范怡倫 吳佳偉 丁丹 黃一航 薛松 黃日太

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生涉及多種機(jī)制，如氧自由基的產(chǎn)生、鈣離子超載、炎性反應(yīng)等[1-4]。如何減輕缺血再灌注引起的心肌損傷，仍是心血管臨床醫(yī)生面臨的難題。

Y 編碼樣睪丸特異性蛋白5 基因（TSPYL5）位于染色體8q22 位點(diǎn)，是1 種與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)的獨(dú)立標(biāo)記物[5-6]。有研究顯示TSPYL5 可以刺激多種細(xì)胞增殖[7]，參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)關(guān)鍵物p53 的負(fù)向調(diào)控[6]，如通過抑制p53 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和功能[8]。本研究探究在心肌缺血再灌注損傷中，TSPYL5 能否通過抑制p53 信號(hào)通路，減少心肌細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)心肌的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用主要試劑與儀器有H9c2 心肌細(xì)胞株（上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫）；抗TSPYL5、GAPDH、p53、Bcl-2、caspase-3 抗體（ABclonal）；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天）；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa）；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen）；BCA試劑盒（碧云天）等。

1.2 H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將H9c2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中。將細(xì)胞隨機(jī)分組：對(duì)照組按照常規(guī)方式培養(yǎng)細(xì)胞；缺氧復(fù)氧組將常規(guī)培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基，置于含1%O2、95%N2的缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，再將細(xì)胞放回37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。

1.3 TSPYL5過表達(dá)體系的構(gòu)建

將H9c2 細(xì)胞接種在6 孔板中培養(yǎng)24 h。將2.1 μg TSPYL5 過表達(dá)質(zhì)粒與5 μL 的P3000 溶于100 μL 無血清無抗生素的培養(yǎng)基中混勻；再將5 μL Lipofectamine 3000 溶于100 μL 無血清無抗生素的培養(yǎng)基中混勻，靜置15 min；將上述兩者輕柔混勻后，加入換有新鮮正常培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，過表達(dá)體系構(gòu)建完成。

1.4 小鼠心臟缺血再灌注模型的構(gòu)建

給予6～8 周雄性C57BL/6 小鼠腹腔注射1.2%異氟烷進(jìn)行麻醉，氣管插管后于小鼠胸骨左側(cè)3、4肋間剪開皮膚，打開胸腔，用手術(shù)縫線對(duì)側(cè)牽拉肋骨使心臟暴露。剪開心包，找出左心耳下緣的紅色血管即左前降支，打1 活結(jié)進(jìn)行結(jié)扎，暫時(shí)關(guān)閉胸腔。30 min 及2 h 后再次開胸，打開活結(jié)，看到心壁蒼白區(qū)域再次變紅，即為再灌注成功。

1.5 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞種入底部放有玻片的12 孔板，經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后使用多聚甲醛固定30 min，使用PBS 洗滌后根據(jù)凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作。直接置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白水平

細(xì)胞蛋白經(jīng)RIPA 裂解提取后，使用BCA 定量法測(cè)定蛋白濃度。使用10%的SDS-PAGE 凝膠電泳分離出分子量大小不同的蛋白，將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，使用快速封閉液將膜封閉后，一抗孵育過夜。TBST 洗膜后常溫避光孵育二抗2 h，洗膜后使用Odyssey Clx 掃膜。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Graphpad Prism 9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其中非配對(duì)t檢驗(yàn)用于進(jìn)行2 組樣本間的比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注后小鼠心肌TSPYL 5表達(dá)下調(diào)

為探究動(dòng)物模型中TSPYL 5 的表達(dá)水平是否與缺血再灌注損傷有關(guān)，實(shí)驗(yàn)設(shè)立了對(duì)照組、缺血0.5 h 組、再灌注0.5 h 組與再灌注2 h 組，進(jìn)行蛋白表達(dá)水平檢測(cè)。與對(duì)照組相比，缺血再灌注0.5 h和2 h 后小鼠心肌組織TSPYL5 的蛋白表達(dá)水平明顯下降。再灌注2h 的小鼠TSPYL5 的蛋白表達(dá)水平下降最顯著（P均＜0.05）。見表1。

表1 小鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注后的蛋白表達(dá)水平

2.2 缺氧/復(fù)氧后H9c2細(xì)胞凋亡顯著增加

與對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞TSPYL 5 的表達(dá)水平顯著下降，與此同時(shí)，p53、caspase-3 的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，促凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)顯著下調(diào)（P均＜0.05），提示細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧后發(fā)生凋亡，見表2。

表2 H9C2細(xì)胞中TSPYL 5與凋亡通路蛋白表達(dá)水平

2.3 TSPYL5過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了缺氧/復(fù)氧后的細(xì)胞凋亡

在H9c2 細(xì)胞中建立TSPYL5過表達(dá)體系，p53 與caspase-3 的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P均＜0.05），提示在過表達(dá)TSPYL5后細(xì)胞凋亡被明顯抑制。見圖1、表3。

表3 過表達(dá)TSPYL5后凋亡通路蛋白表達(dá)水平

圖1 TSPYL5過表達(dá)的構(gòu)建

在轉(zhuǎn)入質(zhì)粒后，與對(duì)照組相比，TSPYL5的高表達(dá)顯著抑制了缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的凋亡水平，見圖2。

圖2 缺氧/復(fù)氧后Tunel染色結(jié)果（×25）

3 討論

TSPYL5 在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，既往研究表明其可以促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖[7]，也可以通過與泛素特異性蛋白酶7（USP7）結(jié)合的方式對(duì)p53 通路產(chǎn)生抑制作用[6]，通過這種作用可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和功能[8]。然而，TSPYL5 蛋白能否通過抑制p53 通路在心肌缺血再灌注損傷中產(chǎn)生保護(hù)作用，還尚未有報(bào)道。

首先，本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠缺血再灌注模型中TSPYL 5 的表達(dá)水平均有下調(diào)，其中再灌注2 h 組下調(diào)最顯著。在后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)中，這樣的差異也同樣被驗(yàn)證。這說明TSPYL 5 的表達(dá)水平與心肌缺血再灌注存在一定的聯(lián)系。

p53 是腫瘤抑制蛋白，在細(xì)胞面臨缺氧/缺血壓力時(shí)，它是細(xì)胞周期與凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物[9-10]。本研究檢測(cè)到p53 凋亡信號(hào)通路蛋白即Bcl-2、caspase-3、p53 表達(dá)水平的變化，證實(shí)了H9c2 細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧模型中發(fā)生了顯著凋亡。

已有研究表明，抑制p53 介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路可以顯著地減少缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[11-12]。而且TSPYL5 已被證明可以通過與USP7 相互作用抑制p53，從而消除p53 介導(dǎo)的凋亡效應(yīng)[6]，比如促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[8]等。本研究已經(jīng)驗(yàn)證TSPYL5 在缺氧/復(fù)氧后表達(dá)水平會(huì)發(fā)生下調(diào)，由此進(jìn)一步探究在水平心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中，高表達(dá)TSPYL5是否能通過抑制p53 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。TSPYL5過表達(dá)細(xì)胞體系被成功構(gòu)建之后，結(jié)合蛋白表達(dá)水平與Tunel 染色結(jié)果提示，過表達(dá)TSPYL5通過抑制p53 信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)了心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后的凋亡水平。

以上研究結(jié)果表明，TSPYL 5 在心肌缺血再灌注后表達(dá)下調(diào)，通過抑制p53 信號(hào)通路的方式，發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。本研究?jī)H在體外驗(yàn)證了TSPYL5 對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，尚未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。TSPYL5 能否在小鼠缺血再灌注模型中實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌的保護(hù)作用，以及在未來如何將TSPYL5 作為潛在靶點(diǎn)，從而減輕心肌缺血再灌注損傷，需要后續(xù)深入研究。