智麗霞 王康 殷利茜 馬茴煌 李姚娜 楊慧宇

氧化應(yīng)激是機(jī)體活性氧（ROS）產(chǎn)生過多或抗氧化能力下降，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)平衡紊亂的病理生理過程。大量的ROS 使低密度脂蛋白（LDL）發(fā)生氧化修飾，形成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）。血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1（LOX-1）是ox-LDL 在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的主要受體，在巨噬細(xì)胞中也有表達(dá)，可介導(dǎo)ox-LDL 對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生過程[1]。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）產(chǎn)生的O2-與LDL 相互作用引起LDL 氧化，產(chǎn)生ox-LDL，這可能是泡沫細(xì)胞吞噬ox-LDL 的主要來源[2]，ROS 在血管性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，參與動脈粥樣硬化、高血壓、動脈瘤形成等多種病理生理過程[1,3]。本研究利用小干擾RNA（siRNA）沉默LOX-1基因，探討LOX-1 對ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Ox-LDL 購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，細(xì)胞內(nèi)ROS 熒光定性檢測試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒購自南京建成生物工程研究所，DNA 引物及熒光探針購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將巨噬細(xì)胞無血清培養(yǎng)16 h，使細(xì)胞生長至對數(shù)增殖期，更換新的無血清培養(yǎng)液，隨機(jī)分為對照組、空質(zhì)粒對照組（pCon 組）、ox-LDL 組、LOX-1-siRNA＋ ox-LDL 組，每組1×107個細(xì)胞。對照組單純無血清培養(yǎng)不作任何處理；pCon 組為空質(zhì)粒對照組；ox-LDL 組加入ox-LDL 50 mg/L 處理16 h；LOX-1-siRNA＋ox-LDL 組用沉默LOX-1 效果最佳的干擾序列干預(yù)24 h 后，再加入ox-LDL 50 mg/L 處理16 h。

1.3 MDA含量檢測

按照說明書，分別向離心管中加入0.1 mL 不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣本，然后分別加入0.2 mL MDA 檢測工作液，輕微混勻后，100 ℃加熱15 min，冷卻至室溫后1 000 g 離心10 min，取上清200 μL 分別加入到96 孔板中，用酶標(biāo)儀測定532 nm 處吸光度，并計算各組細(xì)胞MDA 含量。

1.4 巨噬細(xì)胞SOD活性檢測

將巨噬細(xì)胞移至96 孔板培養(yǎng)，每孔5 000～10 000 個細(xì)胞，48 h 后吸去培養(yǎng)液，PBS 洗滌1 次，每孔加入200 μL SOD 檢測工作液，輕微震蕩后，37 ℃孵育3 min。按照說明書用酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光度，并計算各組細(xì)胞SOD 活性。

1.5 LOX-1對巨噬細(xì)胞ROS水平的影響

使用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS 水平。該過程中將對照組細(xì)化為陰性對照組（正常培養(yǎng)細(xì)胞不加熒光探針）、正常對照組（正常培養(yǎng)細(xì)胞只加入熒光探針）、陽性對照組（加陽性藥物H2O2在常溫下培養(yǎng)1 h），其余分組（pCon組、ox-LDL 組、LOX-1-siRNA＋ ox-LDL 組）不變。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測巨噬細(xì)胞NOX2、p22phox的mRNA表達(dá)水平

以GAPDH 為內(nèi)對照，應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測各組巨噬細(xì)胞內(nèi)NOX2、p22phox的表達(dá)。引物序列如下：NOX2上游引物 為5'-CCTTCCTGACACCTCTCTCG-3'，下游引物為5'-GAGCTCAGACCCTCACTTGG-3'，預(yù)計PCR 產(chǎn)物片段大小為198 bp；p22phox上游引物 為5'-CAGTCCCAAGGAGAATGGAA-3'，下 游引物為5'-TCTGCCATAGCTGGACAGTG-3'，預(yù)計PCR 產(chǎn)物片段大小為207 bp；GAPDH上游引物為5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物為5'-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3'，預(yù)計PCR 產(chǎn)物片段大小為307 bp。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃2 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 次循環(huán)。

1.7 Western blot法檢測巨噬細(xì)胞NOX2、p22phox的蛋白表達(dá)水平

用4 ℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解各組巨噬細(xì)胞，BCA 法測定蛋白濃度。取20 μg 總蛋白樣品經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉2 h，抗NOX2、p22phox、β-actin 抗體4 ℃孵育過夜，二抗室溫下孵育2 h，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，儀器自動掃描后保存圖像。用ImageJ 軟件分析掃描所得圖像的灰度值，重復(fù)3 次，與內(nèi)參蛋白β-actin 條帶灰度值的比值即為該目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；多組間比較滿足正態(tài)性和方差齊性時，采用ANONA 單因素方差分析；組間兩兩比較采用SNK 法（q檢驗）；組間任意兩組比較采用LSD-t檢驗；不滿足條件則采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LOX-1對巨噬細(xì)胞MDA含量及SOD活性的影響

與對照組、pCon 組相比，ox-LDL 組MDA 含量明顯升高，SOD 活性明顯降低（P均＜0.05），表明經(jīng)ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化與抗氧化功能失衡，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。與ox-LDL 組比較，LOX-1-siRNA＋ox-LDL 組MDA 含量明顯降低，SOD 活性明顯升高。見表1。

表1 各組細(xì)胞MDA含量及SOD活性的比較

2.2 LOX-1對巨噬細(xì)胞ROS水平的影響

熒光顯微鏡觀察結(jié)果及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，陰性對照組巨噬細(xì)胞ROS 平均熒光強度低于其他對照組，陽性對照組巨噬細(xì)胞ROS 平均熒光強度高于其他對照組（P均＜0.05），pCon 組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，ox-LDL 組巨噬細(xì)胞ROS 平均熒光強度較正常對照組、pCon 組明顯增強，LOX-1-siRNA＋ox-LDL 組巨噬細(xì)胞ROS平均熒光強度較ox-LDL 組明顯減弱（P均＜0.05）。見圖1、圖2、表2。

表2 各組流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞內(nèi)平均熒光強度比較

圖1 熒光顯微鏡觀察各組巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平（×200）

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平

2.3 LOX-1-siRNA對巨噬細(xì)胞NOX2、p22phox mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組、pCon 組相比，ox-LDL 組NOX2及p22phox的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P均＜0.05）；與ox-LDL 組相比，LOX-1-siRNA＋ox-LDL 組NOX2、p22phox的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯下降（P均＜0.05）。見圖3、表3。

圖3 Western blot法檢測各組NOX2和p22phox蛋白表達(dá)情況

表3 各組NOX2和p22phox的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

氧化應(yīng)激是機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡紊亂，導(dǎo)致潛在損傷的病理生理過程。正常情況下，細(xì)胞中含有的SOD、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）可清除ROS，維持細(xì)胞的氧化還原自穩(wěn)態(tài)[4]。當(dāng)某些因素作用于機(jī)體，導(dǎo)致該穩(wěn)態(tài)失去平衡、ROS 的產(chǎn)生速率大于清除速率時，大量的ROS 在體內(nèi)蓄積，可使LDL 發(fā)生氧化修飾，生成ox-LDL。泡沫細(xì)胞吞噬ox-LDL 后，堆積形成動脈粥樣硬化病變早期的脂質(zhì)條紋，動脈管壁中氧化脂質(zhì)的積累導(dǎo)致動脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展[5]，而ROS被認(rèn)為是此過程的始動因素[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，小劑量ROS 可作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，在維持機(jī)體組織細(xì)胞的正常功能中發(fā)揮重要作用[7]，然而在氧化應(yīng)激狀態(tài)時，ROS 大量蓄積并損傷核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，最終導(dǎo)致機(jī)體可逆或不可逆的損傷[8]。SOD 是維持細(xì)胞氧化還原自穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵抗氧化酶，可通過歧化ROS 終止ROS 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并將其清除[9]。MDA 作為一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可間接反映氧化損傷的程度，是目前常用的氧化應(yīng)激指標(biāo)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞MDA 含量升高，SOD 活性降低，提示經(jīng)ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。

Ox-LDL 的細(xì)胞效應(yīng)主要依賴于ox-LDL 與LOX-1 受體的特異性結(jié)合，LOX-1 是介導(dǎo)ox-LDL進(jìn)入細(xì)胞并引起胞內(nèi)氧化應(yīng)激的主要受體，引起內(nèi)皮活化、功能失調(diào)和損傷，在動脈粥樣硬化的早期能促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL 處理后，ROS 平均熒光強度顯著增強，而沉默LOX-1基因后再經(jīng)ox-LDL 處理，巨噬細(xì)胞中ROS 平均熒光強度顯著降低，表明抑制LOX-1基因表達(dá)能減少巨噬細(xì)胞ROS 的生成，LOX-1 可以影響巨噬細(xì)胞ROS的生成，從而影響巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

Ox-LDL 可以通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS 生成，激活轉(zhuǎn)錄活化因子（AP-1）和核因子κB（NF-κB），引發(fā)細(xì)胞凋亡，同時AP-1 和NF-κB 能進(jìn)一步促進(jìn)炎性反應(yīng)相關(guān)產(chǎn)物表達(dá)，誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞在受損血管內(nèi)膜下聚集。在單核/巨噬細(xì)胞中，NOX將電子從NADPH 轉(zhuǎn)移至O2并產(chǎn)生O2-，進(jìn)而生成ROS[13]。NOX 作為ROS 的主要來源，在斑塊的形成、破裂與血栓形成中起重要作用[14-15]，也是氧化還原的重要信號[16]。本研究證實，巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL 處理后，NOX2、p22phox的mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯升高，沉默LOX-1基因后再經(jīng)ox-LDL 處理，NOX2、p22phox的mRNA及蛋白表達(dá)水平明下降，表明抑制LOX-1基因表達(dá)能減少巨噬細(xì)胞NOX2、p22phox的mRNA 及蛋白表達(dá)，LOX-1 可以影響巨噬細(xì)胞NOX 的表達(dá)。值得注意的是，LOX-1 不會改變未受刺激的巨噬細(xì)胞對ox-LDL 的攝取。在粥樣斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞中，促炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)LOX-1高表達(dá)，此時LOX-1 會顯著增加ox-LDL 的攝取，表明在巨噬細(xì)胞中，LOX-1對ox-LDL 攝取的調(diào)節(jié)具有特異性[17]。

綜上所述，本研究通過ox-LDL 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ox-LDL 與LOX-1 相互作用可激活巨噬細(xì)胞NOX，使NOX2、p22phox表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步促進(jìn)ROS 生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，而抑制LOX-1 可以抑制巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表明LOX-1 在巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激、動脈粥樣硬化發(fā)展中具有重要作用。LOX-1 是潛在的抗動脈粥樣硬化靶點，其在巨噬細(xì)胞中的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。明確ox-LDL/ LOX-1 通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生，進(jìn)而激活下游信號，對防控心腦血管疾病具有深遠(yuǎn)意義。