李 敏 趙熙州 王好運 盧中科 丁貴杰

(貴州省森林資源與環(huán)境研究中心/貴州省高原山地林木培育重點實驗室貴州大學林學院 貴陽 550025)

隨著全球變暖逐漸加劇，陸地干旱面積、干旱時間和強度都在進一步增加(Dai， 2011)，植物生存和生長環(huán)境愈加嚴峻，增強植物適應干旱的能力對于維持自然生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力至關重要。在自然條件下，大約80%的陸地植物與菌根菌共生形成菌根(Plassardetal.， 2011)，其不僅能夠促進土壤水分和養(yǎng)分獲取以及向地上部分運輸，而且有助于植物應對土壤水分虧缺的不利影響，對宿主植物的生存和生長至關重要(Lehtoetal.， 2011； Mraketal.， 2019)。外生菌根菌(ectomycorrhizal fungi, ECMF)多與木本植物形成共生(Marmeisseetal.， 2004)，在干旱脅迫條件下，外生菌根(ectomycorrhiza，ECM)能通過外延菌絲擴大植物對水分和養(yǎng)分的吸收面積，提高根系保水力(吳小芹等， 2009； 翟帥帥等， 2015； Zouetal.， 2015)，增加宿主植物根系生物量、總長度、平均直徑、根尖數(shù)等根系性狀(祁金玉等， 2018； 王如巖等， 2012； Plassardetal.， 2011)，是促生抗旱的重要因素。根系分泌物是植物與微生物交流且影響根際過程的重要途徑，也是根系的一種功能性狀(Sunetal.， 2020)，對植物養(yǎng)分吸收、改善土壤結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定土壤有機碳(Mommeretal.， 2016； Sokoletal.， 2019； Heydarietal.， 2021)具有重要作用，在嚴重的非生物脅迫下影響植物的耐受性和存活。接種ECMF也能通過影響植物根系分泌活動改善植物的抗逆性，如分泌抗生素或萜類物質(zhì)抑制病原菌(Marx， 1973)、小分子量有機酸和高分子胞外酶(如酸性磷酸酶、植酸酶)活化土壤養(yǎng)分，促進脅迫條件下植物養(yǎng)分吸收(Ho，1989； Wangetal.， 2020)。然而，在以往植物抗旱性研究中，相較于地上部分，作為對水分和養(yǎng)分感知的重要器官，也是感受干旱脅迫的原初部位，根系的反應常被忽視(Williamsetal.， 2020)；此外，植物根系性狀對接種ECMF的反應是高度可變的，并依賴于真菌的種類甚至基因型，還受宿主和環(huán)境因素共同調(diào)控。因此，不同ECMF對植物根系性狀的影響以及ECMF是否調(diào)控干旱脅迫影響植物根系性狀需要進一步研究。

馬尾松 (Pinusmassoniana)是中國特有的重要造林和用材樹種，分布地區(qū)廣泛，但面臨季節(jié)性干旱且土壤養(yǎng)分貧瘠，嚴重限制其造林成活率和森林生產(chǎn)力。作為典型的菌根依賴性樹種，ECMF在馬尾松生長和抗旱過程中的有效性和重要性已被許多研究證實，但目前研究多集中在地上部分生理生化方面(馬瓊等， 2005； 王藝等， 2021)，對地下根系形態(tài)研究較少(翟帥帥等， 2015)，對其根系分泌物影響的研究更是鮮有報道。鑒于此，本研究以采自試驗區(qū)馬尾松林下的橙黃硬皮馬勃(Sclerodermacitrinum， Sc)和琥珀乳牛肝菌(Suillusplacidus， Sp)為菌種，對1年生接菌和未接菌苗進行正常澆水和干旱脅迫處理，探究不同ECMF對馬尾松幼苗根系性狀(根系形態(tài)和分泌物)和根際環(huán)境的影響差異以及接種不同ECMF是否調(diào)控干旱脅迫對馬尾松幼苗根系性狀和根際環(huán)境的影響，以期為進一步揭示不同ECMF增強植物抗旱性機制及其在植物抗旱過程中的應用提供參考，為外生菌根抗逆性研究挖掘新菌種。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于貴州大學林學院溫室大棚(26°26′—26°27′N，106°39′—106°40′E)，通風良好，搭遮蔭網(wǎng)，試驗期間溫室大棚內(nèi)均溫24.7 ℃，平均濕度77.9%。

1.2 試驗材料

琥珀乳牛肝菌(Sp)和橙黃硬皮馬勃(Sc)子實體采自貴州省貴陽市花溪區(qū)青巖林場，在GenBank中序列登錄號分別為MT994624和MT994623。參考Pachlewski等 (1974)方法，進行平板培養(yǎng)和液體菌劑的制備。每500 mL三角瓶中裝入300 mL液體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min后，在超凈工作臺中利用6 mm打孔器取菌塊，每瓶4菌塊，置于25 ℃培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，4周后取用。

馬尾松種子采自貴州省都勻馬尾松種子園內(nèi)同一母樹，2018年3月底，種子經(jīng)KMnO4(0.5%)消毒，用無菌水清洗6次，后撒入裝有經(jīng)無菌水濕潤的已滅菌蛭石中，于光照培養(yǎng)箱(25 ℃，光照和黑暗時間分別為14和10 h) 中培養(yǎng)28天，將芽苗移栽到裝有經(jīng)121 ℃滅菌2 h的混合培養(yǎng)基松表土/蛭石/珍珠巖(4∶1∶1，v/v/v，每盆4 kg)的塑料盆中(20 cm × 16 cm × 20 cm)，基質(zhì)理化性質(zhì)： pH含量4.65、有機質(zhì)含量44.49 g·kg-1、全氮含量5.63 g·kg-1、堿解氮含量157.50 mg·kg-1、全鉀含量8.84 g·kg-1、速效鉀含量35.85 mg·kg-1、全磷含量0.15 g·kg-1和有效磷含量56.34 mg·kg-1。幼苗移栽的同時接種經(jīng)過勻漿的液體菌劑(每株50 mL)，每盆3株。未接種(CK)幼苗用等量的空白培養(yǎng)基處理，每2天澆1次水。2種接菌苗菌根共生體形態(tài)見圖1。

圖1 菌根形態(tài)Fig.1 Mycorrhizal morphologySp： 琥珀乳牛肝菌Suillus placidus；Sc：橙黃硬皮馬勃Scleroderma citrinum.

1.3 試驗設計

試驗設置澆水W(土壤含水量55%±5%)和干旱D土壤含水量(20%±5%) 2種水分條件，分別接種Sp和Sc以及未接菌處理(CK)。兩因素組合共6個處理，每處理設置8盆，每盆3株幼苗，每處理24株幼苗，于2019年6月底選取長勢一致的幼苗進行水分處理，每日采用稱重法維持土壤含水量，處理60天后取樣。

1.4 試驗方法

每處理隨機取8株(每盆1株)于水分處理第1天和第60天進行苗高和地徑測量，用于計算處理期間苗高和地徑凈增長量。處理結(jié)束后，隨機選其中3株用于測定根系形態(tài)(WinRhizo根系分析系統(tǒng))，結(jié)束后，將各株苗分根、莖和葉烘干至恒質(zhì)量，測定生物量，并以此計算根冠比。

根系分泌物收集鑒定： 6個處理的所有幼苗分別整株取出，用無菌刷刷取黏附于根系表面0～4 mm的土壤作為根際土，各處理收集的根際土充分混勻后4 ℃保存待用。根系分泌物獲取采用乙醇浸提法(羅曉蔓等，2018)，并用GC/MS聯(lián)用儀(HP6890/5975C，美國安捷倫)進行分析。色譜條件： 色譜柱為HP-FFAP (30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，初始溫度40 ℃ (保留2 min)，以4 ℃·min-1升溫至220 ℃，保持15min，運行時間 62 min； 汽化室溫度250 ℃； 載氣為高純He(99.999%)； 柱前壓為47.6 kPa，載氣流量為1.0 mL·min-1，不分流，5 min溶劑延遲時間。質(zhì)譜條件： 離子源為EI源； 離子源溫度230 ℃； 四極桿溫度150 ℃； 電子能量70 eV； 發(fā)射電流34.6μA； 倍增器電壓1 624 V； 接口溫度280 ℃； 質(zhì)量范圍29～500 u。采用質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)對總離子流圖中的各峰進行檢索，Nist17和Wiley275標準譜庫進行物質(zhì)鑒定，采用峰面積歸一化法測定各成分相對含量。

侵染率測定： 隨機取6株苗根系，小心沖洗根系，參考張中峰等(2016)方法準備待觀察的根系，置于人體式顯微鏡徠卡(M205FA)下觀察菌根形態(tài)，并用計數(shù)法計算侵染率(菌根侵染率=菌根侵染根尖數(shù)/所有檢查根尖數(shù)×100%)。

采用試劑盒(蘇州科銘，中國)測定根際土壤脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性，氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法進行根系活力測定(李合生， 2000)，每個指標3次重復。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用IBM SPSS 21 軟件(IBM，USA)進行雙因素方差分析(干旱、接菌以及干旱×接菌相互作用對相關指標的影響)和單因素方差分析，t檢驗和Ducan法進行差異顯著性分析，采用OriginPro8.5(Origin Lab 公司，USA)軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 接菌和不接菌幼苗生長對比分析

由表1可知，處理60天后，馬尾松幼苗接菌(ECM)和干旱脅迫(Drought)對除根冠比外的其余指標均有顯著影響，且二者交互作用對苗高和地徑凈增長量以及侵染率的影響達顯著水平。相對澆水處理，干旱脅迫顯著抑制馬尾松幼苗生物量積累和生長，但對根冠比具有促進作用。

表1 不同接菌處理馬尾松幼苗在不同水分條件下生長變化①Tab.1 Growth changes of Pinus massoniana seedlings treated with different inoculations under different water conditions

相對未接菌處理(CK)，澆水條件下，Sc和Sp對幼苗除根冠比外的其他生長指標促進作用均達顯著水平(P< 0.05)。干旱脅迫下，2種接菌苗的苗高和地徑凈增長量、生物量和根冠比等均有升高，其中，除根冠比外，Sc處理下的幼苗生長指標均有顯著增加(P<0.05)。

2.2 接菌和不接菌幼苗根系生長特征分析

由表2可知，接菌、干旱及二者交互作用均對幼苗根系生長具有顯著影響。正常澆水條件下，相對CK，2種菌根菌處理顯著提高了幼苗根長度、根尖數(shù)、平均直徑等指標(P< 0.05)，Sc處理下的根系生長優(yōu)于Sp處理。干旱脅迫顯著抑制了接菌和未接菌幼苗根系生長(CK中平均直徑除外)，但Sp中根體積、根尖數(shù)和分支數(shù)高于CK，增幅分別為11.1%、167%和55.8%； 相對CK，Sc處理對除根尖數(shù)外的其于指標的促進作用均達顯著水平，平均直徑和根體積增幅分別達137.8%和108.6%。

干旱脅迫降低了接菌和未接菌幼苗根系活力，但在2種水分條件下接菌苗均高于未接菌苗(圖2)。

表2 不同處理下根系生長差異Tab.2 Root growth differences under different treatments

圖2 根系活力變化Fig.2 The changes of root activity

2.3 接菌和不接菌幼苗根系分泌物差異

由表3和4可知，2種水分條件下，不同接菌處理中植物根系分泌物的組成和相對含量具有一定差異，Sp處理的化合物種類最少。本試驗鑒定到的所有化學成分可歸為6大類有機物質(zhì)，包含28種化合物，各處理共有的化合物有19種。接菌和未接菌處理的各大類物質(zhì)種類數(shù)表現(xiàn)基本相似，以酸類最多，其次是醛類和萜類，酮類和醇類僅1種； 醇類僅在CK和Sc中出現(xiàn)，且只有苯甲醇。同時，Sp處理中無檸檬烯、丙烯酸-2-乙基己酯、2-甲基丙酸和(E)-2-辛烯酸。Sc處理中無正癸酸和辛酸，CK中無(E)-2-辛烯酸和正癸酸。

表3 根系分泌物組成情況①Tab.3 Composition of root exudates

表4 不同處理中根系分泌物化學組分相對含量Tab.4 Relative contents of root exudate in different treatments

在所有處理中，酸類有機物質(zhì)相對含量和種類均最多，而其中的棕櫚酸在所有化合物中相對含量最高，2種水分條件下均CK>Sc>Sp； 同時，相對澆水，干旱脅迫明顯降低了棕櫚酸的含量，CK、Sc和Sp處理下分別降低了9.07%、5.94%和10.19%。硬脂酸相對含量僅次于棕櫚酸，且在脅迫條件下降低。油酸也有較高相對含量，表現(xiàn)為Sp>Sc>CK，干旱脅迫降低其在Sp處理的相對含量，但增加了Sc處理和CK中相對含量。此外，干旱脅迫增加接菌和未接菌苗中的十四烷酸相對含量，且在澆水和干旱脅迫下均表現(xiàn)為Sp>Sc>CK。

其他類有機物質(zhì)中，長葉烯在各處理中均具有較高相對含量，干旱脅迫下，其相對含量在CK中增加，在2種接菌苗中則下降。干旱脅迫對醛類中安息香醛作用與長葉烯相反，對CK具有抑制作用，但增加了接菌苗中的相對含量。

以上結(jié)果表明，接菌和未接菌馬尾松幼苗根系分泌物在組成上具有一定的共性，但也存在差異，同時，各種化合物相對含量在不同處理間差異明顯。

2.4 接菌和不接菌幼苗根際土壤酶活差異

由圖3可知，接菌和干旱對3種土壤酶均有顯著影響，二者協(xié)同作用僅對脲酶無顯著影響。澆水條件下，接種Sp提高3種土壤酶活性，酸性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶分別比CK增加了5.76%、61.04%和12.81%，Sc處理則顯著提高脲酶和酸性磷酸酶活性(P<0.05)，增幅分別為57.67%和12.80%。干旱脅迫增加CK處理下3種酶活性，Sc處理下僅脲酶活性不顯著增加，Sp處理中脲酶和蔗糖酶增加。干旱條件下，脲酶活性以接菌處理高于CK，表現(xiàn)為Sp(313.50)>Sc(278.84)> CK (236.00)，蔗糖酶以Sp(6.65)> CK (5.84)>Sc(3.47)，酸性磷酸酶以Sc(27.41)> CK (26.42)>Sp(24.48)。

圖3 干旱脅迫和接菌處理對根際土壤酶活性的影響Fig.3 Effects of drought stress and inoculation treatments on rhizosphere soil enzyme activities

3 討論

3.1 干旱脅迫下外生菌根菌對馬尾松幼苗根系生長及活力的影響

外生菌根菌(ECMF)能有效緩解水分虧缺造成的負面影響(Sebastianaetal.， 2018； Lehtoetal.， 2011)。本研究中，接種Sp和Sc均能有效降低干旱脅迫對馬尾松幼苗生長和生物量的抑制作用，且以Sc指標效果更佳。這可能是由于菌根形成改變了植物根系形態(tài)，同時，外生菌根能通過外延菌絲和菌索擴大植物根系吸收面積，增加水分傳導效率(吳小芹等， 2009； Zouetal.， 2015)，有利于促進植物生長。此外，根系活力作為根系生命力的重要指標，影響地上部分的生長發(fā)育，2種水分條件下，2種接菌苗較高的根系活力促進了幼苗根系吸收能力。根系生長和吸收能力的提高，能增強宿主植物對水分和養(yǎng)分的吸收和運輸能力，同時，也增強周圍土壤的固碳能力，從而促進植物生長和脅迫條件下碳水化合物在根系的積累，緩解脅迫影響(Kingetal.， 1997)。因此，2種接菌苗比未接菌苗對干旱脅迫具有更強的適應性，在脅迫條件下生長表現(xiàn)更好，這與Sebastiana等(2018) 研究結(jié)果一致。但由于菌種不同，其對同一宿主植物的影響也不同(張中峰等， 2015； 吳強盛等， 2014)，干旱脅迫下，Sc對根系形態(tài)指標均具有促進作用，而Sp處理根系長度、表面積和平均直徑反而比CK小，其原因可能是由于Sp處理吸收利用了更多分配到根系的碳水化合物，進而導致宿主植物根系形態(tài)受限(劉婷巖等， 2021)。

3.2 干旱脅迫下外生菌根菌對馬尾松幼苗根系分泌物的影響

根系分泌物是植物自身的一種適應策略，常受各類生物和非生物因素的調(diào)控和制約(Kuzyakovetal.， 2001)。在相同環(huán)境條件下，植物根系分泌物組分差異除受自身遺傳特性調(diào)控外，還主要受個體生理狀態(tài)差異的影響(D’Orazioetal.， 2013； Zhuetal.， 2009)。本研究中，同一水分條件下，接種Sc增加了馬尾松幼苗根系分泌物種類，而接種Sp則降低其種類； 同時，二者對各類分泌物相對含量作用也有異同，說明接種不同菌根菌會改變馬尾松生理代謝活性，進而調(diào)控其分泌物組分的變化，根系活力的差異能證明這一點。此外，未接菌苗中根系分泌物直接外排到土壤，而接菌苗形成共生關系后，部分分泌物可能會被ECMF吸收利用，從而導致分泌土壤中的種類和數(shù)量發(fā)生變化(郭修武等， 2009)，這可能也是導致不同接菌處理苗根系分泌物組分差異的原因之一。Grayston等(1997)和Meier等(2013)研究也認為，根系分泌物組成和含量受共生菌根真菌類型調(diào)控，不同ECMF對分泌物影響不同。生長環(huán)境變化會導致植物自身代謝的變化，進而影響根系分泌物的釋放特征(吳林坤等， 2014； Sasseetal.， 2018)，而接菌和未接菌馬尾松幼苗則通過分泌更多種類的化合物響應干旱脅迫，這一結(jié)果也說明，根系分泌物種類的增加可能是馬尾松響應干旱脅迫的保守行為。除種類增加外，各類分泌物相對含量也發(fā)生明顯變化，如干旱抑制CK苗中酸類和醛類、增加萜類物質(zhì)相對含量，而接菌苗中醛類和萜類變化與CK剛好相反，且酸類相對含量下降程度更大，說明各類分泌物相對含量在干旱脅迫下的變化受接菌處理影響。而干旱脅迫引起接菌苗中酸類物質(zhì)相對含量下降程度更大，主要是由于包括棕櫚酸、硬脂酸和苯乙酸在內(nèi)的化感物質(zhì)的相對含量下降更多或上升較少所致，而這些物質(zhì)是很多植物中都已被廣泛報道的自毒物質(zhì)(張文明等， 2015； Huangetal.， 2010)，說明接種菌根菌可能通過降低各種抑制植物生長的化感物質(zhì)相對含量來緩解干旱脅迫。干旱脅迫下，2種外生菌根菌對同一化合物相對含量變化影響也有異同?？傮w而言，干旱和接菌處理均導致馬尾松幼苗根系分泌物組分及相對含量發(fā)生明顯變化，同時，接菌能調(diào)控干旱脅迫下各類分泌物及其化合物相對含量的變化，且不同菌根菌作用有差異。目前，有關水分變化和接種菌根菌對植物根系分泌物組分和含量的影響及調(diào)控機制尚不十分清楚，同時，由于研究方法可能存在一定局限性，導致本次所檢測到的分泌物種類還不是全部，因此，有關接種菌根菌對干旱脅迫下分泌物變化的內(nèi)在調(diào)控機制有待深入的研究。各類分泌物對干旱和不同接菌處理的響應不同，這些變化是否參與調(diào)控馬尾松幼苗的抗旱性以及這些響應是否是馬尾松苗特有,還是在其他樹種中也會產(chǎn)生，有待進一步研究。

3.3 干旱脅迫下外生菌根菌對馬尾松幼苗根際土壤酶活性的影響

根系分泌物作為土壤酶的主要來源之一，其組分和種類變化會導致土壤酶活性變化(樊利華等， 2019)。土壤酶參與土壤養(yǎng)分循環(huán)過程，對植物根系生長具有重要影響，且能及時有效地對環(huán)境變化作出響應(許淼平等， 2018)。本研究中，干旱脅迫對CK中3種土壤酶，Sc處理的脲酶以及Sp處理的脲酶和蔗糖酶活性具有促進作用，但抑制了2種菌根苗土壤中的酸性磷酸酶活性。在2種水分條件下，Sc處理下的脲酶和磷酸酶以及Sp處理下的脲酶和蔗糖酶活性均高于CK。這些結(jié)果表明，ECMF的應用改變了根際土壤酶活性對干旱脅迫的響應，2種ECMF能通過增加不同土壤酶活性來促進根際土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和吸收，進而維持各種條件下宿主植物的生長。這與王藝等(2013)研究結(jié)果相似。本研究中Sc和Sp處理分別抑制了蔗糖酶和磷酸酶活性，這與以往ECMF對土壤酶活的促進效應有所不同(尹大川等， 2017； 羅曉蔓等， 2016)，具體原因還有待進一步研究，但推測這可能與接菌苗生長和生理代謝以及根系分泌物組成和數(shù)量等因素有關。

4 結(jié)論

1) 接種橙黃硬皮馬勃(Sc)和琥珀乳牛肝菌(Sp)總體上能有效促進馬尾松幼苗地上部分生長和地下根系的生長及活力，提高宿主植物的水分和養(yǎng)分吸收利用能力以及抗旱性，但對干旱脅迫的耐性和適應策略有所不同，Sc促進生長、抗旱效果更好。

2) 水分變化和接菌處理對根系分泌物組成和相對含量影響明顯。其中，干旱和接種Sc能增加根系分泌物種類，接種Sp則降低。干旱導致各類分泌物相對含量發(fā)生明顯變化，變化幅度和方向與分泌物種類有關； 同時，各類分泌物相對含量在干旱脅迫下的變化受菌根菌的調(diào)控，且2種菌根菌作用有差異。

3) 接種Sp能夠通過提高根際土壤脲酶和蔗糖酶活性來抵御和適應干旱環(huán)境，而Sc則通過維持較高的酸性磷酸酶活性和脲酶活性來抵御和適應干旱環(huán)境。