張守科 李子坤 殷 昊 張 威 舒金平 王浩杰 周旭東 汪陽(yáng)東2,

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 杭州 311300； 2.浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311400； 3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 杭州 311400)

植物化學(xué)抗性是林木抗性品種選育與優(yōu)化研究中的重要目標(biāo)性狀。從提高植物自身抗性入手來(lái)解決病蟲害問題，是符合綠色防控要求、經(jīng)濟(jì)有效的手段(張杰等， 2019； 王曉杰等， 2020)。在經(jīng)濟(jì)作物品種抗性選育、優(yōu)化研究如火如荼的大背景下，我國(guó)南方地區(qū)重要的木本油料經(jīng)濟(jì)作物油茶(Camelliaoleifera)抗蟲品種選育工作也已全面開展(李苗苗等， 2017； 張守科等， 2020)。由于前期研究主要專注油茶經(jīng)濟(jì)性狀篩選，大量純林推廣后，病蟲害發(fā)生面積也隨之大面積增加(張守科等， 2020)。尤其是以蛀果害蟲茶籽象(Curculiochinensis)的暴發(fā)尤為嚴(yán)重，嚴(yán)重制約了油茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展(舒金平等， 2013； 張守科等， 2020)?；瘜W(xué)手段防治鉆蛀類害蟲效果一般且不利于油茶林生態(tài)系統(tǒng)及產(chǎn)品的綠色無(wú)公害化(舒金平等， 2013)。因此，具備抗蟲特性的優(yōu)良油茶品種的選育以及綠色有效防控技術(shù)的研發(fā)是當(dāng)前亟待開展的工作。然而，要達(dá)到上述要求則需先行開展茶籽象對(duì)油茶抗性響應(yīng)機(jī)制的探究。該研究不僅可為油茶抗蟲品種選育提供理論基礎(chǔ)，也可為綠色防控技術(shù)的集成與應(yīng)用提供支撐。

茶籽象是山茶屬植物果仁內(nèi)唯一的蛀果害蟲，隸屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)象蟲屬(Curculio)(Zhangetal.， 2018； 張守科等， 2019)。研究者前期針對(duì)茶籽象生物學(xué)特性、種群動(dòng)態(tài)及防治技術(shù)開展了大量探索(舒金平等， 2013； 何立紅等， 2014； 李志文等， 2014； 李苗苗等， 2017； Zhangetal.， 2018； 張守科等， 2019)，然而關(guān)于茶籽象對(duì)油茶化學(xué)抗性的適應(yīng)機(jī)制研究鮮有報(bào)道。前期開展的山茶屬植物抗茶籽象研究工作，基本明確了茶皂素(Tea saponin)是影響山茶屬植物茶籽象腸道菌群結(jié)構(gòu)及為害率的主要化學(xué)抗性指標(biāo)(Zhangetal.， 2020)； 且在探究不同油茶無(wú)性系間茶皂素含量與5個(gè)主推油茶無(wú)性系茶籽象為害率關(guān)系時(shí)也發(fā)現(xiàn)茶籽象為害率與茶皂素含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(張守科等， 2020)。但是基于4種山茶屬植物不同物種對(duì)茶籽象腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的研究，并未完全考慮物種間遺傳背景差異大以及植物化學(xué)抗性化合物積累量甚至構(gòu)型都存在差異等因素，這使得以茶皂素含量作為評(píng)價(jià)油茶抗蟲性強(qiáng)弱的依據(jù)存在不確定性。

本研究在前期明確不同山茶屬植物茶皂素含量對(duì)茶籽象腸道微生物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究茶籽象腸道菌群結(jié)構(gòu)對(duì)5個(gè)茶皂素含量存在差異的油茶無(wú)性系的響應(yīng)。通過將茶籽象回接于普通油茶無(wú)性系上，可在排除寄主遺傳背景差異的前提下，通過對(duì)比油茶無(wú)性系茶果內(nèi)茶籽象老熟幼蟲腸道微生物相對(duì)豐度、多樣性及組成差異篩選差異菌株并初步預(yù)測(cè)功能，同時(shí)初步評(píng)價(jià)不同菌株在適應(yīng)寄主化學(xué)抗性中的作用。本研究可明確油茶抗性無(wú)性系茶皂素含量是否對(duì)茶籽象腸道菌群產(chǎn)生影響，從而進(jìn)一步確定茶皂素含量是否可作為油茶抗蟲育種的重要植物化學(xué)抗性性狀。本研究不僅為油茶抗蟲育種提供理論依據(jù)，還可為以茶皂素這種植物源毒素為基礎(chǔ)的茶籽象生態(tài)防控技術(shù)研發(fā)提供更為直接的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣地及油茶林概況

選取浙江省青田尖山油茶種植園(28°11′51.61″N，120°23′15.25″E)作為試驗(yàn)樣地。該園油茶種植年限超過10年且無(wú)人為干擾。試驗(yàn)地均屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，為油茶純林，油茶林基本處于無(wú)人為噴施農(nóng)藥防治病、蟲、雜草的自然狀態(tài)，林下分布芒萁(Dicranopterispedata)、杠板歸(Polygonumperfoliatum)及禾本科(Poaceae)狗牙根(Cynodondactylon)、白茅(Imperatacylindrica)等雜草。園中多個(gè)無(wú)性系間混種，均有結(jié)實(shí)。

1.2 供試植物

隨機(jī)選擇樣地內(nèi)具有茶皂素含量梯度的5個(gè)具備優(yōu)質(zhì)農(nóng)藝性狀的高產(chǎn)無(wú)性系(長(zhǎng)林3號(hào)、 長(zhǎng)林40號(hào)、 長(zhǎng)林53號(hào)、 長(zhǎng)林55號(hào)和長(zhǎng)林166號(hào))。將選取的不同無(wú)性系茶果收集至實(shí)驗(yàn)室分別放置并標(biāo)記，待茶籽象幼蟲發(fā)育老熟后，將獲取的幼蟲置于滅菌土中化蛹，供試。

1.3 茶籽象回接、茶果采集及老熟幼蟲腸道解剖處理

選取生長(zhǎng)狀況一致的普通油茶5種無(wú)性系各10株。為確保所有的果實(shí)都沒有被茶籽象產(chǎn)卵而影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)，每棵樹都用2 m × 2 m × 2 m的小孔透明塑料網(wǎng)密封，僅留一個(gè)拉鏈開口供后期接種成蟲使用。5月下旬，隨機(jī)選擇實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌土中10對(duì)同日羽化的茶籽象成蟲(♀∶= 1∶1)接于網(wǎng)罩的供試植株上，任其交配產(chǎn)卵。待霜降前，選定的油茶5個(gè)無(wú)性系進(jìn)行隨機(jī)采樣，每株分為上、中、下3個(gè)層次，東、南、西、北4個(gè)方位，每個(gè)層次每個(gè)方位隨機(jī)摘取20個(gè)茶果，每株共計(jì)240個(gè)茶果，不足240個(gè)的植株則全部采摘。將獲取的成熟果實(shí)分組編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室。室溫下，靜置于實(shí)驗(yàn)室塑料筐內(nèi)，待老熟幼蟲從果實(shí)逸出并統(tǒng)計(jì)數(shù)量后，將茶果果仁取出，并參考張守科等(2020)方法測(cè)定茶皂素含量。存活的老熟幼蟲每個(gè)無(wú)性系隨機(jī)選取36頭，于磷酸緩沖液中解剖腸道，2條腸道為1個(gè)樣本，每個(gè)無(wú)性系共18個(gè)樣本，編號(hào)后于- 80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 茶籽象腸道菌群總DNA提取及建庫(kù)測(cè)序

茶籽象腸道微生物總DNA的提取，參考QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒細(xì)菌DNA提取方法： 在PBS緩沖液中將茶籽象腸道解剖出來(lái)，搜集到裝有1 mL PBS的無(wú)菌PE管中，每管含有3頭茶籽象的腸道以保證菌液DNA質(zhì)量，勻漿； 將勻漿后的菌液7 500 r·min-1離心，取上清液至新的無(wú)菌PE管后提取總DNA。收集到的DNA 原液經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，100 V電泳40 min后溴酚藍(lán)到達(dá)瓊脂4/5處，取出至UV凝膠電泳成像儀進(jìn)行條帶檢測(cè)，并檢測(cè)DNA樣品純度和濃度。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。首先對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列末端修復(fù)，對(duì)文庫(kù)做最終的片段選擇與純化。上機(jī)測(cè)序前，需要先對(duì)文庫(kù)在Agilent Bioanalyzer上進(jìn)行質(zhì)檢，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit試劑盒。合格后，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit試劑盒在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量后將合格的樣品上機(jī)測(cè)序； 使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序，試劑為MiSeq Reagent Kit V3(600 cycles)。由于MiSeq測(cè)序讀長(zhǎng)較短的特性，目標(biāo)片段測(cè)序長(zhǎng)度定為200～450 bp。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用質(zhì)控軟件Cutadapt (V1.9.1)將所有16S序列測(cè)序質(zhì)量檢驗(yàn)，并根據(jù)樣本間不同的引物進(jìn)行分組。去除條形碼及引物后，通過UCHIME算法對(duì)端序列進(jìn)行合并和質(zhì)量過濾。

利用UPARSE軟件將序列聚類為分類單元(operational taxonomic units,OTUs)，序列相似度閾值為 >97%，同時(shí)刪除一部分嵌合體以保留代表性O(shè)TUs。在QIIME2軟件中將OTU序列與對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)，利用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)注釋獲取每個(gè)OTUs所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。將抽平后的OTUs矩陣用來(lái)后續(xù)分析。依照OTUs劃分和分類地位鑒定結(jié)果，獲取各樣本在每個(gè)分類水平的物種組成。比較樣本在各分類水平的微生物類群數(shù)量，使用R軟件繪制成分類等級(jí)樹，比較各樣本在同一水平的分類單元數(shù)的差異。使用QIIME2軟件對(duì)每個(gè)樣本計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)的Chao1、Good_coverage、Observed_species、Shannon、Faith_pd、Simpson及Pielou_e指數(shù)。Beta多樣性分析主要檢驗(yàn)不同樣本之間群落結(jié)構(gòu)的相似性。主要通過非度量多維標(biāo)度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)，對(duì)群落數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行自然分解并通過對(duì)樣本排序，從而觀測(cè)樣本之間的差異及相似性。并根據(jù)樣本Bray_curtis距離矩陣，對(duì)不同分組的樣本距離均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較Anosim差異檢驗(yàn)(Analysis of similarities test)。使用R軟件比較分析高含量茶皂素?zé)o性系長(zhǎng)林40 + 長(zhǎng)林166組與低含量茶皂素?zé)o性系長(zhǎng)林55 + 長(zhǎng)林53 + 長(zhǎng)林3組茶籽象腸道菌群物種差異及標(biāo)志物種并繪制曼哈頓圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶籽象存活量與油茶抗性無(wú)性系茶皂素含量的關(guān)聯(lián)

為進(jìn)一步明確茶籽象危害率與普通油茶茶皂素含量的關(guān)聯(lián)，在回收5個(gè)油茶無(wú)性系茶果時(shí)，對(duì)茶籽象存活數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并與無(wú)性系茶果果仁茶皂素積累量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。通過對(duì)霜降后油茶果果仁茶皂素含量測(cè)定，茶皂素含量為3.27～9.62 mg·g-1,長(zhǎng)林3號(hào)與長(zhǎng)林53號(hào)茶皂素含量差異不顯著(P< 0.05)，范圍在(3.61± 0.34) mg·g-1～ (3.75 ± 0.23) mg·g-1(圖2A)；而長(zhǎng)林55號(hào)茶皂素含量為(5.52 ± 0.33)mg·g-1，長(zhǎng)林40號(hào)和長(zhǎng)林166號(hào)茶皂素的最高含量分別為(7.75 ± 0.16)mg·g-1和(9.47± 0.15)mg·g-1。對(duì)不同無(wú)性系幼蟲存活量統(tǒng)計(jì)分析，蟲口數(shù)量為26～85個(gè)(圖1)。長(zhǎng)林55、53及3號(hào)的幼蟲存活量差異不明顯(P> 0.05)，分別為(77 ± 8)個(gè)、(70 ± 10)個(gè)及(69 ± 11)個(gè)，長(zhǎng)林40和長(zhǎng)林166號(hào)的幼蟲存活量相對(duì)較少，分別為(43 ± 6)個(gè)和(34 ± 8)個(gè)，兩者差異不顯著(P> 0.05)。關(guān)聯(lián)分析表明2組數(shù)據(jù)的關(guān)系為y= 0.252 5x2-10.096x+ 107.47(R2= 0.718 9)，茶籽象存活量呈現(xiàn)隨茶皂素含量上升而下降的趨勢(shì)(圖1)。

圖1 茶果茶皂素含量與幼蟲存活量相關(guān)回歸分析Fig.1 Correlation regression analysis of tea saponin content and larval survival

圖2 普通油茶供試無(wú)性系及茶籽象腸道菌群屬水平注釋結(jié)果Fig.2 Clones of Camellia oleifera involved in the experiment and annotated results of weevils’ gut microbiota at the genus level

2.2 油茶抗性無(wú)性系對(duì)茶籽象腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)5組茶籽象腸道樣本抽平后OTU表屬水平分類數(shù)量統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)林40號(hào)和長(zhǎng)林166號(hào)茶果內(nèi)茶籽象腸道菌群相似度較高，其中兩者均含有較高水平的不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)。其中，長(zhǎng)林40號(hào)中不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度為6.23%，長(zhǎng)林166號(hào)不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度為10.19%(圖2B)。相較于另外3組，長(zhǎng)林40和166組內(nèi)沙雷氏菌屬(Serratia)相對(duì)豐度較低，分別為5.81%和6.04%； 而長(zhǎng)林55、53、3號(hào)沙雷氏菌屬則為優(yōu)勢(shì)菌屬，分別為13.41%、16.56%和14.68%(圖2B)。另外，長(zhǎng)林40號(hào)和166號(hào)中，假單胞桿菌屬(Pseudomonadaceae)相較于另外3組，相對(duì)豐度也相對(duì)較高，分別為4.94%和3.74%(圖2B)。將5組樣本進(jìn)行物種組成最高分類水平為屬水平的分類等級(jí)樹分析發(fā)現(xiàn)，前100豐度的OTUs中，豐度前10的OTU的注釋結(jié)果與前者分析結(jié)果一致(圖2C)。其中，大部分菌5組占比基本一致，僅不動(dòng)桿菌屬、假單胞桿菌屬所包含的OTUs在長(zhǎng)林40和166樣本中占比較高(圖2C)。而沙雷氏菌屬、阪岐腸桿菌屬(Cronobacter)、莖菌屬(Caulobacter)、食酸菌屬(Acidovorax)、草酸桿菌屬(Aquabacterium)、固氮螺菌屬(Azospirillum)以及魏斯氏菌屬(Weissella)所包含OTUs多分布于長(zhǎng)林55、53及3號(hào)茶籽象腸道菌群樣本中(圖2C)。

2.3 油茶抗性無(wú)性系對(duì)茶籽象腸道菌群多樣性的影響

為明確5種無(wú)性系對(duì)茶籽象腸道菌群多樣性的影響，分別對(duì)茶籽象腸道菌群進(jìn)行了Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析以及基于Bray_curtis距離矩陣的組間Anosim差異分析。其中，Chao1、Good_coverage、Observed_species、Shannon、Faith_pd、Simpson及Pielou_e指數(shù)等7個(gè)Alpha多樣性指數(shù)分析中僅Shannon、Faith_pd、Simpson及Pielou_e等4個(gè)指數(shù)P值小于0.05(圖3)； Shannon指數(shù)分析中，長(zhǎng)林166組腸道樣本多樣性與長(zhǎng)林40號(hào)樣本差異不大(P> 0.05)，與其他各組均存在極顯著性差異(P< 0.001)； 而長(zhǎng)林40號(hào)樣本僅與長(zhǎng)林3號(hào)樣本腸道菌群多樣性存在顯著性差異(P< 0.01)； 長(zhǎng)林55、53及3號(hào)樣本中Shannon指數(shù)差異不大(P> 0.05)(圖3)。Faith_pd指數(shù)分析中，長(zhǎng)林166號(hào)樣本與長(zhǎng)林3，長(zhǎng)林53號(hào)樣本與長(zhǎng)林55，長(zhǎng)林40號(hào)樣本與長(zhǎng)林3差異極顯著(P< 0.001)； 長(zhǎng)林55號(hào)樣本與長(zhǎng)林3號(hào)樣本腸道菌群多樣性存在較顯著差異(P< 0.05)(圖3)。與其他指數(shù)不同，Simpson指數(shù)中長(zhǎng)林166組與其他各組均有顯著差異(P< 0.05)，而其他剩余4組之間則多樣性差異不大(圖3)。而Pielou_e指數(shù)分析中，長(zhǎng)林40組樣本多樣性僅與長(zhǎng)林166組差異不大，其他各組均差異顯著(P< 0.05)，長(zhǎng)林166組樣本與除長(zhǎng)林40組之外的3組樣本也存在顯著差異(P< 0.05)(圖3)。

圖3 不同油茶抗性無(wú)性系上茶籽象腸道菌群Alpha多樣性差異比較Fig.3 Comparison of Alpha diversity of gut microbiota of C. chinensis in different C. oleifera clones

為進(jìn)一步比較5個(gè)油茶無(wú)性系果實(shí)對(duì)茶籽象腸道菌群多樣性的影響，對(duì)樣本間的Bray_curtis距離矩陣和Jaccard 距離矩陣進(jìn)行了NMDS分析(圖4)。基于Bray_curtis距離矩陣的分析發(fā)現(xiàn)，高茶皂素含量的長(zhǎng)林166和40號(hào)上的茶籽象腸道菌群結(jié)構(gòu)相似度較高，在主成分NMDS1上可以將5組樣本顯著分成2個(gè)類群(Stress = 0.052 < 0.1)(圖4)。同樣的利用Jaccard 距離矩陣進(jìn)行的分析表明，在主成分NMDS1上也可將5組樣本聚類成2個(gè)大的類群，高茶皂素含量的長(zhǎng)林166和40號(hào)樣本單獨(dú)聚類，剩余3組單獨(dú)聚類，但優(yōu)劣用脅迫系數(shù)(Stress = 0.16)相較于Bray_curtis距離矩陣較高； 雖在此脅迫系數(shù)下依然可以將5組樣本很好地聚類，但相較于Bray_curtis距離矩陣解釋度不夠(圖4)。為驗(yàn)證5組樣本間Beta多樣性之間差異的顯著性，選取NMDS分析中優(yōu)劣用脅迫系數(shù)(Stress = 0.052)較低的Bray_curtis距離矩陣展開分析。其中，長(zhǎng)林40分別與長(zhǎng)林55、53和3存在顯著差異(P< 0.05)，且R> 0.9 > 0.75，說明樣本內(nèi)腸道菌群差異極大(P< 0.05)，相似度極低(P< 0.05)； 而長(zhǎng)林166組同樣也與長(zhǎng)林55、53和3存在顯著差異(P< 0.05)，這同樣佐證Alpha多樣性分析結(jié)果(表1)。

表1 基于Bray_curtis距離的組間Anosim差異分析Tab.1 Analysis of Anosim differences between groups based on Bray_curtis distance

圖4 基于2種距離矩陣對(duì)不同油茶抗性無(wú)性系上茶籽象腸道菌群的NMDS分析Fig.4 NMDS analysis of gut microbiota of C. chinensis in different C. oleifera clones based on two distance matrices

2.4 茶皂素含量差異對(duì)茶籽象腸道菌群屬水平物種差異及標(biāo)志物種的影響

為比較長(zhǎng)林166和40號(hào)高茶皂素含量組腸道菌群相對(duì)于長(zhǎng)林55、53和3號(hào)茶皂素低含量組樣本顯著富集可能與降解或耐受茶皂素有關(guān)的核心菌株，使用曼哈頓圖來(lái)展現(xiàn)差異OTUs，并通過注釋信息獲取差異OTUs的屬水平注釋信息。篩選出51個(gè)OTUs在高含量茶皂素組的茶籽象腸道內(nèi)顯著富集，其中，有1個(gè)OTU屬于黃桿菌屬，1個(gè)OUT屬于固氮螺菌屬，5個(gè)OTU屬于阪岐腸桿菌屬(Cronobacter)，31個(gè)OTU屬于假單胞桿菌屬，13個(gè)OTU屬于不動(dòng)桿菌屬(圖5)。

圖5 高含量茶皂素?zé)o性系與低含量茶皂素?zé)o性系茶籽象腸道菌群物種差異及標(biāo)志物種分析Fig.5 Species difference and marker species analysis of gut microbiota in C. oleifera clones with high and low content of tea saponin坐標(biāo)系內(nèi)每個(gè)圓點(diǎn)或圈代表1個(gè)ASV(分類單元)，大小代表其相對(duì)豐度； 虛線分隔了顯著差異(P < 0.05)與不顯著的ASV，顯著差異的點(diǎn)用彩色圓點(diǎn)或圓環(huán)標(biāo)志，不顯著的用灰色圓環(huán)表示，該分組內(nèi)顯著上調(diào)的用彩色實(shí)心圓點(diǎn)顯示。Each dot or circle in the coordinate system represents one ASV (taxon), and its size represents its relative abundance. The dotted line separates the significant difference (P < 0.05) from the non-significant ASV, the significant difference points are marked by colored dots or rings, the non-significant points are indicated by gray rings, and the significantly upregulation points within the group are shown by colored solid dots.

3 討論

在植物與植食性昆蟲的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系中，植物為抵抗昆蟲為害進(jìn)化出包括物理和化學(xué)的各種抗性表型(Mason， 2020)。植物化學(xué)抗性是由植物應(yīng)對(duì)植食性昆蟲為害應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的或者長(zhǎng)期穩(wěn)定積累的有毒、抗?fàn)I養(yǎng)和難消化的化合物組成，一般具有趨避害蟲、損傷或抑制昆蟲消化系統(tǒng)對(duì)食物消化的能力(Hammeretal.， 2015； Erbetal.， 2019； Yuanetal.， 2021)，起到化學(xué)防御的作用(Agrawal， 2019； Masonetal.， 2019)。植食性昆蟲也相應(yīng)地采取一系列對(duì)策以適應(yīng)來(lái)自植物寄主抗性的選擇壓力(Schumanetal.， 2016； Agrawaletal.， 2019； Mason， 2020)，其中就包括對(duì)植物寄主產(chǎn)生明顯的取食偏好反應(yīng)以及適應(yīng)限度差異(Masonetal.， 2019； Liuetal.， 2020)。

在專食性象蟲這類昆蟲的進(jìn)化進(jìn)程中，適應(yīng)限度差異現(xiàn)象尤為突出(Morera-Margaritetal.， 2021)。前期研究發(fā)現(xiàn)，茶籽象對(duì)山茶屬植物的適應(yīng)限度差異現(xiàn)象表現(xiàn)在發(fā)育狀況及存活率上(Zhangetal.， 2020)。由于以山茶屬屬下階元觀測(cè)這種適應(yīng)限度差異現(xiàn)象并未完全排除物種遺傳背景差異大的干擾，因此，為探究這一現(xiàn)象并進(jìn)一步評(píng)判茶皂素是否可以作為油茶抗茶籽象的重要植物抗性成分，本研究觀測(cè)了5個(gè)不同油茶無(wú)性系對(duì)茶籽象老熟幼蟲存活量及老熟幼蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。通過對(duì)茶籽象幼蟲個(gè)數(shù)與茶皂素含量之間的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)油茶無(wú)性系茶皂素含量對(duì)茶籽象幼蟲存活量有顯著影響。此結(jié)果與前期山茶屬之間為害率不同的結(jié)果基本一致，幼蟲在低茶皂素含量的茶果內(nèi)相較于高茶皂素含量的茶果內(nèi)發(fā)育更為良好(Zhangetal.， 2020)。這進(jìn)一步論證了“茶皂素是山茶屬植物乃至油茶無(wú)性系抑制茶籽象發(fā)育的重要植物化學(xué)抗性成分”的結(jié)論。

適應(yīng)限度差異的產(chǎn)生，除植食性昆蟲消化道內(nèi)自身消化酶、解毒酶發(fā)揮作用外(Grbietal.， 2011； Xuetal.， 2019； Guietal.， 2020； Baietal.， 2021)，腸道菌群解毒功能在昆蟲抵消植物化學(xué)抗性方面的作用也不可忽視(Agrawaletal.， 2019； Masonetal.， 2019； Guptaetal., 2020； Mason， 2020； Shuklaetal.， 2020)。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲腸道內(nèi)微生物不僅可以幫助宿主消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可幫助植食性昆蟲快速適應(yīng)一定量的植物有毒次生代謝物(Douglas， 2013； Chengetal.， 2018； Morera-Margaritetal.， 2021)，有助于昆蟲在一定程度下有效分解或規(guī)避寄主植物有毒次生代謝物，健康地完成營(yíng)養(yǎng)積累過程(Hansenetal.， 2014； Masonetal.， 2019； Francoeuretal.， 2020； Mason， 2020； Zhangetal.， 2020)。腸道微生物菌群能夠促進(jìn)宿主昆蟲適應(yīng)寄主，并介導(dǎo)了昆蟲代謝化學(xué)防御增強(qiáng)取食消化植物寄主的能力(Nikohetal.， 2011； Adamsetal.， 2013； Chenetal.， 2018)。前期研究也發(fā)現(xiàn)，不同山茶屬植物上茶籽象腸道營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)的微生物在消化植物物質(zhì)的過程中會(huì)受到山茶屬植物的影響，可能在無(wú)法正常消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，蟲體無(wú)法獲取足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而營(yíng)養(yǎng)不良，導(dǎo)致為害率差異的現(xiàn)象(Zhangetal.， 2020)。

研究通過將同一來(lái)源的茶籽象回接于茶皂素含量存在差異的油茶無(wú)性系上，直接探討茶皂素對(duì)茶籽象腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。不同寄主回接后獲取的老熟幼蟲茶籽象腸道菌群結(jié)構(gòu)變化差異巨大(圖2、3，表1)，從分析菌群Alpha多樣性、Beta多樣性分析結(jié)果來(lái)看，茶籽象腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及數(shù)量對(duì)無(wú)性系茶皂素含量反應(yīng)明顯，高含量茶皂素的長(zhǎng)林166和長(zhǎng)林40回收的茶籽象腸道內(nèi)與有毒物質(zhì)代謝相關(guān)的不動(dòng)桿菌屬、假單胞桿菌屬占據(jù)較高權(quán)重； 與營(yíng)養(yǎng)消化功能相關(guān)菌屬則被抑制； 結(jié)合前期研究(Zhangetal.， 2020； 張守科等， 2020)，本研究中5個(gè)油茶無(wú)性系對(duì)茶籽象幼蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響以及老熟幼蟲存活量的差異，進(jìn)一步明確普通油茶茶果茶皂素含量是影響腸道菌群的化學(xué)抗性組分，同時(shí)不動(dòng)桿菌屬則是與茶籽象耐受茶皂素毒性密切相關(guān)的優(yōu)勢(shì)腸道菌屬。

4 結(jié)論

本研究利用物種茶皂素含量存在差異的油茶無(wú)性系，探究了茶皂素含量對(duì)茶籽象幼蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)高含量茶皂素的無(wú)性系可以明顯影響茶籽象腸道菌群多樣性并造成腸道菌群組成結(jié)構(gòu)差異。對(duì)茶果果仁茶皂素含量與幼蟲存活量的相關(guān)性分析表明，油茶無(wú)性系茶皂素含量可以作為油茶抗蟲品種選育的一個(gè)重要指標(biāo)。這一結(jié)論也佐證了筆者前期的研究結(jié)果。本研究的結(jié)論進(jìn)一步明確了茶皂素含量在抗茶籽象上的作用，為油茶抗蟲品種選育工作以及開發(fā)新的防治茶籽象的綠色防控技術(shù)提供了理論和技術(shù)支持。