劉佳悅，賈麗霞，王苗苗，孫東輝，孫賀賀，郝志敏，李志勇

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所，河北 石家莊 053000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟(jì)研究所，河北 石家莊 050051；4.邢臺(tái)現(xiàn)代職業(yè)學(xué)校，河北 邢臺(tái) 054000)

內(nèi)生菌是生活史的全部或部分階段存在于健康植物組織和器官，且不引起寄主植物損傷的微生物[1-2]。研究表明，健康植物中存在多種多樣的微生物群落，它們與宿主共同進(jìn)化，同時(shí)伴隨種子萌發(fā)的過程，可遷移到不同組織及器官中，對(duì)植物的有益性狀具有調(diào)節(jié)作用。其中的有益細(xì)菌和真菌，如拮抗細(xì)菌、菌根真菌及固氮菌等，可以通過促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)獲取、提高植物抗逆性以及對(duì)病原菌的抵抗力，影響植物的生長(zhǎng)和健康[3-5]。

近年來(lái)，隨著人們對(duì)農(nóng)作物品質(zhì)要求的提高，能夠促進(jìn)作物生長(zhǎng)及提高其抗逆性的新型微生物資源受到了越來(lái)越多的關(guān)注，這些微生物與植物之間的相互作用已成為植物學(xué)、微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。相關(guān)研究證實(shí)，植物內(nèi)生菌可在種子中占據(jù)多個(gè)生態(tài)位[6]，在種子萌發(fā)過程中，首先定殖在根部，還可伴隨著細(xì)胞的移動(dòng)擴(kuò)散到包括莖、葉的其他植物組織[7]。從整體角度來(lái)看，不同部位具有不同的菌群結(jié)構(gòu)。而不同微生物群體與植物各個(gè)組織在長(zhǎng)期進(jìn)化的過程中形成了互惠共生的關(guān)系，在植物抵御不良環(huán)境及病原菌的侵染過程中均可發(fā)揮巨大的作用[8-10]。同時(shí)，這些結(jié)果也可表明內(nèi)生菌在時(shí)間、空間上會(huì)產(chǎn)生系統(tǒng)性變化，進(jìn)一步將不同生態(tài)位微生物群體變化與宿主感病性及抗病性聯(lián)系在一起，有助于揭示不同內(nèi)生菌種類在寄主感病或抗病過程中發(fā)揮的作用。

谷子(Setariaitalica)屬禾本科狗尾草屬，一年生草本植物，具耐旱、適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆范圍廣等特征，在我國(guó)北方廣泛種植。因其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，常作為北方人民的主要雜糧作物之一[11-12]。谷瘟病是由灰梨孢菌(Magnaportheoryzae)引起的病害，谷子各生育階段都可發(fā)生[13]。近年來(lái)，由于生產(chǎn)中缺乏抗病品種，單一品種大面積的種植，谷瘟病已經(jīng)成為影響我國(guó)谷子生產(chǎn)的重要病害之一。而且，田間灰梨孢菌有多個(gè)生理小種，容易發(fā)生生理小種變異，導(dǎo)致谷子抗病性喪失。而化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，容易造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留，并且容易使病原菌出現(xiàn)抗藥性，因此，急需新的防治策略來(lái)防控谷瘟病[14-15]。自然條件下，谷子及其內(nèi)生菌和諧共生，形成原始微生態(tài)環(huán)境，病害發(fā)生后導(dǎo)致谷子原始微生態(tài)平衡破壞，究竟哪些內(nèi)生菌種群發(fā)生變化及不同部位谷子內(nèi)生菌群動(dòng)態(tài)有何變化，目前尚未知曉，而這些內(nèi)生菌種群的明確是研究谷子與相關(guān)菌群互作的重要內(nèi)容，對(duì)于生物防治制品[16]的研發(fā)、抗谷瘟病品種的選育及谷子產(chǎn)量的提高具有重要意義。

為了更深入地了解谷子不同品種與品種及同一品種不同器官內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征，本研究以4個(gè)不同品種的谷子為研究對(duì)象，分別收集、提取其莖、葉片、葉鞘3個(gè)部位DNA，通過Illumina Miseq 高通量測(cè)序?qū)?nèi)生菌群的結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析，以期解析不同品種谷子及其不同組織內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異性，揭示植物內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)一步篩選谷子不同品種及部位功能微生物，為內(nèi)生菌資源的挖掘與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取感谷瘟病的沙灣谷子、冀谷22和抗谷瘟病的小青谷、石榴子共4個(gè)不同品種的谷子為研究對(duì)象(表1)。谷子播種于營(yíng)養(yǎng)土中，在人工氣候箱種植，10 h光照 26 ℃/14 h黑暗 22 ℃，在抽穗期時(shí)，接種谷瘟病菌強(qiáng)毒菌株10-52，待感病品種發(fā)病后，采集各品種的葉片、莖、葉鞘共計(jì)12種樣品，-80 ℃保存，備用。

表1 不同品種谷子取樣信息Tab.1 Sampling information of different foxtail millet varieties

1.2 16S rDNA PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

用FastDNA SPIN Kit for Soil提取植物樣品基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。按16S rDNA V3—V4區(qū)，合成帶有barcode的特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。構(gòu)建Miseq文庫(kù)，通過諾禾致源novaseq6000平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，上海美吉生物云平臺(tái)QiiME1(http：//qiime.org/install/index.html)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Miseq測(cè)序得到的PE首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接區(qū)分樣本后經(jīng)Uparse(http：//www.drive5.com/uparse/)及Usearch數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析，Silva(Release138http：//www.arb-silva.de)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行16S細(xì)菌和古菌核糖體比對(duì)分析，Unite(Release 8.0 http：//unite.ut.ee/index.php)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行真菌多樣性比對(duì)。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier(Version 2.11http：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個(gè)分類學(xué)水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落物種組成?；贠TU聚類分析結(jié)果，對(duì)OTU進(jìn)行alpha多樣性分析(https：//www.mothur.org/wiki/Down)，PICRUSt(http：//picrust.github.io/picrust/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)16S序列進(jìn)行KEGG、COG、Pfam功能預(yù)測(cè)；基于分類學(xué)信息，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)美吉生物云平臺(tái)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。為保證在后續(xù)分析中數(shù)據(jù)的均一性，將有效序列按不同分組最小樣本序列數(shù)目進(jìn)行抽平。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個(gè)分類學(xué)平：Domain(域)、Kingdom(界)、Phylum(門)、Class(綱)、Order(目)、Family(科)、Genus(屬)、Species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落物種組成。經(jīng)物種組成分析(圖1)，門水平上，供試樣本內(nèi)生菌優(yōu)勢(shì)種類均為革蘭氏陽(yáng)性菌變形菌門及革蘭氏陰性菌放線菌門(Actinobacteriota)。擬桿菌門(Bacteroidota)、綠彎菌門(Choroflexi)、粘菌門(Myxococcota)、厚壁菌門(Firmicutes)相對(duì)豐度次之。

G1-1.沙灣谷子葉片；G3-1.沙灣谷子莖；G4-1.沙灣谷子葉鞘；G1-2.冀谷22葉片；G3-2.冀谷22莖；G4-2.冀谷22葉鞘；G1-4.小青谷葉片；G3-4.小青谷莖；G4-4.小青谷葉鞘；G1-5.石榴子葉片；G3-5.石榴子莖；G4-5.石榴子葉鞘。

2.2 谷子內(nèi)生菌Alpha多樣性分析

以抽取的數(shù)據(jù)量為橫坐標(biāo)，以Alpha多樣性指數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制曲線，根據(jù)曲線是否達(dá)到平緩來(lái)判斷本次測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足夠。對(duì)沙灣谷子、冀谷22號(hào)、小青谷、石榴子樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，繪制稀釋曲線，曲線趨于平緩，說(shuō)明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量充足(圖2)。

A～D.沙灣谷子、冀谷22號(hào)、小青谷、石榴子。圖4～5同。A—D.Shawan millet，Jigu 22，Xiaoqinggu，Shiliuzi.The same asFig.4—5.

如圖3所示，Sobs指數(shù)反映出感病品種(沙灣谷子、冀谷22)葉片群落豐富度較高，石榴子(抗谷瘟病)在葉鞘時(shí)期豐富度較沙灣谷子(感谷瘟病)占有優(yōu)勢(shì)。冀谷22(感谷瘟病)這一品種莖的Shannon指數(shù)較高，群落多樣性及特有OTU數(shù)目較高；沙灣谷子葉片群落多樣性高于其他幾個(gè)品種；小青谷(抗谷瘟病)葉鞘物種多樣性較高。說(shuō)明不同品種谷子內(nèi)生菌在物種組成上具有較大差異，感病品種葉片、莖部微生物多樣性較高；抗病品種葉鞘內(nèi)生菌多樣性相對(duì)豐富。

A～C.葉片、莖、葉鞘；G-1.沙灣谷子；G-2.冀谷22號(hào)；G-4.小青谷；G-5.石榴子。A—C.Leaves，stems，leaf sheath；G-1.Shawan millet；G-2.Jigu 22；G-4.Xiaoqinggu；G-5.Shiliuzi.

2.3 谷子內(nèi)生菌Beta多樣性分析

通過主坐標(biāo)分析(Principal co-ordinates analysis，PCoA分析)，評(píng)估不同品種及不同谷子內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的Beta多樣性，用來(lái)研究樣本群落組成的相似性或差異性，與PCA分析類似；圖4結(jié)果顯示，谷子不同部位對(duì)內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)影響更大(76.53%，P<0.001)；從谷子不同部位分析菌群群落組成可看出，不同品種谷子同一部位菌群含量有一定的差異性，沙灣谷子及冀谷22這2個(gè)感病品種含有與小青谷、石榴子(抗谷瘟病)差異較大的內(nèi)生菌群，推測(cè)其可能與谷子谷瘟病抗性相關(guān)；而不同部位之間菌群含量又具有很大的相似性，說(shuō)明部分內(nèi)生菌在植株生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生遷移。冀谷22的莖在PC軸與其他3個(gè)品種距離較遠(yuǎn)，4個(gè)品種的葉鞘在PC軸上距離相對(duì)葉片與莖較近，不同品種的葉片在PC軸上距離相對(duì)均一，2個(gè)感病品種(沙灣谷子、冀谷22)葉片內(nèi)生菌群距抗病品種(小青谷、石榴子)較遠(yuǎn)，同Alpha多樣性分析結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證不同品種谷子及同一品種谷子不同部位內(nèi)生菌群落組成差異較大，葉片較莖、葉鞘菌群差異性高。同時(shí)部分菌群可在不同生長(zhǎng)時(shí)期遷移到不同部位。說(shuō)明器官類型對(duì)內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的影響大于對(duì)品種的影響。

G1.葉片；G3.莖；G4.葉鞘。G1.Leaves；G3.Stems；G4.Leaf sheath.

2.4 同一部位不同品種谷子內(nèi)生菌菌群物種組成分析

通過對(duì)內(nèi)生菌群分布情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)品種谷子葉片共有內(nèi)生菌屬16個(gè)門，占比最高的門為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門，其中，冀谷22優(yōu)勢(shì)菌所屬門為彎曲菌門，沙灣谷子優(yōu)勢(shì)菌門為腸桿菌門(Entotheonellaeota)，石榴子獨(dú)有內(nèi)生菌屬梭桿菌門(Fusobacteriota)；莖部?jī)?yōu)勢(shì)菌門同葉片一致，沙灣谷子獨(dú)有內(nèi)生菌屬螺旋體門(Spirochaetota)，冀谷22在莖部獨(dú)有內(nèi)生菌屬脫硫菌門(Desulfobacterota)及腸桿菌門，小青谷優(yōu)勢(shì)菌門為L(zhǎng)atescibacterota；4個(gè)品種葉鞘共有內(nèi)生菌同屬16個(gè)門，其中沙灣谷子優(yōu)勢(shì)菌門為Armatimonadota,冀谷22(感谷瘟病)獨(dú)有內(nèi)生菌所屬門為腸桿菌門，石榴子獨(dú)有內(nèi)生菌屬M(fèi)ethylomirabilota(圖5)。

綜上，感病品種及抗病品種谷子在同一部位的內(nèi)生菌群分布差異較明顯，同時(shí)，感病品種都具有腸桿菌門這一菌門。此外，冀谷22(感谷瘟病)在葉片、莖及葉鞘內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)組成豐富度為4個(gè)品種中最高，石榴子(抗谷瘟病)在葉鞘中獨(dú)有內(nèi)生菌多樣性較高。

圖5 OTU分布的Veen圖分析Fig.5 Veen plot analysis of the OTU distribution

2.5 同一品種不同部位谷子內(nèi)生菌菌群物種組成分析

通過對(duì)谷子不同部位內(nèi)生菌菌群物種組成分析發(fā)現(xiàn)，同一品種不同部位谷子內(nèi)生菌菌群組成有較大差異，沙灣谷子的莖、葉片、葉鞘獨(dú)有內(nèi)生菌為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門，其中葉片獨(dú)有內(nèi)生菌數(shù)目屬4個(gè)門，分別為NB1-j、Methylomirabilota、脫硫菌門、腸桿菌門，莖優(yōu)勢(shì)菌屬Spirochaetota，葉鞘獨(dú)有內(nèi)生菌屬Latescibacterota、Sumerlaeota，沙灣谷子葉片獨(dú)有內(nèi)生菌門豐富度較高；冀谷22號(hào)葉片獨(dú)有內(nèi)生菌所屬門為MBNT15、Campilobacterota，莖特有內(nèi)生菌屬3個(gè)門，分別為梭桿菌門、脫硫菌門、Sumerlaeota，葉鞘特有內(nèi)生菌屬Latescibacterota；小青谷4個(gè)部位特有內(nèi)生菌屬15個(gè)門，其中葉片獨(dú)有內(nèi)生菌屬脫硫菌門，莖NB1-j、Methylomirabilota，葉鞘SAR324_cladeMarine_group_B、Hydrogenedentes；石榴子葉片、莖、葉鞘共有內(nèi)生菌屬16個(gè)門，葉片獨(dú)有內(nèi)生菌屬Armatimonadota，Methylomirabilota、Elusimicrobiota、Hydrogenedentes、Dependentiae、脫硫菌門、Synergistota、Dadabacteria為石榴子葉鞘特有內(nèi)生菌所屬門。結(jié)果與上述分析一致，4個(gè)品種不同部位優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌所屬門相同，2個(gè)感病品種在葉片、莖、葉鞘3個(gè)部位共有OTU數(shù)目較抗病品種多，推測(cè)其中部分菌屬可能與感病性相關(guān)(圖6)。

A～C.谷子的葉片、莖、葉鞘。A—C.Leaves，stem and leaf sheath of foxtail millet.

每一品種谷子在葉片、莖、葉鞘這3個(gè)部位所含內(nèi)生菌種類不一，推測(cè)葉片接觸外界環(huán)境范圍較廣，菌群可通過外界環(huán)境進(jìn)入植物組織內(nèi)部，造成內(nèi)生菌多樣性存在一定差異性。

3 討論

由于新型病蟲害的不斷出現(xiàn)、化肥大量使用以及全球氣候的劇烈變化，造成環(huán)境惡化嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)定性。植物內(nèi)生菌的分離鑒定及利用將為可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展奠定一定的基礎(chǔ)。環(huán)境中，植物可與多種內(nèi)生菌共存，部分內(nèi)生菌可增加宿主植物固氮、產(chǎn)鐵載體、獲取養(yǎng)分、產(chǎn)生長(zhǎng)激素的能力[17-18]。利用微生物提高植物抵御生物脅迫的能力迫在眉睫。

核心微生物是形成植物相關(guān)微生物組的關(guān)鍵，不僅可促進(jìn)植物自身生長(zhǎng)，還可招募有益微生物幫助其定殖調(diào)節(jié)植物-微生物或微生物-微生物之間的相互作用[19-20]，從而達(dá)到抑制某些病害發(fā)生的目的。本研究首次采用Illumina Miseq高通量測(cè)序法對(duì)4個(gè)品種谷子及其3個(gè)不同部位16S rDNA的V3—V4區(qū)進(jìn)行內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析，研究表明，感(抗)谷瘟病品種內(nèi)生菌群落核心微生物均為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門，這與Jin等[21]對(duì)谷子根部微生物關(guān)聯(lián)分析結(jié)果一致。其中，擬桿菌門具有降解纖維素的能力；綠彎菌門為兼性厭氧生物，在光合作用中不產(chǎn)生氧氣、不能固氮，利用3-羥基丙酸途徑固定二氧化碳；粘菌門由于原生質(zhì)體裸露，繁殖迅速并較易培養(yǎng)，可作為研究原生質(zhì)和生殖生理的一種材料。鄒媛媛等[9]對(duì)多個(gè)水稻品種種子內(nèi)生菌進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)菌屬為泛菌屬(Pantoea)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。經(jīng)COG功能分析，各個(gè)品種谷子內(nèi)生菌功能豐富，包括參與RNA加工和修飾；能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分裂、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組和修復(fù)；次生代謝物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝等。

通過對(duì)不同品種谷子內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同品種谷子內(nèi)生菌物種組成具有一定的差異性，經(jīng)Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，感病品種(沙灣谷子、冀谷22)在葉片及莖部群落多樣性及豐富度較高，可對(duì)其特有內(nèi)生菌群進(jìn)行致病性分析，研究谷瘟病發(fā)病機(jī)制，降低谷瘟病發(fā)病率；在葉鞘時(shí)期，石榴子這一抗病品種豐富度較沙灣谷子占有優(yōu)勢(shì)，對(duì)抗病品種特有菌群進(jìn)一步分析，對(duì)抗病品種選育具有重要意義。小青谷葉鞘物種多樣性較高。結(jié)果表明，不同品種谷子在物種組成上具有較大差異。從谷子不同部位分析菌群群落組成，發(fā)現(xiàn)不同部位菌群差異性較品種間差異對(duì)內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)影響更大，而Jin 等[21]通過對(duì)谷子根微生物群的分類結(jié)構(gòu)和功能分析發(fā)現(xiàn)，微生境和地理位置也是影響谷子根系微生物區(qū)系變化的主要因素，其中，微生境對(duì)β多樣性變化的解釋比例最大，其次是地理位置。不同品種的葉片在PC軸上距離相對(duì)均一，2個(gè)感病品種(沙灣谷子、冀谷22)葉片內(nèi)生菌群距抗病品種(小青谷、石榴子)較遠(yuǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證Alpha多樣性及Beta多樣性分析結(jié)果：谷子部分內(nèi)生菌群落在植株生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生遷移，遷移過程中，由莖至葉鞘再到葉片，而葉片在結(jié)構(gòu)與功能方面均與葉鞘及莖有較大差異，且葉片受外界環(huán)境影響較大，菌群演變更為豐富，因此形成了明顯不同的內(nèi)生菌群。物種分析中發(fā)現(xiàn)，感病品種微生物多樣性高于抗病品種，尤其發(fā)現(xiàn)了大量感病品種或抗病品種中特有的內(nèi)生菌類群，這些內(nèi)生菌對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的形成及其對(duì)寄主谷瘟病抗感特性的影響有待于進(jìn)一步試驗(yàn)探索。

綜上，本研究初步揭示了谷子不同品種及器官的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)特征，為相關(guān)功能菌株的篩選、應(yīng)用及抗病品種的選育奠定了理論基礎(chǔ)。