王廣胤 孫偉強 馬新壯 王 力,

(1 蚌埠醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，安徽省蚌埠市 233030；2 慢性疾病免疫學基礎(chǔ)與臨床安徽省重點實驗室，安徽省蚌埠市 233030)

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)是一種應(yīng)用廣泛的全氟類化合物，由于PFOA具有穩(wěn)定的C-F鍵，故其具有極高的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性。PFOA是一種常見的表面活性劑，存在于不粘炊具的金屬涂層，以及紡織品、紙張、清潔和個人護理產(chǎn)品(如洗發(fā)水、牙線)等的表面涂層中[1]，PFOA釋放到環(huán)境中能夠抵抗物理或化學機制的降解，對環(huán)境造成持續(xù)和廣泛的污染[2-3]。人們可通過使用含PFOA產(chǎn)品或攝入受污染的水和食物接觸到PFOA。研究表明，PFOA在機體中難以代謝排出，經(jīng)腸肝循環(huán)吸收后，主要分布到腎臟和肝臟[4]。PFOA暴露會對多種器官造成損傷，可能與PFOA抑制脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、炎癥和免疫相關(guān)基因的表達有關(guān)[5]。類黃酮是一類分子量較低的多酚類植物化學物質(zhì)，蘆丁屬于典型的類黃酮，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗凝血、預(yù)防和治療心腦血管疾病等藥理作用[6-8]。蘆丁屬于維生素P，主要存在于日常食用的蔬菜、水果和中草藥，其以各種形式被用于食品制造，例如著色劑、抗氧化劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、紫外線吸收劑等，同時也是用于制作藥物、化妝品、化學工業(yè)用品及動物飼料的活性成分[9]。已有研究表明，蘆丁可通過減輕氧化應(yīng)激和修復(fù)腎小管損傷來改善腎功能[10]，對糖尿病腎病[11]、缺血再灌注腎損傷[12]及藥物性腎損害[13]等具有顯著的改善作用。本研究探討蘆丁對PFOA誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷的保護作用，為蘆丁的藥用研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 蘆丁(純度≥98%)購自北京百靈威科技有限公司(批號：153-18-4)；PFOA(純度≥98%)購自Sigma-Aldrich公司(批號：335-67-1)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒(微孔法,批號：20200706)、總膽固醇測定試劑盒(單試劑GPO-PAP法，批號：20210120T)、三酰甘油測定試劑盒(單試劑GPO-PAP法，批號：20210118)、HDL-C測定試劑盒(批號：20210123)、LDL-C測定試劑盒(批號：20210119)、尿素測定試劑盒(批號：20210125)、肌酐測定試劑盒(20210108)等均購自深圳雷杜生命科學股份有限公司。ME203E/02型電子天平購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，KZ-Ⅱ型高通量組織研磨儀購自Servicebio公司，Synergy2型酶標儀購自BioTek公司，KDC-160HR型高速冷凍離心機購自科大創(chuàng)新公司，Chemray 800型全自動生化分析儀購自深圳雷杜生命科學股份有限公司。

1.2 動物分組與干預(yù)方法 雄性ICR小鼠15只，鼠齡4～6周，初始體重為(25±5)g，購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場[動物合格證號：SCK(豫)2019-0003]。將小鼠飼養(yǎng)于干凈的籠子中，溫度適宜，光照/黑暗時間為12 h/12 h，自由獲取水和標準動物飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將15只小鼠分為對照組、PFOA組、PFOA+蘆丁組，每組5只。對照組：每日上午9時稱重后，按5 mL/(kg·d)給予灌胃ddH2O，1次/d。PFOA組：每日上午9時稱重后，按20 mg/(kg·d)給予灌胃PFOA溶液，灌胃體積為5 mL/(kg·d)，1次/d。PFOA+蘆丁組：每日上午9時稱重后，按20 mg/(kg·d)給予灌胃PFOA溶液，灌胃體積 5 mL/(kg·d)，1次/d；每日下午3時按20 mg/(kg·d)給予灌胃蘆丁溶液，灌胃體積5 mL/(kg·d)，1次/d。3組均連續(xù)灌胃處理14 d，實驗期間每天在相同時間點記錄小鼠的體重及基礎(chǔ)生命體征。

1.3 標本制備 小鼠連續(xù)給藥處理14 d后稱重并記錄，穿刺眼眶靜脈采血0.5～1.0 mL，室溫下以3 500 r/min離心15 min獲取血清，4 ℃下儲存待檢；采血后采用頸椎脫臼法處死小鼠，剝離兩側(cè)腎臟，4%多聚甲醛固定腎組織24 h。

1.4 組織病理學觀察 (1)通過HE染色觀察腎臟結(jié)構(gòu)。取部分腎臟組織，經(jīng)脫水后石蠟包埋，以5 μm厚度連續(xù)切片，進行常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察腎組織病理變化。(2)通過基底膜過碘酸六胺銀(periodic acid-silver metheramine，PASM)染色觀察腎小球毛細血管基膜、紅細胞和細胞核的分布和病變程度。取部分腎臟組織，經(jīng)脫水后石蠟包埋，以5 μm厚度連續(xù)切片，切片脫蠟至水，0.5%高碘酸氧化液浸泡20 min，蒸餾水洗滌，室溫下浸入六胺銀工作液中1.5～2 h，蒸餾水洗滌后依次用氯化金、核固紅、馬休黃染色，溫箱烤干，二甲苯透明，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 血清生化指標的檢測 嚴格按試劑盒操作要求，采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清三酰甘油、總膽固醇、HDL-C、LDL-C、尿素、肌酐水平及LDH活性。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠的體重變化 3組小鼠的體重比較，差異有統(tǒng)計學意義(F組間=21.746，P組間<0.001)，3組的體重均無隨時間變化的趨勢(F時間=2.210，P時間=0.132)，分組與時間有交互效應(yīng)(F交互=10.574，P交互<0.001)。從干預(yù)第6天開始，PFOA組和PFOA+蘆丁組小鼠的體重均低于對照組(均P<0.05)，而PFOA組與PFOA+蘆丁組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 干預(yù)期間3組小鼠體重的變化情況(x±s,g)

2.2 3組小鼠腎臟組織的HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果提示，對照組小鼠的腎小球外形規(guī)則飽滿，形態(tài)正常，毛細血管袢薄而清晰，腎小囊邊界清晰，系膜細胞和內(nèi)皮細胞正常，腎小管和收集管形態(tài)正常，未見腎小球硬化、腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)和纖維化；與對照組相比，PFOA組小鼠腎臟出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)性損傷，腎小球體積增大，系膜細胞和內(nèi)皮細胞增生，腎小管上皮細胞水腫、脫落，出現(xiàn)輕度空泡樣變性；而與PFOA組相比，PFOA+蘆丁組小鼠腎臟組織的結(jié)構(gòu)性損傷明顯減輕。見圖1。

圖1 3組小鼠腎臟組織的HE染色結(jié)果(皮質(zhì)，×1000；髓質(zhì)，×400)

2.3 3組小鼠腎臟組織的PASM染色結(jié)果 PASM染色結(jié)果提示，對照組小鼠的腎皮質(zhì)、髓質(zhì)分界清晰，腎小管基底膜形態(tài)正常，無增厚、皺縮，腎間質(zhì)清晰；與對照組相比，PFOA組小鼠的腎皮質(zhì)、髓質(zhì)分界較清晰，腎小球系膜增厚，腎小球基底膜增厚，腎小管基底膜增厚、皺縮，近端小管刷狀緣消失；而與PFOA組相比，PFOA+蘆丁組小鼠的腎臟基底膜損傷情況明顯減輕。見圖2。

圖2 3組小鼠腎臟組織的PASM染色結(jié)果(×400)

2.4 3組小鼠血清三酰甘油、總膽固醇、HDL-C、LDL-C水平的比較 3組小鼠的血清總膽固醇、LDL-C水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其中，PFOA組的血清總膽固醇、LDL-C水平均高于對照組，PFOA+蘆丁組的血清總膽固醇、LDL-C水平均低于PFOA組(均P<0.05)，而PFOA+蘆丁組與對照組的血清總膽固醇、LDL-C水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。3組小鼠的血清三酰甘油、HDL-C水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 3組小鼠血清三酰甘油、總膽固醇、HDL-C、LDL-C水平的比較(x±s,mmol/L)

2.5 3組小鼠血清尿素、肌酐水平及LDH活性的比較 3組小鼠的血清尿酸、肌酐水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其中，PFOA 組血清尿素水平高于對照組，血清肌酐水平低于對照組，而PFOA+蘆丁組血清尿素水平低于PFOA組，血清肌酐水平高于PFOA組(均P<0.05)。3組小鼠的血清LDH活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組小鼠血清尿素、肌酐水平及LDH活性的比較(x±s)

3 討 論

流行病學研究表明，腎臟疾病與環(huán)境污染物暴露程度有關(guān)[14]。近年來，多項研究表明PFOA與腎臟功能障礙、腎臟組織學改變之間存在關(guān)聯(lián)性[15-16]。有學者報告，PFOA暴露易造成小鼠的腎臟損傷，主要表現(xiàn)在體重及腎臟組織形態(tài)學變化等方面[5]。本研究結(jié)果顯示，PFOA暴露可造成小鼠腎臟損傷，表現(xiàn)為小鼠血清尿素水平升高，以及腎臟發(fā)生顯著病理學改變，如腎小球體積增大、系膜細胞和內(nèi)細胞增生、腎小管上皮細胞水腫、脫落纖維結(jié)構(gòu)紊亂等；且PFOA暴露可誘導(dǎo)腎臟脂質(zhì)代謝異常，表現(xiàn)為血清總膽固醇、LDL-C水平升高，與既往文獻報告的結(jié)果[17-18]相似。同時，PFOA暴露可導(dǎo)致小鼠體重降低，這可能與其造成脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。血清肌酐是廣泛用于評估腎功能的標志物之一，但血清肌酐濃度易受年齡、性別、肌肉質(zhì)量和飲食等諸多非腎臟因素的影響[19]。本研究中，PFOA組小鼠的血清肌酐水平降低，與臨床上腎功能損傷可導(dǎo)致血清肌酐水平升高的現(xiàn)象不一致，原因可能是PFOA影響能量代謝平衡造成糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致肌肉萎縮、質(zhì)量下降，最終導(dǎo)致血清肌酐水平降低[20]，但具體的原因仍需進一步研究明確。

臨床研究表明，蘆丁具有抗炎、抗氧化、降低血清膽固醇水平、抑制血小板聚集等多方面作用[21-23]。Qu等[24]采用蘆丁干預(yù)萬古霉素所致的腎臟損傷小鼠模型，發(fā)現(xiàn)蘆丁對小鼠腎臟損傷具有改善作用，可減輕萬古霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎癥和細胞凋亡；Rakshit等[25]研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁可顯著降低腎組織中三酰甘油和膽固醇水平；Chen等[26]研究報告，蘆丁可增加高尿酸血癥小鼠24 h肌酐的排泄，降低其血清肌酐和尿素氮水平，發(fā)揮改善腎功能的作用。本研究結(jié)果顯示，與PFOA組相比，PFOA+蘆丁組小鼠腎臟組織的結(jié)構(gòu)性損傷和腎臟基底膜損傷明顯減輕，血清總膽固醇、LDL-C、尿素水平均降低(均P<0.05)。這提示蘆丁對PFOA所致的小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷均有明顯的改善作用，其機制可能與蘆丁參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，以及通過調(diào)節(jié)腎臟有機離子轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮其降尿酸作用有關(guān)[27]。值得注意的是，本研究中PFOA+蘆丁組小鼠同樣出現(xiàn)體重降低的現(xiàn)象，這可能與蘆丁具有減輕體重、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用[28]有關(guān)。

綜上所述，蘆丁可改善PFOA造成的小鼠腎臟病理學變化和腎功能損傷，對小鼠腎臟具有一定的保護作用，并有助于調(diào)節(jié)其脂質(zhì)代謝。