吳元肇，曾 勇，鄭克思，陳艷梅

(溫州市人民醫(yī)院 1.腫瘤外科；2.病理科，浙江 溫州 325000)

乳腺癌作為國內(nèi)外常見的女性惡性腫瘤，是導(dǎo)致女性死亡的主要原因之一。根據(jù)2022年美國癌癥協(xié)會(ACS)統(tǒng)計，預(yù)計在2022年，中國發(fā)病率前5位的癌癥為肺癌、腸癌、胃癌、肝癌與乳腺癌。臨床常通過局部手術(shù)聯(lián)合化療、內(nèi)分泌治療以及靶向藥物等綜合手段治療乳腺癌，患者往往能得到較好救治。然而，對于特殊類型三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)，臨床暫無有效內(nèi)分泌治療方法及靶向策略。另外，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，對于內(nèi)分泌治療和靶向藥物有效的患者，在經(jīng)過一線及二線治療后，常產(chǎn)生耐藥性，極大限制了其治療效果。因此，對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制進(jìn)行深入研究，對尋找新的治療靶點、開發(fā)新型治療方法具有極大臨床意義。

細(xì)胞周期相關(guān)因子3(cell division cycle associated protein 3,CDCA3)，作為F Box蛋白，是細(xì)胞有絲分裂過程中必需的胞質(zhì)蛋白，對細(xì)胞周期、DNA復(fù)制等多種生物過程具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，CDCA3在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中均呈高表達(dá)水平，抑制CDCA3蛋白表達(dá)，可降低腫瘤細(xì)胞活性，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。然而，CDCA3在乳腺癌中的表達(dá)和功能研究較少。因此，本課題組收集臨床不同分期乳腺癌組織，利用生化實驗結(jié)合生物信息學(xué)方法分析CDCA3蛋白水平與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性；同時構(gòu)建穩(wěn)定敲低CDCA3基因的乳腺癌細(xì)胞株，進(jìn)一步研究CDCA3在乳腺癌致病機制中的作用，以期為乳腺癌的靶向治療提供臨床實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 免疫組化檢測CDCA3在乳腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá) 收集我院2020年1月—10月乳腺癌標(biāo)本庫中乳腺癌組織(不同組織型或者不同分期如早期中期晚期)41例，癌旁組織標(biāo)本40例。本研究通過溫州市人民醫(yī)院倫理委員會審核并備案。采用免疫組化法檢測乳腺癌組織和癌旁組織中CDCA3的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作(CDCA3抗體：Amresco)，試劑盒購自卡邁舒(上海)生物科技有限公司。倒置顯微鏡下，根據(jù)細(xì)胞染色的強弱直觀評分：-陰性(無染色)，+弱陽性(淡黃色)，++陽性(棕黃色)，+++強陽性(棕色)。

1.2 GEPIA平臺分析CDCA3在乳腺癌組織中的表達(dá)情況 通過GEPIA平臺(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析相對于正常乳腺組織，乳腺癌中CDCA3基因表達(dá)的差異，基因名稱選擇“CDCA3”，Dataset(Cancer name)選擇“BRCA”。

1.3 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)平臺分析CDCA3與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系 登錄Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)平臺(http://kmplot.com/analysis/)，檢索CDCA3基因，獲得CDCA3基因表達(dá)差異患者的生存曲線(對腫瘤病理類型及臨床分期、分級等不做限制)。

1.4 細(xì)胞株構(gòu)建與CDCA3檢測 利用shRNA構(gòu)建穩(wěn)定干擾CDCA3表達(dá)的乳腺癌MCF7細(xì)胞株(Sh1，Sh2)及對照組細(xì)胞(NC)。培養(yǎng)MCF7乳腺癌細(xì)胞株(培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS，細(xì)胞培養(yǎng)條件為5% CO，37 ℃)，DMEM購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Gibco公司；胰酶和DMSO購自美國Amresco公司。通過慢病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定干擾CDCA3基因表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株(PLKO.1-CDCA3shRNA)及對照組細(xì)胞(漢恒生物，siRNA: Invitrogen，美國)。

取對數(shù)期細(xì)胞，PBS沖洗3遍，蛋白提取試劑盒提取總蛋白(Pierce，美國)，加入5×上樣緩沖液，100 ℃ 水浴鍋煮沸5 min后冷卻待用。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，移至PVDF膜，于脫脂牛奶中室溫封閉1 h，PBST洗膜10 min×3次，一抗稀釋液4 ℃ 孵育過夜，次日PBST洗膜10 min×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液室溫反應(yīng)2 h，PBST洗膜10 min×3次，ECL顯影并分析條帶灰度。

1.5 細(xì)胞增殖檢測 分別收集對數(shù)生長期的穩(wěn)定干擾CDCA3基因表達(dá)的MCF7細(xì)胞和對照組細(xì)胞，血球計數(shù)板計數(shù)后加入四塊96孔板中，5 000個細(xì)胞/孔，每個孔加入100 μL培養(yǎng)基，設(shè)置3復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后取出一塊96孔板，每孔中加入10 μL CCK8溶液作為起始對照樣本，37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5 h，于分光光度計450 nm波長處測定吸光值，保存數(shù)值。另三塊96孔板按藥物濃度依次加入含藥培養(yǎng)基，終體積100 μL，37 ℃、5% CO條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。取出加藥的96孔板，每孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5 h，450 nm測定吸光值，保存數(shù)值并分析。

1.6 乳腺癌細(xì)胞周期變化檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，清洗離心后用固定液配置細(xì)胞懸液(1×10個/mL)，加入10 μL試劑B(70-APCC101，聯(lián)科生物，中國)，室溫避光孵育30 min。利用流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson，美國)、軟件FACS express version 3，分析細(xì)胞周期變化情況。

1.7 基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA) 通過GEO數(shù)據(jù)庫下載5套亞洲人乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)集(GSE6367、GSE9309、GSE15852、GSE33447和GSE45255)，共獲得318例乳腺癌和60例正常乳腺組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。根據(jù)CDCA3基因表達(dá)水平高低分為兩組，利用GSEA(GSEA3.0版本)分析CDCA3的表達(dá)水平對各種生物通路基因集的影響。按默認(rèn)加權(quán)富集統(tǒng)計方法，以從GSEA網(wǎng)站MsigDB數(shù)據(jù)庫中獲得的基因集作為參照基因集，置換次數(shù)為1 000次。

1.8 統(tǒng)計方法 采用Graghpad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料組間比較應(yīng)用Anova聯(lián)合檢驗。<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDCA3在乳腺癌組織中的表達(dá)水平 本院標(biāo)本的免疫組化分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中CDCA3蛋白表達(dá)量(1.83±0.72)顯著高于癌旁組織(1.02±0.51)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.001)。GEPIA數(shù)據(jù)平臺中，共收集正常乳腺組織112例、乳腺癌組織1 085例，分析結(jié)果顯示，CDCA3在乳腺癌中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)，見圖1。

圖1 CDCA3在乳腺癌組織及癌旁組織(正常組織)中表達(dá)量的比較

2.2 CDCA3表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，高表達(dá)CDCA3的乳腺癌患者50個月總體生存率(57.21%)低于CDCA3低表達(dá)者(70.22%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)，見圖2。

圖2 CDCA3表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性

2.3 各組乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖情況 Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Sh1組和Sh2組的CDCA3蛋白表達(dá)量明顯降低，可穩(wěn)定敲低CDCA3表達(dá)(圖3A)。CCK8檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Sh1組和Sh2組在48 h和72 h的細(xì)胞增殖出現(xiàn)顯著抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)，見圖3B。

A.各組細(xì)胞中CDCA3蛋白表達(dá)量；B.各組細(xì)胞的增殖情況；與對照組(NC)比較，*P<0.05。

2.4 下調(diào)CDCA3后腫瘤細(xì)胞周期變化 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：與對照組(NC)細(xì)胞相比，敲低CDCA3后的MCF7細(xì)胞株(Sh1，Sh2)G1期顯著延長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(< 0.05)，細(xì)胞周期的S、G2期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(> 0.05)，見圖4。

與對照組(NC)比較，*P<0.05。

2.5 各組細(xì)胞NF-кB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 免疫印跡實驗結(jié)果顯示，下調(diào)CDCA3表達(dá)后，與對照組相比，Sh1組和Sh2組的NF-кB1(p50)、RelA(p65)蛋白表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(< 0.05)，見圖5。

A.各組細(xì)胞免疫印跡實驗結(jié)果；B.各組細(xì)胞NF-кB1(p50)蛋白表達(dá)；C.各組細(xì)胞RelA(p65)蛋白表達(dá)；與對照組(NC)比較，*P<0.05。

2.6 CDCA3高表達(dá)樣本的富集基因集 利用GSEA分析平臺對CDCA3高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞樣本富集基因進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示：CDCA3高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞存在與NF-кB信號通路、E2F信號通路、mTOR信號通路、有絲分裂紡錘體、PI3K-AKT-mTOR信號通路、G1S 檢查點、糖酵解、未折疊蛋白反應(yīng)、膽固醇平衡等相關(guān)的基因集。

表1 CDCA3高表達(dá)的乳腺癌樣本的GSEA

3 討論

乳腺癌被認(rèn)為是危害女性健康的“頭號殺手”,并以每年3.1%的速度增長。現(xiàn)有靶向治療方法(如HER-2抗體或內(nèi)分泌治療)雖有較好的療效，但無法適用于所有乳腺癌患者，且常會不可避免地產(chǎn)生耐藥等問題。因此，探索乳腺癌發(fā)生發(fā)展高敏感性生物學(xué)指標(biāo)，找尋新的生物治療靶點具有重大臨床意義。

已報道CDCA3是胃癌的潛在診斷標(biāo)志物，可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長。結(jié)直腸癌中，上調(diào)的CDCA3表達(dá)與結(jié)直腸癌的漿膜浸潤、TNM分期呈正相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，CDCA3能夠通過降解細(xì)胞周期抑制分子，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，已被作為非小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)志物和治療靶點。已有實驗證實，前列腺癌中Homeobox B3可通過綁定到CDCA3啟動子區(qū)，活化CDCA3蛋白，促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展進(jìn)程。然而，乳腺癌中CDCA3的具體機制仍未完全清晰。

本研究結(jié)果顯示，在收集的乳腺癌患者樣本中，乳腺癌組織CDCA3的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，TCGA數(shù)據(jù)庫分析亦顯示CDCA3基因在乳腺癌中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織。同時，通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析顯示，CDCA3表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示CDCA3低表達(dá)的患者具有更好的生存時間和預(yù)后轉(zhuǎn)歸。進(jìn)一步利用慢病毒包裝系統(tǒng)，成功構(gòu)建穩(wěn)定敲低CDCA3的乳腺癌細(xì)胞株，CCK8細(xì)胞增殖檢測結(jié)果顯示CDCA3基因干擾能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7的增殖活性，提示CDCA3在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

CDCA3為細(xì)胞周期分裂相關(guān)蛋白家族成員，是S期激酶相關(guān)蛋白1(SKP1)/淘汰素(Cullin1)/F-box(SCF)E3泛素連接酶復(fù)合物的一部分，可通過調(diào)節(jié)有絲分裂抑制激酶weel的降解過程，介導(dǎo)細(xì)胞周期的進(jìn)展，被稱為進(jìn)入有絲分裂的“觸發(fā)因子”。前期研究報道證實，結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中敲減CDCA3后，在體內(nèi)和體外均可觀察到細(xì)胞增殖出現(xiàn)顯著抑制，其可能機制為細(xì)胞周期G1到S期的轉(zhuǎn)換停滯。而本實驗中我們同樣觀察到，CDCA3下調(diào)后細(xì)胞周期的G1期顯著延長，且可能與調(diào)節(jié)增殖相關(guān)NF-кB通路蛋白相關(guān)。另一方面，GSEA分析結(jié)果顯示，CDCA3亦可能通過多種與細(xì)胞周期相關(guān)的生物學(xué)過程(如G1S檢查點、未折疊蛋白反應(yīng)、有絲分裂紡錘體等)、多種與腫瘤增殖相關(guān)的信號通路(E2F信號通路、NF-кB信號通路、mTORC1以及PI3K-AKT-mTOR信號通路)以及多種代謝相關(guān)的生物學(xué)過程(糖酵解和脂肪平衡)調(diào)節(jié)乳腺細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞生長。

綜上所述，CDCA3在乳腺癌組織中表達(dá)顯著增加，且CDCA3的表達(dá)水平與乳腺癌患者的預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)，在乳腺癌細(xì)胞中干擾CDCA3表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。同時，結(jié)合生物信息學(xué)分析提示CDCA3可能是乳腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵分子，是預(yù)防和治療乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點。但是，本研究尚未對CDCA3促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的機制進(jìn)行研究，將在今后研究中進(jìn)一步探索。