激光共聚焦顯微鏡(Zeiss 810)下觀察本氏煙葉片表皮細(xì)胞中YFP熒光，其激發(fā)光波長(zhǎng)為514 nm。

1.5 BYDV GAV蛋白質(zhì)互作的BiFC驗(yàn)證

通過(guò)BiFC技術(shù)可以將具有相互作用親和力的2個(gè)蛋白質(zhì)組裝成完整的熒光蛋白。利用PNCBYDVP1F/PNCBYDVP1R、PNCBYDVP2F/PNCBYDVP2R、PNCBYDVCPF/PNCBYDVCPR、PNCBYDVMPF/PNCBY

DVMPR和PNCBYDVP6F/PNCBYDVP6R等引物分別構(gòu)建BYDV P1、P2、CP、MP和P6的nYFP和cYFP載體。將構(gòu)建成功的BYDV P1、P2、CP、MP和P6的nYFP和cYFP載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，得到的農(nóng)桿菌用MMA緩沖液懸浮至OD600值為0.1。將不同編碼蛋白質(zhì)的nYFP和cYFP菌液分別組合，浸潤(rùn)3—4葉期本氏煙，接種2 d后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光并拍攝。

目前，廣西各項(xiàng)社會(huì)保險(xiǎn)費(fèi)的征繳主要采取社會(huì)保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)征收的模式，即由人力資源和社會(huì)保障部門社會(huì)保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)征收基本養(yǎng)老保險(xiǎn)費(fèi)(含城鎮(zhèn)職工基本養(yǎng)老保險(xiǎn)、城鄉(xiāng)居民基本養(yǎng)老保險(xiǎn)、機(jī)關(guān)事業(yè)單位養(yǎng)老保險(xiǎn))、基本醫(yī)療保險(xiǎn)費(fèi)(含城鎮(zhèn)職工基本醫(yī)療保險(xiǎn)和城鄉(xiāng)居民基本醫(yī)療保險(xiǎn)。自2017年7月1日起，新型農(nóng)村合作醫(yī)療保險(xiǎn)并入城鄉(xiāng)居民基本醫(yī)療保險(xiǎn))、失業(yè)保險(xiǎn)、工傷保險(xiǎn)、生育保險(xiǎn)等社會(huì)保險(xiǎn)費(fèi)。

1.6 PVX介導(dǎo)的BYDV GAV蛋白質(zhì)系統(tǒng)表達(dá)

使用引物PVXBYDVP1-F/PVXBYDVP1-R、PVXBYDVP2-F/PVXBYDVP2-R和PVXBYDVCP-F/PVXBYDVCP-R，利用同源重組的方法將BYDV P1、P2和CP構(gòu)建到pGR106載體上。將構(gòu)建成功的PVXP1、PVXP2、PVXCP表達(dá)載體進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，對(duì)利用菌液PCR驗(yàn)證正確的單菌落進(jìn)行搖菌。將PVXP1、PVXP2、PVXCP農(nóng)桿菌分別單獨(dú)浸潤(rùn)本氏煙，以PVX作為對(duì)照，OD600值定為0.5，浸潤(rùn)后黑暗處理12 h。觀察植株是否出現(xiàn)危害癥狀，記錄天數(shù)并進(jìn)行葉片拍照，取樣放入-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western Blot檢測(cè)

接種PVXP1、PVXP2、PVXCP和PVX 5 d后，取植株系統(tǒng)葉。將取樣葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，以PVX載體作為對(duì)照，將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；利用20 V、20 min條件進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；用5%的脫脂奶粉對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉；一抗是PVX-CP抗體，稀釋8 000倍，二抗是過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體，稀釋10 000倍；用底物化學(xué)發(fā)光劑eECL(諾唯贊生物試劑公司)進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 BYDV GAV編碼蛋白質(zhì)P1、P2和CP的遺傳進(jìn)化分析

通過(guò)Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)BYDVGAV株系P1、P2和CP蛋白的核苷酸序列進(jìn)行同源進(jìn)化分析，如圖1所示，根據(jù)P1的核苷酸序列，BYDV GAV的分離物聚到一小支，與BYDV PAV株系分離物在一個(gè)大的分支上，與BYDV GPV和RMV株系分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；BYDV PAV中國(guó)分離物聚到一個(gè)小支，美國(guó)和澳大利亞分離物聚在一個(gè)小支。根據(jù)P2的核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹與P1的較為相似，BYDV GAV與PAV株系分離物親緣關(guān)系近，與BYDV GPV和RMV株系分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。根據(jù)CP的核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，BYDV GPV運(yùn)城分離物(KP096592.1)與其他BYDVs分離物親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)，單獨(dú)形成一支，GAV與PAV親緣關(guān)系最近，二者能夠與RMV分離物形成一個(gè)分支，而與GPV親緣關(guān)系遠(yuǎn)(圖3)。綜上表明，BYDVs的4種分離物中，PAV與GAV在核苷酸水平上的親緣關(guān)系最近。

圖1 P1編碼序列的同源進(jìn)化分析Fig.1 Homologous evolution analysis of the coding sequence of P1

圖2 P2編碼序列的同源進(jìn)化分析Fig.2 Homologous evolution analysis of the coding sequence of P2

圖3 CP編碼序列的同源進(jìn)化分析Fig.3 Homologous evolution analysis of the coding sequence of CP

2.2 BYDV GAV編碼蛋白質(zhì) P1、P2和CP的亞細(xì)胞定位

分別構(gòu)建P1-YFP、P2-YFP和CP-YFP重組表達(dá)載體，將含有P1-YFP、P2-YFP和CP-YFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液分別浸潤(rùn)本氏煙葉片，接種后2 d通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察YFP熒光，結(jié)果表明，P1、P2和CP均定位在核質(zhì)中(圖4)。

圖4 P1、P2和CP的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of P1，P2 and CP

2.3 BYDV GAV編碼P1、P2和CP蛋白與其他蛋白質(zhì)的體內(nèi)互作驗(yàn)證

分別擴(kuò)增P1、P2、CP、MP和P6的全長(zhǎng)閱讀框，構(gòu)建到雙分子熒光互補(bǔ)載體nYFP和cYFP上，通過(guò)兩兩組合共15個(gè)組合浸潤(rùn)本氏煙，接種后2 d通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察本氏煙細(xì)胞，結(jié)果表明，P1-nYFP和P1-cYFP共浸潤(rùn)后可以在細(xì)胞四周觀察到點(diǎn)狀YFP熒光，表明P1能夠在體內(nèi)互作(圖5)，其他組合均未觀察到熒光(表2)。

圖5 P1在體內(nèi)相互作用的驗(yàn)證Fig.5 Verification of the self-interaction of P1 in vivo

表2 BYDV GAV的P1、P2和CP蛋白與其他蛋白質(zhì)相互作用觀察結(jié)果Tab.2 The observation results of the interaction between P1，P2，CP and other proteins encoded by BYDV GAV

2.4 BYDV GAV編碼蛋白質(zhì)P1、P2和CP異源表達(dá)對(duì)PVX致病性的影響

分別構(gòu)建P1、P2和CP的PVX重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后浸潤(rùn)本氏煙，接種5 d后異源表達(dá)CP的PVX載體處理可以明顯地觀察到系統(tǒng)花葉癥狀，而PVX對(duì)照和PVXP1、PVXP2處理都尚未產(chǎn)生系統(tǒng)癥狀，表明CP促進(jìn)了PVX的癥狀形成(圖6-A)。采用PVX-CP的抗血清通過(guò)Western Blot檢測(cè)PVX的積累量，結(jié)果與癥狀一致，PVXCP處理可以明顯觀察到PVX的積累，而其他重組載體處理未能檢測(cè)到病毒的積累(圖6-B)。為了確定PVX、PVXP1和PVXP2的侵染性，采集接種后10 d的系統(tǒng)葉進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果表明，接種后10 d，PVX、PVXP1、PVXP2和PVXCP處理都可以檢測(cè)到CP的積累。

A.接種本氏煙后5 d的植株癥狀；B.分別在接種后5，10 d檢測(cè)病毒積累量。A.The symptom of plants at 5 d post infiltration(dpi)；B.Detection of viral accumulation at 5，10 dpi，respectively.

3 結(jié)論與討論

BYDV GAV是我國(guó)小麥黃矮病的主要病原[14]，P1、P2和CP是該病毒編碼的3個(gè)蛋白質(zhì)，目前這3個(gè)蛋白質(zhì)在BYDV GAV侵染中的作用鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)觀察三者的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，P1和P2蛋白定位于核質(zhì)，這與PSORT Ⅱ在線預(yù)測(cè)(https：//psort.hgc.jp/form2.html)的結(jié)果一致；CP-YFP融合蛋白定位于核質(zhì)，而PSORTⅡ和LOCALIZER(http：//localizer.csiro.au/)在線預(yù)測(cè)CP定位于線粒體和細(xì)胞核。

研究病毒蛋白質(zhì)間的相互作用發(fā)現(xiàn)，P1能夠在體內(nèi)自身互作，而其他蛋白質(zhì)之間體內(nèi)互作強(qiáng)度可能較弱，因而沒有檢測(cè)到。本研究中，P1和P2的表達(dá)對(duì)PVX的侵染沒有明顯影響，推測(cè)P1和P2可能參與了病毒侵染的其他過(guò)程。已有研究表明，馬鈴薯卷葉病毒(Potatoleaf-rollvirus，PLRV)編碼的P1和P2參與了病毒的復(fù)制[21]，病毒蛋白質(zhì)之間的互作能夠有助于病毒的復(fù)制和移動(dòng)。本研究中，通過(guò)體內(nèi)互作的方式確定了P1的自身互作，表明P1可能通過(guò)形成點(diǎn)狀聚集體的形式參與復(fù)制。

黃癥病毒屬甜菜西黃病毒(Beetwesternyellowsvirus，BWYV)的CP突變體能夠抑制該病毒的系統(tǒng)侵染[22]，本研究發(fā)現(xiàn)，BYDV GAV CP蛋白的表達(dá)可以顯著促進(jìn)PVX的系統(tǒng)侵染和癥狀形成，與黃癥病毒屬BWYV的結(jié)果一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)，抗小麥黃矮病相關(guān)蛋白激酶TiDPK1與BYDV PAV和GAV株系的CP蛋白能夠互作[23]，表明CP可能參與了相關(guān)病毒的致病過(guò)程。

BYDV-GAV編碼的蛋白質(zhì)P1、P2和CP均通過(guò)定位于核質(zhì)中發(fā)揮作用，P1在體內(nèi)能夠以點(diǎn)狀二聚體的狀態(tài)參與病毒的侵染，CP異源表達(dá)能夠顯著促進(jìn)PVX的系統(tǒng)性侵染。