張 豪，楊保剛，陳 宇

(1.浙江省臺(tái)州醫(yī)院 急診科，浙江 臺(tái)州 317300；2.浙江省人民醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 310014)

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament, ACL)重建術(shù)是最常見的腱骨愈合手術(shù)，腱骨愈合效果不佳的原因是腱骨中的肌腱移植、礦化和成熟并不總是令人滿意。富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)是各種生長因子的自體富集來源，已在創(chuàng)傷和骨科手術(shù)中廣泛使用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有促進(jìn)肌腱再生的巨大潛力，含有來自骨髓的BMSCs的宿主細(xì)胞有助于腱骨愈合。Wnt/β-catenin途徑已被證明在骨骼發(fā)育中至關(guān)重要，并作為潛在靶點(diǎn)受到了廣泛關(guān)注。近年來，大量研究報(bào)告了Wnt/β-catenin信號(hào)通路在成骨分化和骨形成中起著重要作用，但PRP聯(lián)合BMSCs通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)兔ACL重建后腱骨愈合的研究甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)采用自體PRP聯(lián)合BMSCs頂端注射的方法將相應(yīng)的凝膠注入骨道內(nèi)，觀察PRP聯(lián)合BMSCs是否對(duì)腱骨愈合有促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 45只12 周齡新西蘭白兔，體質(zhì)量(2.5±0.2)kg，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 胎牛血清購自北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素、油紅O和茜紅素購自北京索萊寶科技有限公司；CD29、CD90、CD34、CD45、Wnt1、Wnt3a及β-catenin的抗體購自美國Abcam公司；兔VEGF ELISA試劑盒和兔TGF-β1 ELISA試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；β-actin抗體和IgG-HRP抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 BMSCs的提取、分離、培養(yǎng)及體外分化 取5只新西蘭兔下肢，75%乙醇浸泡后超凈工作臺(tái)中剝離附著的肌肉，充分暴露出股骨和脛骨。去除股骨和脛骨兩端的骨骺，用100 mL無菌注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔至澄清。將沖洗出的骨髓吹打成懸液，1 000 ×g/min離心10 min，棄上清。加入DMEM/F12培養(yǎng)基，緩和吹洗；將上述重懸細(xì)胞液各取4 mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含有15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM /F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后棄去培養(yǎng)基，PBS溶液沖洗 2～3次去除未貼壁細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 PRP及實(shí)驗(yàn)?zāi)z制備 造模前30 min抽取兔耳緣靜脈血5 mL，置于含有1 mL枸櫞酸鈉的無菌離心管中。3 000 ×g/min，離心15 min，全血分為3層，吸取上部血清及界面下少量紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中；繼續(xù)3 000 ×g/min，離心15 min，去掉上層含有極少量未沉降血小板的血漿層，剩余血漿及血細(xì)胞成份搖勻即為PRP。在1 mL EP管中分別加入凝血酶與纖維蛋白原按1∶4比例混合，再加入1×10個(gè)/mL BMSCs細(xì)胞懸液、PRP。

1.5 模型制作、分組及給藥 40只新西蘭白兔隨機(jī)分為4組：control組、PRP組、BMSCs組和PRP+BMSCs組，每組10只。每只兔術(shù)前禁食12 h，耳緣靜脈注射水合氯醛麻醉，取左側(cè)下肢進(jìn)行ACL重建術(shù)，其ACL重建術(shù)方法參照楊軍軍等報(bào)道。配制PRP和BMSCs凝膠，采用頂端注射的方法注入骨道內(nèi)。control組僅注射生物蛋白凝膠1 mL；PRP組注射PRP凝膠1 mL；BMSCs組注射BMSCs凝膠1 mL；PRP+BMSCs組注射PRP及BMSCs凝膠1 mL。注射后用生物耳膠封閉骨道外口，最后逐層縫合傷口。術(shù)后前3天常規(guī)肌肉注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后28天各組新西蘭白兔經(jīng)耳緣注射水合氯醛麻醉，進(jìn)行取材。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 細(xì)胞形態(tài)及分化鑒定 第3代BMSCs在含有脂向誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行2周的成脂分化，用0.5%油紅O染色細(xì)胞內(nèi)脂滴顯示脂肪形成。第3代BMSCs在含有骨向誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周，進(jìn)行成骨分化，用2%茜素紅S(pH 4.1～4.3)染色評(píng)估。

1.6.2 BMSCs表面標(biāo)記物鑒定 待第3代BMSCs融合至80%～90%時(shí)，將細(xì)胞以6 000個(gè)/μL的密度重懸，并分別用CD29、CD90、CD34和CD45抗體標(biāo)記。隨后，在黑暗中孵育25 min， PBS洗滌2次后上機(jī)檢測表面標(biāo)記CD29、CD90、CD34和CD45的表達(dá)。

1.6.3 兔腱骨病理變化 取各組兔重建韌帶后的膝關(guān)節(jié)，剔除關(guān)節(jié)周圍的組織，置于4%多聚甲醛中固定72 h，之后在室溫下用EDTA溶液脫鈣4周。組織經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色，封片后使用顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.6.4 各組兔血清中VEGF、TGF-β1含量的變化 各組兔經(jīng)靜脈采血6～8 mL。靜置30 min后，以3 000 ×g/min，離心15 min，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書測定各組兔血清中VEGF、TGF-β1的含量。

1.6.5 各組兔腱骨結(jié)合處骨密度的變化 通過Micro-CT掃描儀在60 kV掃描電壓下以36 μm各向同性體素分辨率掃描所有組織，使用CTAn分析并計(jì)算腱骨結(jié)合處骨組織的骨密度。

1.6.6 各組兔腱骨最大加載負(fù)荷的變化 除重建的ACL之外的所有肌肉、軟組織、韌帶和縫線均被剔除；之后在Instron 553A材料測試系統(tǒng)中已45°屈曲固定，通過20 mm/min的速度連續(xù)增加拉伸負(fù)荷來進(jìn)行測試，通過負(fù)荷-變性曲線記錄最大加載負(fù)荷。

1.6.7 各組兔腱骨界面組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白的表達(dá) RIPA裂解液提取各組兔腱骨界面組織中的總蛋白。各組蛋白變性后經(jīng)上樣-電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育[Wnt1抗體(1∶1 000)、Wnt3a抗體(1∶1 000)、β-catenin抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶2 000)，4 ℃ 過夜]-二抗孵育[對(duì)應(yīng)一抗種屬來源的IgG-HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫1.5 h]-顯影曝光，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)及分化鑒定 從新西蘭白兔股骨中提取的BMSCs具有梭形形狀而且呈旋渦分布(圖1A)，體外分化可見細(xì)胞內(nèi)存在大量的脂質(zhì)滴(圖1B)和許多鈣化結(jié)節(jié)(圖1C)。

A.BMSCs的形態(tài)(400×)；B.BMSCs的成脂分化(油紅O染色，400×)；C.BMSCs的成骨分化(茜素紅染色，200×)

2.2 BMSCs表面標(biāo)記物鑒定 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果見圖2，第3代BMSCs的表面標(biāo)記為CD29陽性(95.5%)、CD90陽性(97.2%)、CD34陰性(4.3%)和CD45陰性(2.8%)，與BMSCs的免疫表型特征一致。

圖2 BMSCs表面標(biāo)記物檢測

2.3 各組兔腱骨病理變化 Control組中，肌腱和骨骼之間的界面主要由成纖維細(xì)胞組成，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)膠原和軟骨纖維；PRP組中，肌腱和骨連接處的纖維和軟骨細(xì)胞增加；BMSCs組中，在肌腱和骨連接處的膠原纖維、軟骨細(xì)胞和纖維軟骨增加；PRP+BMSCs組中，肌腱和骨連接處的軟骨纖維和軟骨細(xì)胞較PRP和BMSCs組增加。見封三圖1。

2.4 各組兔血清中VEGF、TGF-β1含量及骨密度和最大加載負(fù)荷的變化 與PRP組和BMSCs組比較，PRP+BMSCs組兔血清中VEGF、TGF-β1含量和兔腱骨結(jié)合處骨密度、最大加載負(fù)荷均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均<0.05)。見表1。

表1 各組兔血清中VEGF、TGF-β1含量及骨密度和最大加載負(fù)荷的變化

2.5 各組兔腱骨界面組織中Wnt1、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果表明：與control組比較，PRP組、BMSCs組和PRP+BMSCs組兔腱骨界面組織中Wnt1、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平上調(diào)，且PRP+BMSCs組最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均<0.01)。見圖3。

注：與control組比較，**P<0.01，***P<0.001；與PRP組比較，##P<0.01；與BMSCs組比較，&&P<0.01。

3 討論

前交叉韌帶(ACL)是膝蓋中的重要組成部分，其損傷是體育活動(dòng)中的一種嚴(yán)重而常見的損傷。最近，外科重建加上軟組織自體移植或同種異體移植已成為ACL撕裂的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但是約有四分之一的患者長期效果不理想，因此尋找更好的方法改善肌腱-骨界面的愈合至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞療法在ACL重建后用于腱骨愈合具有生物學(xué)潛力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是多能干細(xì)胞，可以在體外分化為多種細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在體內(nèi)形成骨骼，這突出了治療應(yīng)用的廣闊前景。我們從新西蘭白兔股骨中提取BMSCs，經(jīng)過鑒定后，采用頂端注射的方法，將BMSCs凝膠1 mL注射到骨道內(nèi)。經(jīng)過28天后，我們發(fā)現(xiàn)，ACL兔肌腱和骨連接處的軟骨纖維和軟骨細(xì)胞增加、腱骨結(jié)合處骨密度和最大加載負(fù)荷也增加，提示BMSCs能促進(jìn)前交叉韌帶重建后腱骨愈合。

VEGF是特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，能夠促進(jìn)損傷組織的血管新生。研究表明，VEGF在腱骨愈合過程中可促進(jìn)愈合組織的再血管化，提高愈合韌帶的強(qiáng)度。TGF-β1是參與細(xì)胞外基質(zhì)重建的細(xì)胞因子，對(duì)骨基質(zhì)內(nèi)膠原的合成具有促進(jìn)作用，同時(shí)也能在一定程度上誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，PRP聯(lián)合BMSCs可促進(jìn)VEGF和TGF-β1的生成，從而促進(jìn)腱骨愈合。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一個(gè)調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育和分化的重要信號(hào)途徑。研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞分化并抑制軟骨形成。在本實(shí)驗(yàn)中，PRP聯(lián)合BMSCs激活了Wnt/β-catenin信號(hào)途徑，從而促進(jìn)肌腱-骨界面的骨形成，從而促進(jìn)了腱骨愈合，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，PRP聯(lián)合BMSCs促進(jìn)了VEGF和TGF-β1的生成、增加了肌腱和骨連接處的軟骨纖維和軟骨細(xì)胞、腱骨結(jié)合處骨密度和最大加載負(fù)荷，其有可能與Wnt/β-catenin信號(hào)途徑有關(guān)，因此，PRP聯(lián)合BMSCs具有臨床應(yīng)用潛力。

感謝杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院鄧思思老師在實(shí)驗(yàn)研究中給予的幫助。