安笑笑，張博皓，戴麗君，白 旭，石 軍，張 霞，張 勇，3，張全偉，趙興緒，3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省動(dòng)物生殖生理及繁殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

誘導(dǎo)排卵型動(dòng)物(如貓、雪貂和駱駝等)在自然條件下繁殖性能較低[1]，主要原因是誘導(dǎo)排卵型動(dòng)物繁殖季節(jié)短、早期胚胎死亡率高[2]。因此，探究誘導(dǎo)排卵動(dòng)物的繁殖生理特點(diǎn)及相關(guān)機(jī)制，可有效提升其繁殖性能、優(yōu)化其生產(chǎn)性狀，開(kāi)發(fā)和保護(hù)其遺傳資源。家兔作為典型的誘導(dǎo)排卵型動(dòng)物之一，體型小、生性溫和、繁殖力高、易于飼養(yǎng)，以其建立誘導(dǎo)排卵動(dòng)物模型，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可為其他誘導(dǎo)排卵動(dòng)物如貓科(獅、虎等)、駝科(雙峰駝、羊駝等)的誘導(dǎo)排卵機(jī)理和特殊生殖機(jī)理的研究提供參考。

哺乳動(dòng)物生殖軸系(下丘腦-垂體-性腺軸系，Hypothalamus-Pituitary-Gonadal axis，HPG)通過(guò)調(diào)控生殖激素的分泌調(diào)節(jié)生殖過(guò)程[3]。下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)一方面可促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞增殖[4]，進(jìn)而促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞分泌孕酮和雌二醇[5-7]；另一方面GnRH通過(guò)垂體門脈系統(tǒng)調(diào)控腺垂體釋放促卵泡素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體素(Luteinizing hormone，LH)。這些激素作用于卵巢、子宮和胎盤等生殖組織而影響動(dòng)物的生殖過(guò)程。雌激素能夠促進(jìn)妊娠期間絨毛胎盤內(nèi)新血管形成和子宮內(nèi)膜的重塑，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育，也可刺激子宮和陰道腺上皮增生促進(jìn)分娩[8-9]。孕激素對(duì)早期胚胎發(fā)育和著床具有重要作用[10]。孕激素分泌不足嚴(yán)重影響胚胎著床和生長(zhǎng)[11]。雌二醇分泌不足可降低胎兒活產(chǎn)率[11]。吻素(KISS1)首先在人類惡性黑色素瘤雜交體系中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是一種新的人類惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移抑制因子[12]。KISS1基因編碼多肽類激素Kisspeptins，是一種細(xì)胞間信號(hào)肽，在生殖的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中扮演重要角色，通過(guò)其受體KISS1R的介導(dǎo)來(lái)發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，KISS1/KISS1R系統(tǒng)是GnRH脈沖發(fā)生的上游分子，可有效刺激GnRH促進(jìn)垂體釋放LH調(diào)控生殖過(guò)程[12-14]。卵巢KISS1/KISS1R系統(tǒng)可促進(jìn)孕酮分泌，對(duì)動(dòng)物妊娠維持，提高活產(chǎn)率有顯著作用；血液中Kisspeptin低水平可導(dǎo)致孕中后期胎兒生長(zhǎng)受限、子癇前期并發(fā)癥[15]。研究表明，酪氨酸蛋白激酶A(Tyrosine protein kinase A，TrkA)對(duì)卵泡發(fā)育、排卵、激素合成，甚至卵巢疾病發(fā)生等都具有重要的調(diào)控作用[16]。TrkA作為神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor，NGF)的高親和力受體，NGF通過(guò)TrkA影響神經(jīng)元細(xì)胞分化、存活，同時(shí)也參與調(diào)控動(dòng)物生殖活動(dòng)。甘肅省動(dòng)物繁殖生理與生殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室早期率先提出雙峰駝為誘導(dǎo)排卵型動(dòng)物，誘導(dǎo)排卵的關(guān)鍵物質(zhì)為精清誘導(dǎo)排卵因子(Ovulation inducing factor，OIF)，并探明其生理作用是引發(fā)母駝垂體釋放LH形成排卵峰進(jìn)而誘發(fā)其排卵[17]。后續(xù)研究證明，OIF的化學(xué)本質(zhì)為神經(jīng)生長(zhǎng)因子[18]。綜上所述，KISS1和TrkA在雌性動(dòng)物生殖過(guò)程發(fā)揮重要作用，對(duì)初情期的啟動(dòng)、卵泡發(fā)育和排卵、以及生殖激素的分泌有促進(jìn)作用，同時(shí)局部作用于生殖器官調(diào)控動(dòng)物繁殖過(guò)程。然而，KISS1和TrkA在誘導(dǎo)排卵動(dòng)物生殖軸中的表達(dá)情況尚不完全清楚。自發(fā)排卵和誘發(fā)排卵動(dòng)物妊娠過(guò)程中KISS1和TrkA功能和作用機(jī)制及其異同仍有待深入研究。因此，本研究以妊娠家兔(Oryctolaguscuniculusf.domestica)為研究對(duì)象，探討妊娠家兔生殖軸組織中KISS1和TrkA的分布和表達(dá)情況。以期為闡釋KISS1和TrkA在誘導(dǎo)排卵動(dòng)物妊娠過(guò)程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集妊娠家兔(n=6，妊娠期14～18 d)生殖軸(下丘腦、垂體、卵巢和子宮)組織，部分組織于4%多聚甲醛固定，用于制作組織石蠟切片；部分組織于-80 ℃凍存，提取RNA和蛋白質(zhì)用于基因和蛋白表達(dá)分析。

主要試劑：兔抗TrkA(Code；bs-0193R)、兔抗β-actin(Code；bs-oo61R)、羊抗兔IgG(Code；bs-o295GHRP)、免疫組織化學(xué)試劑盒(Code；sp-0022)購(gòu)自北京博奧森生物公司；兔抗KISS1(Code；18375-1-AP)購(gòu)自武漢三鷹生物有限公司；DAB(3，3N-diaminobenzidine)顯色試劑盒(Code；G1212-200T)購(gòu)自塞維爾生物科技有限公司；FastPure Cell/Tissue Total RNA lsolation Kit 試劑盒(Code；RC101-01)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Evo-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ(Code；AG11711)購(gòu)自湖南艾科瑞生物科技有限公司；2×EasyPfuPCR SuperMix(Code；AS111)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；ECL Plus 超敏發(fā)光液(Code；PE0010)，高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(Code；R0010)、蛋白酶抑制混合液(100×PIC)(Code；P6730)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Code；AR0140)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；其他均為常規(guī)化學(xué)試劑(分析純)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色 蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-Eosin Staining，H&E)：將4%多聚甲醛固定好的組織通過(guò)石蠟包埋制成組織蠟塊，切片機(jī)制備石蠟組織切片，經(jīng)脫蠟、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、流水返藍(lán)、伊紅復(fù)染、中性樹(shù)膠封片后，鏡下攝片分析。免疫組織化學(xué)染色(Immunohistochemistry staining，IHC)：組織切片經(jīng)脫蠟，抗原修復(fù)，按照免疫組織化學(xué)試劑盒(北京，博奧森)說(shuō)明[19]，依次加入3% H2O2、封閉液(A液)、兔源KISS1(1∶500)和TrkA(1∶500)、4 ℃濕盒過(guò)夜孵育、試劑B和試劑C 37 ℃孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、1%鹽酸酒精分化、流水沖洗返藍(lán)、梯度酒精脫水、二甲苯透明后樹(shù)膠封片，使用Olympus Dp71生顯微鏡攝片。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中家兔KISS1基因(XM_008268539.2)、TrkA基因(XM_008264290.2)和GAPDH基因(NM_001082253.1)CDS序列，使用Primer 3.0設(shè)計(jì)各基因特異性引物，由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成(表1，2)。

表1 半定量PCR引物序列及參數(shù)Tab.1 The primer sequences and parameter of RT-PCR

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列及參數(shù)Tab.2 The primer sequences and parameter of qRT-PCR

1.2.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 無(wú)菌條件下，取20 mg 組織經(jīng)液氮研磨后，按照FastPure Cell/Tissue Total RNA lsolation Kit 試劑盒操作說(shuō)明[20]提取各組織的總RNA，超微量核酸測(cè)定儀測(cè)定其純度和濃度，取700 ng總RNA，根據(jù)Evo-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ操作說(shuō)明合成cDNA，產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 半定量PCR(Semi-quantitative interpretation，RT-PCR) 以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體系為20 μL，其中2×EasyPfuPCR SuperMix 10 μL,10 μmol/L 上下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,RNase free water 6 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性30 s，58.5 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，共38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外凝膠系統(tǒng)拍片，ImageJ軟件進(jìn)行圖像光密度值分析，KISS1和TrkA分別與內(nèi)參GAPDH灰度值作比值表示基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR) 以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體系為20 μL，其中2×TranStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，10 μmol/L 上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，RNase free water 7 μL。PCR反應(yīng)程序采用2步法：90 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共重復(fù)40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品重復(fù)3次，待反應(yīng)結(jié)束后，觀察溶解曲線與擴(kuò)增曲線，采集Ct值，使用2-ΔΔct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量并分析目的基因表達(dá)模式。

1.2.6 免疫印跡(Western Blot,WB) 組織經(jīng)液氮研磨后，加入1 mL含有1%苯甲基磺酰氟(Pheny methanesulfonyl fluoride，PMSF)和1%蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor mixture，PIC)混合物的高效組織細(xì)胞裂解液(Radio immunoprecipitation assay buffer，RIPA)，4 ℃反復(fù)裂解1 h，離心后取上清液，取適量蛋白通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定其濃度，部分蛋白與5×蛋白上樣緩沖液混合，95 ℃變性10 min，樣本置于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。每孔上液總蛋白含量?5 μg，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%(m/V)脫脂奶粉室溫封閉2 h，兔源β-actin(1∶4 500)、兔源TrkA(1∶300)和兔源KISS1(1∶500)于4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二級(jí)抗體羊抗兔IgG(1∶5 000)37 ℃孵育2 h，底物化學(xué)發(fā)光液(Electronchemi-luminescence，ECL)發(fā)光顯色、化學(xué)發(fā)光儀曝光、Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，KISS1和TrkA蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值作比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 妊娠家兔生殖軸組織形態(tài)學(xué)觀察

H&E染色結(jié)果如圖1所示，妊娠家兔下丘腦組織中可見(jiàn)細(xì)胞較小、核圓、著色較深的神經(jīng)內(nèi)分泌小細(xì)胞。細(xì)胞較大、呈不規(guī)則形狀、胞核形態(tài)不一、胞質(zhì)被染成紅色為神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞(圖1-A)。腺垂體組織中嗜堿性細(xì)胞可見(jiàn)橢圓形或多邊形、胞質(zhì)呈紫色、胞核圓、著色較深；嗜酸性細(xì)胞胞質(zhì)被染成紅色、細(xì)胞核圓、著色淺；嫌色細(xì)胞較小、呈多角形或圓形、細(xì)胞質(zhì)染色較淺、光鏡下細(xì)胞輪廓不明顯(圖1-B)。家兔卵巢組織由不同發(fā)育階段的卵泡、結(jié)締組織及疏松組織組成；初級(jí)卵泡中明顯可見(jiàn)初級(jí)卵母細(xì)胞、卵泡細(xì)胞、透明帶組織，結(jié)締組織中含卵巢間質(zhì)細(xì)胞(圖1-C)；次級(jí)卵泡中卵泡細(xì)胞層數(shù)變多，可見(jiàn)明顯的卵泡腔；卵泡細(xì)胞最內(nèi)層是大量顆粒細(xì)胞，卵泡膜分化為內(nèi)外2層(圖1-D)。黃體中分布有膜黃體細(xì)胞和顆粒黃體細(xì)胞，膜黃體細(xì)胞數(shù)量較少，染色深，多分布于黃體周邊；顆粒黃體細(xì)胞較大、呈多邊形、數(shù)量多 (圖1-E)。家兔子宮組織可見(jiàn)子宮腺和固有層，其中，固有層細(xì)胞數(shù)量少，有胚性結(jié)締組織和豐富的血管；子宮腺由排列緊密的單層柱狀上皮細(xì)胞組成(圖1-F)。

A.下丘腦；B.垂體；C和D.卵巢；E.黃體；F.子宮；A～F放大倍數(shù)均為400× 。 MNEC.神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞；PNEC.神經(jīng)內(nèi)分泌小細(xì)胞；CC.嫌色細(xì)胞；BC.嗜堿性細(xì)胞；EC.嗜酸性細(xì)胞；PO.初級(jí)卵母細(xì)胞；ZP.透明帶；FC.卵泡細(xì)胞；PF.初級(jí)卵泡；IC.間質(zhì)細(xì)胞；FA.卵泡腔；SG.顆粒層；TFI.卵泡膜內(nèi)層；TFE.卵泡膜外層；SO.次級(jí)卵母細(xì)胞；GLC.顆粒黃體細(xì)胞；TLC.膜黃體細(xì)胞；UG.子宮腺；LP.固有層。圖2同。

2.2 妊娠家兔生殖軸組織中KISS1和TrkA蛋白分布

妊娠家兔生殖軸組織中KISS1和TrkA蛋白免疫陽(yáng)性結(jié)果如圖2所示，下丘腦組織未見(jiàn)KISS1蛋白免疫陽(yáng)性表達(dá)(圖2-A1)。垂體組織各細(xì)胞中均有KISS1蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)，主要分布于嗜堿性細(xì)胞(圖2-A2)；卵巢組織透明帶可見(jiàn)KISS1蛋白陽(yáng)性表達(dá)(圖2-A3)；子宮組織未見(jiàn)KISS1蛋白免疫陽(yáng)性表達(dá)(圖2-A4)。TrkA蛋白在生殖軸組織中均有陽(yáng)性表達(dá) (圖2-B)。下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌小細(xì)胞被特異性顯色為棕黃色(圖2-B1)；垂體嗜堿性細(xì)胞有明顯的TrkA蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)(圖2-B2)；卵巢顆粒黃體細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞可見(jiàn)TrkA蛋白陽(yáng)性表達(dá)(圖2-B3)；子宮固有層顯示TrkA蛋白陽(yáng)性分布(圖2-B4)。陰性對(duì)照組均無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)(圖2-C)。

A.KISS1蛋白IHC染色；B.TrkA蛋白IHC染色；C.陰性對(duì)照(A～C放大倍數(shù)均為400×)。SCE.單層柱狀上皮。A.KISS1 protein was stained by immunohistochemically；B.TrkA protein was stained by immunohistochemically；C.Negative control(The magnification of A—C was 400×).SCE.Simple columnar epithelium.

2.3 妊娠家兔生殖軸組織中Kiss1和TrkA基因表達(dá)

2.3.1 半定量PCR 妊娠家兔生殖軸組織中KISS1和TrkA基因的表達(dá)規(guī)律如圖3所示，KISS1和TrkA基因在各組織中均有表達(dá)(圖3-A′)。光密度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，下丘腦、垂體、卵巢組織中KISS1表達(dá)量均高于子宮，卵巢組織中KISS1表達(dá)豐度最高，下丘腦次之，且各組織存在顯著性差異(P<0.05)(圖3-B′)。 妊娠家兔卵巢、垂體組織中TrkA基因表達(dá)豐度極顯著低于子宮組織，其中垂體相對(duì)表達(dá)量最低，組間差異極顯著(P<0.01)，下丘腦與子宮組織TrkA表達(dá)量無(wú)顯著差異 (圖3-C′)。

A′.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)妊娠家兔生殖軸組織中KISS1和TrkA mRNA表達(dá)豐度。 B′. KISS1 mRNA表達(dá)水平。C′.TrkA mRNA表達(dá)水平。不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母代表組間差異極顯著(P<0.01)。 圖4—5同。

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)妊娠家兔HPG組織中KISS1和TrkA基因表達(dá)模式，結(jié)果如圖4所示，KISS1和TrkA基因在生殖軸各組織中均有表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示，KISS1相對(duì)表達(dá)量從大到小依次是卵巢、下丘腦、垂體、子宮。且卵巢和下丘腦組織與垂體和子宮組織表達(dá)量存在顯著性差異(P<0.05)(圖4-A)。 妊娠家兔垂體、卵巢、子宮組織中TrkA基因表達(dá)豐度依次呈上升趨勢(shì)，下丘腦與子宮組織TrkA表達(dá)量無(wú)顯著差異，與垂體、卵巢組織組間差異極顯著(P<0.01)(圖4-B)。且qRT-PCR結(jié)果與RT-PCR結(jié)果趨勢(shì)一致，但組間差異性與RT-PCR結(jié)果不完全一致，這可能與不同引物序列相關(guān)。

圖4 qRT-PCR分析妊娠家兔生殖軸組織中KISS1和TrkA mRNA表達(dá)規(guī)律Fig.4 Relative expression levels of KISS1 and TrkA mRNA in the HPG axis of pregnant Oryctolagus cuniculus f. domestica with qRT-PCR

2.4 妊娠家兔生殖軸組織中KISS1和TrkA蛋白表達(dá)

妊娠家兔生殖軸組織中KISS1和TrkA蛋白表達(dá)如圖5所示，KISS1蛋白僅在垂體組織中表達(dá)，TrkA蛋白在下丘腦、垂體、卵巢、子宮中均有表達(dá)(圖5-A)。KISS1蛋白在垂體組織相對(duì)表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果高達(dá)180.04(圖5-B)；子宮組織中TrkA蛋白相對(duì)表達(dá)量最高，其次依次為卵巢、垂體，下丘腦中表達(dá)量最低(圖5-C)，且各組織間存在顯著性差異(P<0.05)。

A.聚丙酰胺凝膠電泳檢測(cè)妊娠家兔生殖軸組織中KISS1、TrkA和β-actin蛋白表達(dá)豐度。A.The protein expression levels of KISS1，TrkA and β-actin in HPG axis tissues of pregnant rabbits were detected by polyproacrylamide gel electrophoresis.

3 結(jié)論與討論

妊娠是哺乳動(dòng)物種系繁衍的關(guān)鍵生理過(guò)程。妊娠維持不僅受孕酮的調(diào)節(jié)，且依賴生殖軸分泌的生殖激素協(xié)調(diào)作用。妊娠過(guò)程中生殖軸適應(yīng)性變化、生殖激素信號(hào)傳遞、相關(guān)基因及蛋白的時(shí)空特異性表達(dá)均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。妊娠識(shí)別后，卵巢合成和分泌的孕酮通過(guò)反饋機(jī)制抑制下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌小細(xì)胞和垂體嗜堿性細(xì)胞釋放GnRH、FSH和LH，從而阻止卵泡發(fā)育、排卵，暫時(shí)停止母體發(fā)情周期。研究報(bào)道，自發(fā)排卵動(dòng)物中KISS1和TrkA可通過(guò)生殖軸調(diào)控動(dòng)物生殖，也可與其特異性受體或配體結(jié)合局部調(diào)節(jié)生殖軸器官的功能[21-22]。但其在誘導(dǎo)排卵動(dòng)物中的功能尚不明確，因此,闡明KISS1和TrkA在誘導(dǎo)排卵型動(dòng)物生殖軸組織中的分布特征、表達(dá)規(guī)律和其功能將有助于深入探究誘導(dǎo)排卵型動(dòng)物的生殖機(jī)理。

通過(guò)H&E染色系統(tǒng)性觀察了妊娠家兔HPG組織的形態(tài)變化。HPG組織結(jié)構(gòu)清晰完整。下丘腦被分為若干核團(tuán)，具有分泌催產(chǎn)素和加壓素功能的神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞主要分布在視上核和室旁核，而分布在正中隆起、弓狀核的神經(jīng)內(nèi)分泌小細(xì)胞通過(guò)分泌釋放激素，經(jīng)門脈系統(tǒng)到達(dá)腺垂體，進(jìn)而調(diào)節(jié)腺垂體的生理功能和生殖激素分泌。腺垂體嗜堿性細(xì)胞合成和分泌的FSH和LH，協(xié)同作用于卵巢可促進(jìn)卵泡成熟、控制卵子排出、調(diào)節(jié)卵巢功能[23]。黃體細(xì)胞分泌的孕酮作用于子宮，改善子宮營(yíng)養(yǎng)，維持正常妊娠過(guò)程[3]。這些細(xì)胞均參與動(dòng)物生殖和妊娠過(guò)程。Smith等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊垂體中存在KISS1R表達(dá)并刺激LH分泌增加。本研究免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)KISS蛋白主要定位于垂體嗜堿性細(xì)胞胞漿和透明帶中。結(jié)果表明，KISS1陽(yáng)性表達(dá)與妊娠維持密切相關(guān)。研究報(bào)道，Kisspeptin及其受體KISS1R 在自發(fā)排卵動(dòng)物外周組織尤其是與生殖和代謝相關(guān)的組織如下丘腦、垂體、卵巢、子宮、胎盤、睪丸、脂肪組織、胰腺和肝臟中廣泛表達(dá)[21，25-27]；妊娠家兔性腺軸組織KISS1蛋白表達(dá)與文獻(xiàn)報(bào)道自發(fā)排卵動(dòng)物在組織中的表達(dá)情況存在差異，說(shuō)明自發(fā)排卵動(dòng)物與誘導(dǎo)排卵動(dòng)物生殖調(diào)控機(jī)制存在異同。研究發(fā)現(xiàn)，TrkA在雌性動(dòng)物生殖器官中廣泛表達(dá)[16，28-29]，促性腺激素、雌激素、孕酮等能刺激TrkA及其配體NGF的表達(dá)，而NGF也能刺激孕激素和雄激素的釋放，影響卵泡發(fā)育成熟、控制卵母細(xì)胞排出、調(diào)節(jié)卵巢功能、影響早期胚胎的發(fā)育能力[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，TrkA蛋白存在于妊娠家兔所有生殖軸組織中，主要分布在生殖軸各組織內(nèi)分泌細(xì)胞中。結(jié)果表明，TrkA可能是通過(guò)參與調(diào)控生殖軸組織生殖激素的合成和分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)家兔的妊娠過(guò)程[22，31-33]。RT-PCR和qRT-PCR顯示，妊娠家兔HPG組織均有KISS1基因表達(dá)，而WB結(jié)果顯示，KISS1蛋白僅在垂體組織中表達(dá)；KISS1基因和蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)的不一致可能與真核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯存在時(shí)空間隔有關(guān)[34]。妊娠家兔TrkA基因和蛋白表達(dá)量在子宮中最高，說(shuō)明TrkA參與調(diào)控子宮生理功能和妊娠維持。據(jù)報(bào)道，TrkA表達(dá)異常導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，其表達(dá)水平與患者的腫瘤臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)[35]。研究結(jié)果顯示，KISS1和TrkA通過(guò)生殖軸組織調(diào)控家兔妊娠過(guò)程。前人研究也表明，KISS1和TrkA在自發(fā)排卵型動(dòng)物生殖軸內(nèi)分泌激素的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但對(duì)具體調(diào)控機(jī)制的研究還不完善，仍需深入研究。本研究為誘導(dǎo)排卵動(dòng)物妊娠過(guò)程中KISS1和TrkA的分子功能和機(jī)制的深入研究提供參考依據(jù)。

KISS1蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)主要定位于妊娠家兔腺垂體嗜堿性細(xì)胞，TrkA蛋白在妊娠家兔生殖軸組織中均有免疫表達(dá)且主要定位于內(nèi)分泌細(xì)胞。妊娠家兔生殖軸組織中KISS1和TrkA基因與蛋白均有表達(dá)且其表達(dá)趨勢(shì)存在差異。結(jié)果表明，KISS1和TrkA可能通過(guò)調(diào)節(jié)生殖激素分泌維持誘導(dǎo)排卵型動(dòng)物妊娠并影響其生殖軸器官的生長(zhǎng)發(fā)育和功能。這為后續(xù)誘導(dǎo)排卵動(dòng)物繁殖調(diào)控機(jī)制的研究提供參考依據(jù)。