曾歐 肖歸 陳海波 張意平

糖尿病心肌?。―CM）的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞自噬、凋亡及心肌纖維化等有關(guān)[1-2]。硫化氫（H2S）是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的氣體信號(hào)分子[3]。研究發(fā)現(xiàn)，心臟纖維化及心臟重構(gòu)與細(xì)胞自噬有關(guān)[4-7]。H2S 能改善糖尿病心肌纖維化，其改善作用是否與自噬相關(guān)，目前尚不清楚。本研究建立糖尿病大鼠模型，探討氣體信號(hào)分子H2S 是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬改善糖尿病大鼠心肌細(xì)胞纖維化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

成年清潔級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量（280±40）g，訂購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室恒溫（23±1）℃環(huán)境中，分籠飼養(yǎng)，人工照明，白天黑夜各12 h，所有大鼠均可自由獲得水和食物?？雇媒M織膠原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ）、微管相關(guān)蛋白 1A/1B-輕鏈 3（LC3）、自噬蛋白P62、GAPDH 抗體購于美國Proteintech 公司；鏈脲佐菌素（STZ）購于阿拉丁公司；硫氫化鈉（NaHS）購于美國Sigma 公司；抗兔二抗購于美國Proteintech 公司；BCA 蛋白定量試劑盒、細(xì)胞裂解液購于中國碧云天公司。

1.2 模型建立及分組

SD 大鼠飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病組（STZ 組）、STZ＋高濃度H2S 組、STZ＋中濃度H2S 組、STZ＋低濃度H2S 組、STZ＋胱硫醚-γ-裂合酶（CSE）抑制劑炔丙基甘氨酸（PPG）組，每組10 只。大鼠按體質(zhì)量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）40 mol/kg，注射72 h 后，尾靜脈采血測血糖水平，血糖水平大于16.7 mmol/L 提示造模成功。造模成功后，STZ 組大鼠每天腹腔注射生理鹽水（30 mg/kg）；STZ＋H2S 組大鼠每天腹腔注射NaHS 溶液（高、中、低濃度H2S 組NaHS分別為100 mg/kg、60 mg/kg、40 mg/kg)；PPG 組大鼠每天腹腔注射PPG 溶液30 mg/kg。對(duì)照組僅每天腹腔注射生理鹽水30 mg/kg。大鼠在建模后至處死前陸續(xù)有死亡，且集中在建模后2 周內(nèi)，各組死亡數(shù)量不等，共14 只大鼠死亡，至8 周末各組大鼠總生存率為76%（46/60）。

1.3 Masson染色觀察大鼠心肌組織纖維化程度

取大鼠心尖組織，切片滴加核染液覆蓋整個(gè)組織，染色完成后觀察心肌組織病理纖維化程度。

1.4 Western blot法檢測纖維化相關(guān)蛋白及自噬蛋白的表達(dá)

取各組大鼠左室心肌組織，提取蛋白并定量。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）、轉(zhuǎn)膜后，室溫封閉2 h，抗Collagen Ⅰ、LC3、P62 抗體（1 ∶400 稀釋）及抗GAPDH 抗體（1 ∶8 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵1 h。顯影后行灰度掃描，以目的條帶與GAPDH 條帶的灰度比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織纖維化情況

對(duì)心肌組織進(jìn)行Masson 染色，膠原纖維呈藍(lán)色。對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密整齊，心肌組織血管周圍及肌間隙中僅有少量膠原纖維沉積；STZ組大鼠心肌細(xì)胞排列疏散紊亂，心肌組織膠原沉積較對(duì)照組增多，且向周圍間質(zhì)延伸，間質(zhì)可見少量炎性細(xì)胞浸潤；STZ＋H2S 組大鼠心肌組織膠原沉積較STZ 組明顯減少，與STZ＋高濃度H2S 組相比，STZ＋低濃度H2S 組及STZ＋中濃度H2S 組鼠心肌組織膠原沉積明顯增加，心肌細(xì)胞排列更加疏散紊亂。與STZ 組相比，STZ＋PPG 組大鼠心肌組織膠原沉積減少。與STZ＋高濃度H2S組相比，STZ＋PPG 組心肌組織膠原沉積明顯增加，心肌細(xì)胞排列更加疏散紊亂。與STZ＋低濃度H2S 組及STZ＋中濃度H2S 組相比，STZ＋PPG 組心肌組織膠原沉積程度及心肌細(xì)胞排列疏散紊亂程度無明顯差別。見圖1。

圖1 Masson染色示各組大鼠心肌組織纖維化情況（×400）

2.2 H2S對(duì)心肌組織中CollagenⅠ蛋白表達(dá)的影響

Western blot 法檢測各組大鼠心肌組織CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，STZ 組大鼠心肌組織中的CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與STZ 組相比，STZ＋H2S 組大鼠心肌CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與STZ＋高濃度H2S 組相比，STZ＋低濃度H2S 組及STZ＋中濃度H2S 組大鼠心肌組織中的CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與STZ 組相比，STZ＋PPG 組Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖2、表1。

圖2 Western blot法檢測各組心肌組織中Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)情況

表1 各組心肌組織Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)水平比較

2.3 H2S對(duì)心肌組織中LC3、P62蛋白表達(dá)的影響

Western blot 法檢測各組大鼠心肌組織LC3、P62 蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，STZ 組大鼠心肌組織中的P62 蛋白表達(dá)水平明顯升高，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明顯降低（P均＜0.01）；與STZ 組相比，STZ＋H2S 組大鼠心肌組織中的P62 蛋白表達(dá)水平明顯降低，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明顯升高（P均＜0.01），與STZ＋高濃度H2S 組相比，STZ＋低濃度H2S 組及STZ＋中濃度H2S 組大鼠心肌組織中的P62 蛋白表達(dá)水平明顯升高，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明顯降低（P均＜0.01）；與STZ 組相比，STZ＋PPG 組P62 的蛋白表達(dá)水平明顯降低，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明顯升高（P均＜0.01）。見圖3、表2。

圖3 Western blot法檢測各組心肌組織中LC3、P62蛋白表達(dá)情況

表2 各組心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及P62蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

糖尿病心肌病是指發(fā)生于糖尿病患者，不能用高血壓性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心臟瓣膜病及其他心臟病變來解釋的心肌疾病。糖尿病心肌病會(huì)導(dǎo)致心室功能障礙[8-10]。

糖尿病心肌病主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化和心臟微小血管病變，可引起心肌肥大和充血性心力衰竭[11]。心肌纖維化的特征是細(xì)胞外基質(zhì)過多，膠原蛋白增多[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病的心肌損害與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬調(diào)節(jié)失衡等有關(guān)[14]。自噬廣泛存在于真核細(xì)胞中，在細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)中起著重要作用[15-16]。誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，可延緩小鼠特發(fā)性肺纖維化進(jìn)展[17]。自噬形成時(shí)，胞漿型LC3（即LC3-Ⅰ）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば停碙C3-Ⅱ），因此，LC3-Ⅱ/LC Ⅰ比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。P62 是已知的自噬蛋白，也稱為SQSTM1 蛋白，在細(xì)胞內(nèi)P62 表達(dá)水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)。P62 蛋白是自噬激活的標(biāo)記物，LC3 Ⅱ增加，說明自噬小體增加，如果P62 同時(shí)減少，說明自噬活性增強(qiáng)，如果P62 同時(shí)增加，說明自噬小體降解過程被抑制，即自噬過程下游被抑制[18-19]。

本研究通過Masson 染色，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌中CollagenⅠ明顯增加，經(jīng)過H2S 及CSE 抑制劑干預(yù)后的糖尿病大鼠，心肌組織中CollagenⅠ明顯減少，由此推測氣體信號(hào)分子H2S 可改善糖尿病大鼠心肌纖維化，在不同濃度H2S 的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，較高濃度的H2S 改善糖尿病大鼠心肌纖維化更明顯。在糖尿病大鼠中，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值降低，P62 表達(dá)水平升高，提示糖尿病大鼠的自噬過程被抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，H2S 干預(yù)后糖尿病大鼠心肌組織LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高，P62 表達(dá)水平降低，提示自噬過程被激活；采用CSE 抑制劑對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行干預(yù)后，大鼠心肌中CollagenⅠ明顯減少，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高，P62 表達(dá)水平降低，自噬過程被激活。在不同濃度研究中發(fā)現(xiàn)，較高濃度的H2S 干預(yù)后，自噬過程的激活更為明顯。

綜上所述，H2S 通過激活自噬，改善因糖尿病導(dǎo)致的心肌纖維化，但是其具體調(diào)節(jié)機(jī)制及相關(guān)通路有待進(jìn)一步研究。