張冬梅，馮亞艷，修志君，楊春芳，杜美娥，李得宙，張笑宇

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院 生態(tài)工程系，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017010；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；5.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 發(fā)展規(guī)劃處，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

馬鈴薯黑痣病(RhizoctoniasolaniKühn)是馬鈴薯生產(chǎn)中的主要病害。目前主要使用化學(xué)防治，而相比于化學(xué)防治，誘導(dǎo)抗病性具有長效、不污染環(huán)境的特點(diǎn)，已被廣大學(xué)者關(guān)注。硅證實是具有誘導(dǎo)植物抗病性的礦質(zhì)營養(yǎng)元素[1]，但其抗性機(jī)制沒有定論，尤其對分子抗病機(jī)制研究的很少。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)因子，主要功能是激活或抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄，影響植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)[2]。該轉(zhuǎn)錄因子的共同特點(diǎn)是具有1～2個WRKY結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域C端具有1個C2H2或C2HC的鋅指結(jié)構(gòu)[3]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域數(shù)量及鋅指結(jié)構(gòu)的類型將其分為3個組，第1組一般包含2個WRKY域，鋅指結(jié)構(gòu)模式為CX4-5CX22-23HXH；第2組和第3組一般都只包含1個WRKY域，但第3組僅在組成鋅指的氨基酸有變化，為CX7CX22-23HXC[4]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合核酸序列的靶基因啟動子區(qū)域W-box(T)(T)TGAC(C/T)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)[5]，其中TGAC是核心，固定不變[6]，W-box對WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能的發(fā)揮具有不可或缺的作用[7]。W-box主要存在于與植物衰老、逆境脅迫、抵抗病原物等相關(guān)的基因區(qū)域以及水楊酸等誘導(dǎo)基因的啟動子中[8]。

目前，針對WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在擬南芥、水稻、玉米等已測序的物種上，在馬鈴薯中的研究起步較晚且較少。馬鈴薯中已報道82個WRKY轉(zhuǎn)錄因子[9]，Dellagi等[10]研究StWRKY1基因可受軟腐病誘導(dǎo)表達(dá)，該基因可參與馬鈴薯對軟腐病的抗性作用。β-氨基丁酸(BABA)誘導(dǎo)馬鈴薯體內(nèi)的StWRKY5基因[11-12]和StWRKY8基因[13]上調(diào)表達(dá)調(diào)控對晚疫病菌的抗性。轉(zhuǎn)錄因子WRKY參與馬鈴薯黑痣病的抗性目前未見相關(guān)報道。

有報道，WRKY11基因可參與植物的生物脅迫調(diào)控，對擬南芥的研究中，可負(fù)調(diào)控丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato，Pst)[14]、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)AR156[15]和甜菜線蟲(Betavulgaris)[16]誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)；該基因上調(diào)表達(dá)可提高煙草對赤星病(Alternariaalternate)的抗性[17]。在水稻[18]、擬南芥[19]、煙草[20]、大豆[21]、毛竹[22]和陸地棉[23]的抗高溫、抗旱、抗鹽、抗衰老過程中，有報道WRKY11基因可以參與植物的生長發(fā)育過程，調(diào)控植物對外界不良環(huán)境的抵抗能力。馬鈴薯StWRKY11基因與抗病性方面的相關(guān)研究未見報道。

前期明確了硅酸鈉增強(qiáng)馬鈴薯黑痣病菌抗性[24-25]，基于硅酸鈉誘導(dǎo)馬鈴薯黑痣病抗性的轉(zhuǎn)錄組信息，選取上調(diào)表達(dá)量高的StWRKY11。本研究克隆StWRKY11基因，并利用生物信息學(xué)網(wǎng)站對該基因及編碼的蛋白進(jìn)行了理化性質(zhì)、信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域預(yù)測、亞細(xì)胞定位和基因啟動子區(qū)順式作用元件預(yù)測等生物信息分析，旨在為研究該基因功能，揭示硅酸鈉增強(qiáng)馬鈴薯黑痣病抗性的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

供試植物材料：馬鈴薯大西洋(Atlantic)脫毒組培苗，是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院植物病理課題組莖尖剝離，病毒檢測的無毒組培苗。供試病原菌：立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniAG-3)，是本課題組分離鑒定并對馬鈴薯具有強(qiáng)致病性的病原菌。供試培養(yǎng)基：PSA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、MS固體培養(yǎng)基、MS液體培養(yǎng)液。

供試試劑：Plant RNA Extraction Kit試劑盒、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD-19T克隆載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、2 000 bp DNA Marker均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Easy Taq DNA Polymerase、dNTPS、10×Easy Taq Buffer和瓊脂糖購自全式金試劑公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(PD209-02)及質(zhì)粒小提試劑盒(PD103-02)購自天根生化科技(北京)有限公司；氨芐抗生素購自北京索萊寶科技有限公司；其他化學(xué)試劑均購于國內(nèi)試劑公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 將馬鈴薯黑痣病菌置于PSA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)基和病原菌一起用組織搗碎機(jī)搗碎，加水稀釋成濃度為1.0×107個菌絲段/cm3的菌絲懸浮液，作為病原菌接種體。將在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)17～18 d的馬鈴薯大西洋脫毒組培苗，移栽至盛有400 g左右無菌蛭石的直徑18 cm、高20 cm的花盆中，每盆5株，共12盆。每7 d澆1次MS營養(yǎng)液，每次500 mL，培養(yǎng)30 d施硅酸鈉并接菌，即澆入含NaSiO3·9H2O(濃度為3.02 g/L)的MS營養(yǎng)液500 mL，同時將病原菌接種體接種至馬鈴薯幼苗地上莖基部向下約3 cm處，每株接種3 mL，以接菌不施硅酸鈉為對照，于生長季在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場室外培養(yǎng)，處理4 d對馬鈴薯幼苗的地下莖取樣，將樣品用液氮冷凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 馬鈴薯StWRKY11基因克隆

1.2.2.1 馬鈴薯地下莖RNA提取及cDNA合成 利用 Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取處理4 d的馬鈴薯地下莖總RNA，檢測其完整性、濃度和純度；利用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成第一鏈cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2StWRKY11基因擴(kuò)增 以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中StWRKY11基因ORF序列為模板，利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，上游引物：5′-ATGGCTGTAGATTTGTTAAATTATTCG-3′；下游引物：5′-CTAAATCTCTAACCCTAATCGTTCTCC-3′。反應(yīng)體系為25 μL，包括17.5 μL RNase Free dH2O，1.0 μL cDNA，0.5 μL EasyTaqDNA Polymerase，1.5 μL dNTPs Mix，2.5 μL 10×Easy Taq Buffer，上下游引物各1.0 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用天根瓊脂糖凝膠(DNA)純化試劑盒對目的片段進(jìn)行回收純化，用Nanodrop檢測其濃度和純度。

1.2.2.3StWRKY11基因克隆載體構(gòu)建 將PCR膠回收產(chǎn)物連接到pMD19-T克隆載體上，連接反應(yīng)體系為10 μL，包括4.0 μL膠回收產(chǎn)物DNA，1.0 μL pMD-19T，5.0 μL Solution Ⅰ，反應(yīng)條件為16 ℃連接1 h。將重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，再于37 ℃恒溫培養(yǎng)14 h，在 LB(Amp+) 培養(yǎng)基上篩選陽性克隆菌落，挑取單克隆菌落在LB(Amp+)液體培養(yǎng)基，于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)12 h。利用1.2.2.2中StWRKY11基因特異性引物將陽性克隆DH5α大腸桿菌菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取具有明顯電泳條帶的陽性克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，結(jié)果通過DNAMAN進(jìn)行序列比對，確定目的基因成功連入克隆載體。利用天根質(zhì)粒小提試劑盒對測序結(jié)果一致性高的菌液進(jìn)行重組質(zhì)粒提取，并用Nanodrop檢測其濃度和純度。

1.2.3StWRKY11基因的生物信息學(xué)分析 根據(jù)已有的StWRKY11基因序列，翻譯獲得該蛋白質(zhì)的氨基酸序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫ORF Finder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)獲得開放閱讀框并分析；運(yùn)用ExPASy網(wǎng)站中的ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/) 對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測；通過 ExPAsy-ProtScale(http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) 在線分析蛋白質(zhì)的親水性和疏水性；利用TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SignalP 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析和信號肽分析；利用NetPhos 2.0 Server軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)預(yù)測蛋白質(zhì)的磷酸位點(diǎn)；蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)通過SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線進(jìn)行預(yù)測分析；利用Wolf PSORT Ⅱ軟件(https://wolfpsort.hgc.jp/)和Softberry(http：//www.softberry.com/berry.phtml?topic=promoter)預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；利用 Phyre(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html) 預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)建模；利用PLACE網(wǎng)站(https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)對StWRKY11基因啟動子區(qū)順式作用元件預(yù)測；運(yùn)用NCBI 的Blast選取與該基因編碼的蛋白質(zhì)同源性較高且已有研究的其他物種的蛋白質(zhì)氨基酸序列(表1)，運(yùn)用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 不同物種的WRKY蛋白質(zhì)氨基酸序列Tab.1 Amino acid sequences of WRKY proteins in different species

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StWRKY11基因的克隆

2.1.1StWRKY11基因擴(kuò)增檢測結(jié)果 提取馬鈴薯地下莖總RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，StWRKY11-F和StWRKY11-R為上下游引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，利用1.0%瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果顯示，在1 000 bp處有清晰的電泳條帶(圖1)，且周圍沒有雜帶，與預(yù)測的StWRKY11基因的大小1 005 bp基本吻合。該基因序列已提交NMDC，登錄號為NMDCN0000N91。

M.DL2000 Marker；1—2.StWRKY11擴(kuò)增片段。M.DL2000 Marker；1—2.StWRKY11 amplified fragments.

2.1.2StWRKY11基因克隆載體構(gòu)建StWRKY11基因擴(kuò)增產(chǎn)物和pMD19-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌后的菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖2)，在1 000 bp處有清晰的電泳條帶，序列比對的結(jié)果顯示，相似度為97.41%，基因的CDS序列長度為1 005 bp，說明StWRKY11基因被成功連接到克隆載體上。

M.DL2000 Marker；1—3.StWRKY11基因克隆擴(kuò)增片段。M.DL2000 Marker；1—3. StWRKY11 gene clone amplified fragment.

2.2 StWRKY11基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1StWRKY11基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及親疏水性分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫中ORF Finder對StWRKY11基因的開放閱讀框進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因編碼334個氨基酸，且含有鋅指結(jié)構(gòu)CX5CX23HXH(圖3)。利用ProtParam網(wǎng)站對StWRKY11基因表達(dá)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，其分子式為 C3013H5023N1005O1260S199，分子質(zhì)量為81.867 94 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為5.09，原子總數(shù)為10 500，脂肪族氨基酸指數(shù)為29.45，蛋白質(zhì)的半衰期為10 h，不穩(wěn)定指數(shù)為33.71(小于40)，因此將其歸類為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

圖3 StWRKY11基因的堿基序列及其表達(dá)蛋白質(zhì)氨基酸序列Fig.3 Sequence of StWRKY11 gene and amino acid sequence of its expressed protein

利用ExPAsy網(wǎng)站中ProtParam和ProtScale，結(jié)合分析蛋白質(zhì)的疏水性和親水性表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)親水性平均值(GRAVY)為 0.746，在多肽鏈上最大值的異亮氨酸(Ile)為4.500，疏水性最強(qiáng)；最小值的精氨酸(Arg)為-4.500，親水性最強(qiáng)，StWRKY11基因編碼的親水性氨基酸小于疏水性氨基酸，推測該蛋白為疏水性穩(wěn)定蛋白(圖4)。

圖4 StWRKY11基因表達(dá)蛋白質(zhì)親水性/疏水性分析Fig.4 Hydrophilic/hydrophobic analysis of StWRKY11 gene expressed proteins

2.2.2StWRKY11基因表達(dá)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽預(yù)測 利用TMHMM Server v.2.0網(wǎng)站分析StWRKY11基因表達(dá)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分布，結(jié)果表明(圖5)，該蛋白質(zhì)沒有跨膜分布，不是一個膜結(jié)合蛋白質(zhì)。通過SignalP 4.1 Server分析蛋白質(zhì)信號肽，顯示其不含有N端信號肽，該蛋白質(zhì)無信號肽，為非分泌蛋白質(zhì)。

圖5 StWRKY11基因表達(dá)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析Fig.5 Transmembrane region analysis of StWRKY11 gene expression protein

2.2.3StWRKY11基因表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸化分析 利用NetPhos 2.0 Server分析StWRKY11基因編碼的蛋白磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示，共有29個磷酸化位點(diǎn)，其中有3個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)分別在第97，127，277位氨基酸上；4個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)分別在第55，117，239，244位氨基酸上；22個為絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)，說明該蛋白能夠參與細(xì)胞內(nèi)的生長分化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生命活動。

2.2.4StWRKY11基因表達(dá)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位分析 利用SOPMA網(wǎng)站對StWRKY11基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角4種結(jié)構(gòu)形式組成，其中無規(guī)則卷曲(Cc)占比最高，達(dá)61.68%，無規(guī)則卷曲可連接其他二級結(jié)構(gòu)原件；而其他二級結(jié)構(gòu)相對較少，α-螺旋(Hh)占16.77%，延伸鏈(Ee)占13.17%，β-轉(zhuǎn)角(Tt)占8.38%，這些結(jié)構(gòu)散布于整個蛋白質(zhì)中(圖6)。利用Wolf PSORT Ⅱ軟件和Softberry網(wǎng)站對該蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行推測，其可能定位到細(xì)胞核中。

藍(lán)色.α螺旋；紅色.延伸鏈；綠色.β-折疊；黃色.無規(guī)則卷曲。Blue.α-helix；Red.Extended chain；Green.β-folding；Yellow.Random coiling.

2.2.5StWRKY11基因表達(dá)蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過Phyre網(wǎng)站對StWRKY11基因編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該模型未形成多聚體和配體結(jié)構(gòu)，且與擬南芥AtWRKY1基因編碼的蛋白質(zhì)相似性最高，達(dá)55%(圖7)。

圖7 StWRKY11基因表達(dá)蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Prediction of tertiary structure of StWRKY11 gene expressed protein

2.2.6StWRKY11基因啟動子區(qū)順式作用元件預(yù)測 利用網(wǎng)站PLACE分析StWRKY11基因啟動子上游的順式作用元件可見(表2)，啟動子上游區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄因子固有的核心元件CAAT區(qū)(CAAT-box)和TATA區(qū)(TATA-box)；逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，銅響應(yīng)元件(CURECORECR)、MYB順式元件(MYB2AT)、DNA結(jié)合蛋白調(diào)控元件(DOFCOREZM)、轉(zhuǎn)錄激活元件(ARR1)、CGCG區(qū)(CGCG-box)和W-區(qū)(W-box)；植物生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，GATA區(qū)(GATA-box)、光調(diào)控順式元件(GT1CONSENSUS)、ARE調(diào)控元件(ARE)、葉肉特異基因表達(dá)調(diào)控元件(CACTFTPPCA1)、花粉調(diào)控元件(GTGANTG10)和脫水順式元件(CBFHV)；激素響應(yīng)相關(guān)的作用元件，赤霉素調(diào)控元件(PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A)、茉莉酸調(diào)控元件(ASF1MOTIFCAMV)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)。

表2 StWRKY11基因啟動子區(qū)的順式作用元件分析Tab.2 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of StWRKY11 gene

2.2.7 不同物種WRKY序列比對及聚類分析 馬鈴薯StWRKY11基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列和其他物種比較的結(jié)果表明(圖8)，不同物種中的WRKY蛋白質(zhì)氨基酸序列均有一段保守的氨基酸序列，即WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族所特有的WRKYGQK序列和鋅指結(jié)構(gòu)。

圖8 StWRKY11基因表達(dá)蛋白質(zhì)與其他物種的WRKY蛋白質(zhì)氨基酸序列比對Fig.8 The amino acid sequence of StWRKY11 gene expressed protein was compared with that of WRKY protein of other species

通過MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，StWRKY11基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與馬鈴薯中的StWRKY5親緣關(guān)系最近，同源性為95%(圖9)。

圖9 StWRKY11基因表達(dá)蛋白質(zhì)與其他物種的WRKY蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.9 The StWRKY11 gene expresses proteins in a phylogenetic tree with WRKY proteins of other species

3 結(jié)論與討論

植物在受到衰老、干旱和鹽脅迫后，會激活水楊酸(Salicylic acid，SA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18-19]，促進(jìn)WRKY11基因上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步可能通過抑制活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的積累或清除過多的ROS及減少膜損傷等方面提高植物耐受性[26]。當(dāng)植物受到生物脅迫時，通常會啟動茉莉酸和乙烯(ET)的合成途徑，從而激活JA/ET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，響應(yīng)抗病轉(zhuǎn)錄因子WRKY11的表達(dá)，進(jìn)一步激活下游關(guān)鍵靶基因(如PR5/Gluc/PRB-1b)[23]和抗病相關(guān)基因(NPR1、AOS和LOX2)[27]的表達(dá)，從而使植株體自身產(chǎn)生對病原菌的抗性。蠟樣芽孢桿菌AR156侵染擬南芥時，WRKY11基因受JA抑制表達(dá)，以此激發(fā)植株產(chǎn)生系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病性[21]，張潔等[28]在2017年研究發(fā)現(xiàn)，煙草TT8的WRKY11基因受JA誘導(dǎo)表達(dá)，同時也受到ET和SA的共同抑制，負(fù)調(diào)控?zé)煵輰S瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus)的抗性。本研究通過分析硅酸鈉增強(qiáng)馬鈴薯黑痣病抗性的轉(zhuǎn)錄組，篩選到表達(dá)量較大基因WRKY11，對該基因進(jìn)行了克隆，并進(jìn)一步探討其功能，期望從分子上闡明硅酸鈉誘導(dǎo)馬鈴薯抗黑痣病的機(jī)制。

本研究利用克隆技術(shù)獲得了馬鈴薯StWRKY11基因的全長序列，并通過在線軟件ORF Finder、ProtParam、TMHMM Server、SignalP 4.1 Server 、NetPhos 2.0 Server、Wolf PSORT Ⅱ、SOPMA和Phyre分析了該基因生物學(xué)信息，結(jié)果表明，開放閱讀框為1 005 bp，編碼了334個氨基酸，表達(dá)蛋白序列中存在結(jié)構(gòu)為WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，并含有CX5CX23HXH鋅指結(jié)構(gòu)，明確其具有第2類 WRKY的共同結(jié)構(gòu)特征，第2組WRKY蛋白又可以根據(jù)鋅指基序中C2之間氨基酸的數(shù)量和類型進(jìn)一步分為5個亞組(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 和Ⅱe)[29]，StWRKY11基因是馬鈴薯WRKY第2類Ⅱd亞組成員。Ⅱd類WRKY蛋白中保守結(jié)構(gòu)域是可以與鈣調(diào)素結(jié)合的“C motif”，Ca2+能參與植物抗性信號傳導(dǎo)[30]，推測Ⅱd類WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能作為Ca2+受體，通過其“C motif”與鈣調(diào)素結(jié)合，進(jìn)而響應(yīng)抗病反應(yīng)[31]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在參與植物生物學(xué)過程中，其活性會受絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)的調(diào)控，MAPK、MAPK激酶(MAPKK)和MAPKK激酶(MAPKKK)構(gòu)成MAP激酶級聯(lián)放大系統(tǒng)，它能通過一系列的磷酸化反應(yīng)將外界信號逐步放大并傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而引起相應(yīng)的生理生化活動[32-33]，其中磷酸化和去磷酸化都是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要方式，磷酸化也是一種重要的翻譯后修飾方式[34]，磷酸化修飾位點(diǎn)與植物細(xì)胞的增殖分化、代謝調(diào)節(jié)等都有密切聯(lián)系[35]。研究報道，MAPK可作為底物和磷酸化激活植物的WRKY基因表達(dá)[36-37]，由此可知，MAPK可能處于WRKY的上游，其功能會受MAPK激酶的修飾[38]。Kim等[38]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施用水楊酸和茉莉酸等外源因子誘導(dǎo)煙草時，會與其細(xì)胞膜的受體特異識別并結(jié)合，激活植株體內(nèi)的MAPK信號網(wǎng)絡(luò)通路，MAPK可以通過磷酸化或者去磷酸化將信號傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而激活或抑制WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的活性。本試驗StWRKY11基因編碼的氨基酸，共含有29個磷酸化位點(diǎn)，該基因編碼蛋白質(zhì)存在多種表達(dá)調(diào)控方式，能夠參與細(xì)胞內(nèi)的生長分化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生命活動，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果相一致[39]。

馬鈴薯StWRKY11基因表達(dá)蛋白的二級結(jié)構(gòu)有4種結(jié)構(gòu)形式：結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲，這為實現(xiàn)其功能提供了空間結(jié)構(gòu)及功能元件。亞細(xì)胞定位預(yù)測中，StWRKY11基因表達(dá)蛋白可能定位于細(xì)胞核中，這與以往研究報道中WRKY轉(zhuǎn)錄因子始終定位于細(xì)胞核內(nèi)[40]的結(jié)果相吻合。StWRKY11基因表達(dá)蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)，StWRKY11無法通過跨膜結(jié)構(gòu)域固定在細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上，推測StWRKY11通過核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核中[41]，證實了該蛋白定位于細(xì)胞核的結(jié)果。

Rushton等[42]利用只含W-box轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件作為啟動子，研究W-box可參與擬南芥對病原體及其他脅迫因子的防衛(wèi)或脅迫反應(yīng)，反應(yīng)程度與W-box的數(shù)量及位置有關(guān)。本研究中，StWRKY11基因表達(dá)蛋白在保守結(jié)構(gòu)域有高度相似性，均含有保守序列(T)TGAC(C/T)(W-box)。推測硅酸鈉增強(qiáng)馬鈴薯黑痣病的抗性可能與保守結(jié)構(gòu)域有關(guān)。

StWRKY11基因啟動區(qū)順式作用元件預(yù)測啟動子區(qū)有與抗性脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式調(diào)控元件，還有與生長發(fā)育及赤霉素、脫落酸和茉莉酸等激素響應(yīng)的順式作用調(diào)控元件，該基因可能既參與馬鈴薯對黑痣病菌的抗性也參與生長發(fā)育相關(guān)途徑，這也可能為解釋硅酸鈉增強(qiáng)馬鈴薯黑痣病的抗性以及增加產(chǎn)量和改善品質(zhì)的現(xiàn)象提供依據(jù)。

馬鈴薯StWRKY11基因與馬鈴薯StWRKY5基因表達(dá)蛋白在進(jìn)化樹上親緣關(guān)系最近，同源性為95%，該基因在BABA誘導(dǎo)馬鈴薯提高馬鈴薯晚疫病(Phytophthorainfestans)抗性時表達(dá)，表明該基因參與了馬鈴薯的抗病反應(yīng)[43]。結(jié)果顯示，與其他物種的WRKY蛋白同源性較低，這與其他學(xué)者的研究一致，即屬內(nèi)同源性高，屬間同源性相對較低[44]。