侍玉梅，陳少康，邢 凱，趙延輝，原佳妮，盛熙暉，齊曉龍，倪和民，郭 勇，王楚端

(1.北京農(nóng)學院 動物科學技術(shù)學院，北京 102206；2.北京市畜牧總站，北京 100101；3.中國農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，北京 100193)

肌肉生長和脂肪沉積是養(yǎng)豬生產(chǎn)中非常重要的經(jīng)濟性狀，同時也是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受到眾多因素的影響[1]；然而，豬肌肉生長和脂肪沉積過程中的分子調(diào)控機制仍有待進一步研究。豬的脂肪性狀直接影響豬肉品質(zhì)，而對不同品種豬的肉質(zhì)進行比較分析是鑒定差異表達基因(DEGs)的主要方法之一。松遼黑豬作為我國培育的地方品種，具有繁殖率高、肉質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強、耐粗飼等特性[2]。長白豬作為西方豬種，具有生長速度快、飼料利用率高、瘦肉率高等特點，但肉質(zhì)欠佳[3]。長白豬是典型的瘦肉型豬，而松遼黑豬是我國特有的脂肪型豬，2個不同品種豬的表型差異很大，是鑒別肌肉和脂肪中DEGs的良好動物模型。

高通量測序使轉(zhuǎn)錄組研究變得容易進行，以轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)為代表的新一代高通量測序技術(shù)能夠全面快速獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息。該技術(shù)既可以在有基因組注釋的情況下應(yīng)用以促進轉(zhuǎn)錄本識別，也可以在沒有參考基因組的情況下應(yīng)用，其被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組分析。王志秀[4]對滇南小耳豬、藏豬、長白豬和杜洛克豬進行高通量測序發(fā)現(xiàn)，在滇南小耳豬-藏豬組和長白豬-杜洛克豬組共篩選出315個差異表達基因，其中，有140個上調(diào)基因，175個下調(diào)基因，并鑒定出27個與脂肪沉積相關(guān)的基因，其主要參與脂肪代謝、脂肪酸合成等過程。Xu等[5]對不同日齡梅山豬的骨骼肌進行轉(zhuǎn)錄組研究，鑒定出338個DEGs，蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)66個差異表達基因，功能分析顯示其功能主要為代謝、肌原纖維細絲形成、細胞骨架形成、收縮活動和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。NOISeq是用于分析RNA-seq數(shù)據(jù)的綜合資源，是一種用于鑒別DEGs的非參數(shù)方法，不需要對數(shù)據(jù)進行分布假設(shè)，就可以對原始計數(shù)或之前歸一化或轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)集進行差異表達分析。由于噪聲分布來自實際數(shù)據(jù)，NOISeq方法能更好地適應(yīng)數(shù)據(jù)集的大小，可更有效地控制錯誤發(fā)現(xiàn)率[6]。

背最長肌是研究豬肉品質(zhì)最常用的材料。本研究選取了6頭松遼黑豬與6頭長白豬，利用其背最長肌組織的轉(zhuǎn)錄本進行RNA-seq分析，通過非參數(shù)檢驗法NOISeq鑒定差異表達基因，并對差異表達基因的功能進行注釋分析，以篩選出影響豬脂肪沉積的關(guān)鍵基因。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

本研究選用來自天津市寧河原種豬場的6頭松遼黑豬與6頭長白豬，所有動物在同一條件下飼養(yǎng)至體質(zhì)量為100 kg左右時進行屠宰，屠宰在華都陽光食品公司進行，屠宰標準按照GB/T 17236—2008《生豬屠宰操作規(guī)程》進行[7]。屠宰后，采集背最長肌組織樣品，并移至液氮中進行冷凍保存，待提取RNA使用。

1.2 總RNA的提取、建庫及測序

采用TRIzol法，按照產(chǎn)品說明提取每頭豬背最長肌組織的總RNA，共提取12個樣本，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測總RNA是否有降解及雜質(zhì)，并用紫外分光光度計測定波長，評價所得RNA質(zhì)量。cDNA文庫制備與測序在廣州基迪奧生物科技有限公司進行。參考Illumina Tru Seq TM RNA樣品制備試劑盒操作說明進行構(gòu)建，最后用構(gòu)建好的文庫通過Illumina HiSeq 2500平臺進行雙末端(Paire-end，PE)測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)的處理

利用Trimomatic[8]對原始數(shù)據(jù)(raw reads)進行過濾，并利用FastQC軟件[9](http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)對raw reads進行質(zhì)控并統(tǒng)計。質(zhì)控標準為：去除含 adapter 的 reads；去除含N比例大于10%的reads；去除低質(zhì)量reads(質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條read的50%以上)[10]。質(zhì)控后獲得高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)(Clean reads)，用TopHat2[11]將其比對到豬的參考基因組Susscrofa 11.1中。Cufflinks[12]用于數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄本組裝、注釋與合并。用HT-seq軟件[13]計算每個樣本中基因的表達量。

1.4 差異表達基因的篩選

用NOISeq R數(shù)據(jù)包篩選差異表達基因，以log2|fold change|>1、P≥0.8為標準進行篩選。NOISeq統(tǒng)計方法是基于無參估計鑒定差異表達基因的，所以并沒有常見的P值，該方法的優(yōu)點在于能夠根據(jù)測序數(shù)據(jù)的大小對假陽性率進行有效控制，所采用的閾值P=0.8意味著該基因有差異表達的可能性是無差異表達的4倍，與其他方法中(cufflink、DESeq、DEGSeq等)所用的P=0.001篩選標準相持平[14]。

1.5 基因的生物學功能分析

GO(http：//www.geneontology.org)為基因數(shù)據(jù)提供功能分類，包括生物過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和細胞成分(Cellular component，CC)3個方面。GO分析是一種廣泛使用的基因和基因產(chǎn)物注釋工具。通過GO term注釋的差異基因，計算每個term的基因列表和基因數(shù)目，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比差異表達基因中顯著富集的GO條目，從而找出差異表達基因顯著相關(guān)的生物學功能。KEGG(http：//www.genome.ad.jp/kegg/)是一個網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)站，可以分析、解釋和可視化基因功能，是通路分析的主要數(shù)據(jù)庫[15]。本研究利用基迪奧生物信息云平臺(https：//www.omicshare.com/)對差異表達基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，P<0.05時被鑒定為顯著富集通路和GO條目。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控及比對信息

對每個樣本的測序數(shù)據(jù)質(zhì)控后獲得約1.0×107個Clean reads，與豬的參考基因組序列(Sus scrofa 11.1)比對，平均比對率約為88.8%。通過對轉(zhuǎn)錄本進行組裝和拼接，最終得到23 471個轉(zhuǎn)錄本(FPKM≥0.1)。由測序樣本的reads數(shù)和比對率可知，樣本質(zhì)量和測序測量均達到了預(yù)期(表1)。

表1 樣本比對結(jié)果統(tǒng)計Tab.1 Statistics of sample comparison results

2.2 基因表達整體分析

為了了解reads在不同樣本中的分布，比較了試驗中所有樣本中的reads數(shù)，發(fā)現(xiàn)基因的表達水平基本相當(圖1-A)，只有不到35%的基因在每一個樣本中都有1個以上的CPM(圖1-B)。

A為動態(tài)表達范圍圖，該圖顯示了每個樣本中CPM值超過0的基因的分布；B圖反映了低表達基因在總轉(zhuǎn)錄本中所占的比例。A is the dynamic expression range map，which shows the distribution of differentially expressed genes with CPM values over 0 in each sample；B map reflects the proportion of low-expressed genes in total transcripts.

2.3 生物型檢測

分別選取松遼黑豬和長白豬中的1個樣本進行生物型檢測，發(fā)現(xiàn)檢測到的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本為蛋白質(zhì)編碼RNA，有少部分RNA也能被檢測到，如miRNA、lincRNA和scaRNA等，檢測結(jié)果符合預(yù)期(圖2)。

圖2 生物型分布Fig.2 Biotype distribution(per sample)

2.4 差異表達基因篩選

在松遼黑豬和長白豬的背最長肌組織樣本中共檢測到23 471個基因表達(FPKM≥0.1)。2個不同品種豬相比，共篩選到664個差異表達基因(圖3)，其中，364個基因在松遼黑豬中高表達，300個基因在長白豬中高表達。

A圖代表2個品種豬的表達值總圖，其中，紅點代表差異表達基因；橫坐標代表基因在長白豬中的表達水平，縱坐標代表基因在松遼黑豬中的表達水平。B圖代表(M，D)值和差異表達基因匯總圖。橫坐標表示值，而縱坐標表示值，黑點表示(M，D)值，其中(|M|>1)，紅點表示差異表達基因。

2.5 差異表達基因的功能富集分析

為了更好地了解所篩選到的DEGs的功能及其與表型的關(guān)系，本研究對篩選到的DEGs進行了功能富集分析，包括GO功能分析和KEGG信號通路分析。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因富集于52條GO條目，且生物過程富集到的GO terms最多，由此可知，生物過程是松遼黑豬和長白豬在背最長肌中差異表達基因行使的主要生物學功能(圖4)。對DEGs進行KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因共參與了275條KEGG信號通路，其中，有52條顯著富集通路，其通路主要為脂肪酸代謝(Fatty acid metabolism)、胰島素抵抗(Insulin resistance)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)、AMPK信號通路(AMPK signaling pathway)、脂肪細胞因子信號通路(Adipocytokine signaling pathway)和胰島素信號通路(Insulin signaling pathway)等(圖5)，根據(jù)顯著性通路篩選到LPIN1、FADS1、FADS2、PLIN2、PPARGC1A、PRKAG2和ACSL1等與脂類代謝和肌肉發(fā)育相關(guān)的基因(表2)。

1.細胞過程； 2.生物調(diào)節(jié)； 3.生物過程的調(diào)節(jié)； 4.對刺激的反應(yīng)； 5.代謝過程； 6.多細胞有機體過程； 7.生物過程的正向調(diào)控； 8.信令； 9.發(fā)展過程； 10.定位； 11.細胞成分組織或生物發(fā)生； 12.生物過程負調(diào)控； 13.免疫系統(tǒng)過程； 14.運動； 15.多組織進程； 16.細胞增殖； 17.生物黏附； 18.繁殖； 19.生殖過程； 20.行為； 21.成長； 22.細胞殺傷； 23.有節(jié)奏的過程； 24.解毒； 25.色素沉著； 26.細胞聚集； 27.細胞； 28.細胞部分； 29.細胞器； 30.膜； 31.膜部分； 32.細胞器部分； 33.細胞外區(qū)； 34.含蛋白質(zhì)的復(fù)合物； 35.胞外區(qū)部分； 36.膜封閉內(nèi)腔； 37.突觸； 38.超分子配合物； 39.細胞連接； 40.突觸部分； 41.黏合物； 42.催化活性； 43.分子功能調(diào)節(jié)劑； 44.分子換能器活性； 45.運輸活動； 46.結(jié)構(gòu)分子活性； 47.轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性； 48.抗氧化活性； 49.自噬受體活性； 50.蛋白質(zhì)標簽； 51.分子載體活性； 52.翻譯調(diào)節(jié)活動。

3 結(jié)論與討論

本研究選用在表型方面存在較大差異的松遼黑豬和長白豬為研究對象，對其背最長肌組織進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，篩選與脂肪沉積相關(guān)的差異表達基因。通過非參數(shù)檢驗法NOISeq共篩選出664個DEGs，其中，364個基因在松遼黑豬中高表達，300個基因在長白豬中高表達。對其進行生物學功能分析，鑒定出脂肪細胞因子信號通路、PPAR信號通路、AMPK信號通路、胰島素信號通路和脂肪酸代謝等與脂肪沉積相關(guān)的通路，根據(jù)顯著性通路篩選出了LPIN1、FADS1、FADS2、PLIN2、PPARGC1A、PRKAG2和ACSL1等與脂類代謝和肌肉發(fā)育相關(guān)的基因。該研究結(jié)果為深入研究松遼黑豬和長白豬之間脂肪沉積和肌肉發(fā)育性狀差異的分子機制提供了堅實的基礎(chǔ)。豬脂肪組織的沉積能力具有品種差異，且不同品種的豬脂肪沉積能力具有較大差異[16]。本研究找到了與松遼黑豬和長白豬脂肪沉積相關(guān)的重要功能基因和信號通路，如mTOR信號通路(mTOR signaling pathway)、PPAR信號通路和脂肪酸代謝，與之相關(guān)的基因包括脂質(zhì)1基因(Lipin 1，LPIN1)、脂滴蛋白2基因(Perilipin-2，PLIN2)和脂肪酸去飽和酶1基

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

表2 脂質(zhì)代謝相關(guān)KEGG通路Tab.2 Lipid metabolism-related KEGG pathway

因(Fatty acid desaturase 1，F(xiàn)ADS1)。LPIN1基因的表達是脂肪細胞分化所必需的，其作為核轉(zhuǎn)錄共激活因子與一些過氧化物酶體增殖物激活受體一起調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)代謝其他基因的表達。He等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在豬中LPIN1基因與肌內(nèi)脂肪沉積及肌肉品質(zhì)存在顯著相關(guān)性，可以影響肌內(nèi)脂肪含量(IMF)、瘦肉率和風味，所以將LPIN1基因作為改善肌肉品質(zhì)的候選基因之一。PLIN2基因位于脂滴表面，稱為脂滴包被蛋白，隸屬于脂滴包被蛋白PAT家族蛋白，其主要功能是參與脂質(zhì)代謝[18]。有研究表明，PLIN2基因在肌間脂肪較高的豬種中表達水平較高[19]。FADS1基因是脂肪酸去飽和酶(FADS)基因家族的成員，去飽和酶通過在脂肪酰基鏈的定義碳之間引入雙鍵來調(diào)節(jié)脂肪酸的不飽和度。宋文莉等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADS1基因?qū)Ζ?3不飽和長鏈脂肪酸的代謝有重要作用，加之FADS1基因在本研究中參加了脂肪酸代謝，因此，推測FADS1基因為與豬脂肪沉積相關(guān)的候選基因，目前關(guān)于FADS1基因在豬上的研究還很少。另外，發(fā)現(xiàn)FADS2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α基因(Peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator1α，PPARGC1A)、蛋白激酶腺嘌呤核糖核苷酸激活的非催化亞基γ2基因(Protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 2，PRKAG2)和長鏈脂酰輔酶A合成酶1基因(Long chain acyl-CoA synthetase 1，ACSL1)均同時參與了不同信號通路和代謝途徑。FADS2屬于脂肪酸去飽和酶(FADS)基因家族的成員，主要作用為通過在脂肪?；湹奶囟ㄌ荚又g引入雙鍵來調(diào)節(jié)脂肪酸的不飽和度。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADS2基因在PPAR信號通路和脂肪酸代謝通路中均有參與，前人研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADS2基因與多不飽和脂肪酸(PUFA)之間存在關(guān)聯(lián)[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADS2基因SNP突變影響人體脂肪組織及血漿中PUFA的含量，從而影響人類健康，人類全基因組關(guān)聯(lián)分析證實，F(xiàn)ADS2基因?qū)χ惔x疾病有重要作用[22]；因此，推測FADS2基因可能在豬脂肪沉積中也發(fā)揮著重要作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，PPARGC1A的表達有利于脂肪細胞的分化成熟，與脂質(zhì)代謝相關(guān)[23]，且PPARGC1A基因?qū)ι矬w內(nèi)棕色脂肪的生成具有重大影響[24]。Gandolfi等[25]研究發(fā)現(xiàn)，PPARGC1A基因與豬肉質(zhì)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)，且由于物種間存在差異，可作為候選基因用于豬肉質(zhì)性狀的改良。本研究中，PPARGC1A基因參與了脂肪細胞因子信號通路、AMPK信號通路和胰島素抵抗等多條通路，所以，可將PPARGC1A基因作為豬背脂沉積的重要候選基因之一。PRKAG2參與了AMPK信號通路、脂肪細胞因子信號通路和胰島素信號通路等多條通路，PRKAG2基因是腺嘌呤核糖核苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)家族重要的成員，其突變與Wolff-Parkinson-White綜合征、家族性肥厚性心肌病和心臟糖原貯積病有關(guān)。其在肌肉脂肪代謝、能量代謝等方面發(fā)揮著重要作用[26]。Jing等[27]通過對高、低剩余采食量的豬骨骼肌進行高通量測序發(fā)現(xiàn)，PRKAG2在骨骼肌能量代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。由此推測，PRKAG2基因的表達與豬的脂肪沉積存在顯著相關(guān)性，可作為影響脂肪沉積的重要候選基因。ACSL1是長鏈酯酰輔酶A合成酶家族(Long-chain fatty acyl-CoA synthetases，ACSLs)的成員之一，該家族由ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5和ACSL6組成[28]，而ACSL1是ACSLs家族中最早被發(fā)現(xiàn)的亞型，ACSL1在脂質(zhì)生物合成和脂肪酸降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究表明，ACSL1在脂肪酸的活化、轉(zhuǎn)運和降解以及脂類生成等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[29]。本研究中，ACSL1基因參與了PPAR信號通路、脂肪酸代謝和脂肪細胞因子信號通路，數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait loci，QTL)分析認為，ACSL1作為最重要位置和功能候選基因，影響豬肉中脂肪酸組成[30]；因此，將ACSL1基因作為脂肪沉積的候選基因。

綜上所述，通過對松遼黑豬和長白豬背最長肌之間差異表達基因進行鑒定與分析，篩選出多個參與肌肉發(fā)育和脂類代謝的重要候選基因，包括LPIN1、FADS1、FADS2、PLIN2、PPARGC1A、PRKAG2和ACSL1等，這些基因目前已知的功能均與脂肪沉積相關(guān)，但在豬中影響組織脂類代謝的機制還有待深入研究，未來對這些重要功能基因的深入驗證，可能會揭示影響豬生長發(fā)育和豬肉品質(zhì)的重要基因，為未來滿足社會需求的新品種遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。