胡麗霞，劉 巧，郎 璇

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330012）

銀屑病是以角質(zhì)形成細胞過度增殖、炎癥細胞浸潤為主要病理表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病。遺傳與環(huán)境因素之間的相互作用是導(dǎo)致發(fā)病的主要原因之一。表觀遺傳修飾是在不改變DNA序列的情況下，通過DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等調(diào)節(jié)基因表達，其可能是銀屑病發(fā)病機理中遺傳和環(huán)境因素之間相互作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。研究表明，組蛋白脫乙酰基酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物（glioma-associated oncogene homolog，Gli）去乙?；芗せ頗edgehog（Hh）信號通路[2]。Gli1是Hh信號通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其激活后可靶向調(diào)控下游基因，促進細胞增殖[3-4]。因此，通過靶向調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；?，調(diào)控角質(zhì)形成細胞增殖是治療銀屑病的有效方式之一。但這類組蛋白抑制劑不能靶向特定器官，因此具有一定的副作用。

中醫(yī)治療銀屑病歷史悠久，且效果顯著。劉巧總結(jié)多年臨床經(jīng)驗，認為銀屑病的病位在“血分”，病因為“毒邪”，而“毒邪”源于飲食、環(huán)境等因素，這與表觀遺傳因素介導(dǎo)環(huán)境因素參與銀屑病發(fā)病的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論相契合；其根據(jù)“毒邪理論”組方，制成中成藥清血毒膠囊[5]。前期臨床研究表明，本藥治療銀屑病療效顯著，且無明顯副作用[6]，但其作用機制尚需探究。本研究通過觀察清血毒膠囊對銀屑病模型小鼠治療效果及HDAC1、Gli1表達的影響，旨在探究本藥干預(yù)銀屑病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6周齡雄性健康BALB/c小鼠60只，SPF級，體質(zhì)量18～20 g，由斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心動物房，溫度20～25℃，濕度40%～60%，12 h/12 h明暗交替環(huán)境，常規(guī)喂養(yǎng)，動物實驗倫理批號：JZSYDWLL2020-0528。整個實驗過程中對動物的各種處理均遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中的相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物與試劑 清血毒膠囊（批號：20191107，規(guī)格：0.25g/粒）購自海南省皮膚病醫(yī)院；甲氨蝶呤片（批號：190401，規(guī)格：0.25 mg/粒）購自通化茂祥制藥有限公司；咪喹莫特軟膏（批號：H20030129）購自明欣藥業(yè)有限公司；Gli1Rabbit pAb（批號：EPR4523）購自abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號：0104）購自BIOMIGA公司；超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號：IS0709）購自蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司；HDAC1 Rabbit pAb（批號：0081210201）、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（批號：9300014001）均購自ABcolnal公司；Trizon Reagent（批號：CW0580S）、Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒（批號：CW0581M）、HiScriptRII Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)（批號：R223-01）均購自康為世紀公司。

1.3 主要儀器RM 2255型石蠟切片機（德國Leica公司）；D 1008 E型微型離心機（美國賽洛捷克公司）；酶標儀（美國Thermofisher）；XH-C型旋渦混合器（常州越新儀器制造有限公司）；GL-150型干式電加熱器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TGL-16 G型低溫高速離心機（常州中捷實驗儀器制造有限公司）；XSP-17C型熒光相差顯微鏡（Leica公司）；VE-186型直立轉(zhuǎn)移電泳槽（Tanon）；CL750型凝膠成像儀（ProteinSimple）。

1.4 造模與分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按隨機數(shù)字表法將小鼠分為空白組、模型組、甲氨蝶呤組、清血毒膠囊低劑量組、清血毒膠囊中劑量組、清血毒膠囊高劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠制備銀屑病模型：采用電動剃毛刀剃毛（剃毛面積3 cm×3 cm），每天用棉簽涂抹5%咪喹模特軟膏（42 mg/只），1次/d，連續(xù)外涂7 d。造模成功小鼠背部皮膚可見鱗屑、紅斑及皮膚增厚等癥狀。空白組小鼠背部涂抹等量凡士林乳膏。

1.5 實驗給藥 造模同時予治療藥物干預(yù)。給藥劑量參照人與動物體表面積換算公式計算（70 kg與20 g小鼠等效劑量比值為0.0026）[7]。清血毒膠囊成人劑量為3 g/d，甲氨蝶呤成人劑量為5 mg/d。清血毒膠囊低、中、高劑量組小鼠分別給予清血毒膠囊混懸液灌胃，0.195、0.39、0.78 g/（kg·d），2次/d，連續(xù)給藥7d。甲氨蝶呤組小鼠給予甲氨蝶呤溶液灌胃，0.65 mg/（kg·d），2次/d，連續(xù)給藥7 d。空白組和模型組小鼠給予等量生理鹽水灌胃，2次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 小鼠皮損PASI評分 每天觀察并記錄各組小鼠的皮損顏色、鱗屑程度、皮膚厚度，并進行銀屑病皮損嚴重程度指數(shù)評分（psoriasis area and severity index，PASI）。具體評分項目包括紅斑顏色、鱗屑覆蓋面積、斑塊厚度。（1）紅斑顏色：無紅斑，計0分；有輕微紅斑，計1分；有中度紅斑，計2分；有重度紅斑，計3分；有極重度紅斑，計4分。（2）鱗屑覆蓋面積：無鱗屑覆蓋，計0分；有散在細鱗屑覆蓋，計1分；大部皮損部有鱗屑覆蓋，計2分；全部皮損有鱗屑覆蓋，計3分；整體皮膚為皮損，計4分。（3）斑塊厚度：正常皮膚，計0分；皮損輕微高出正常皮膚，計1分；皮損微隆，計2分；皮損肥厚，計3分；整體皮膚皮損，計4分。各項指標的得分加權(quán)為PASI評分[8]。

1.6.2 HE染色檢測小鼠皮膚組織病理學(xué)變化 末次給藥結(jié)束后，予5%水合氯醛溶液麻醉，取小鼠皮膚組織1 cm×1 cm，于中性甲醛固定，剩余組織于-80℃冰箱凍存。皮膚組織病理切片制作：皮膚組織固定24 h后，自動脫水機脫水，石蠟包埋，切片，烤片，二甲苯脫蠟，依次浸于無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、自來水水化，蘇木精核染，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）返藍，伊紅復(fù)染，脫水透明，封片。鏡下觀察切片，參照文獻[9]評分標準，予Baker法組織學(xué)評分。

1.6.3 Western blotting檢測小鼠皮損部HDAC1和Gli1蛋白含量 取小鼠皮損組織，稱重后剪碎（冰盒上操作），置于EP管，加裂解液和蛋白抑制劑，加預(yù)冷鋼珠勻漿，離心，取上清，5×稀釋，參照BCA試劑盒測蛋白濃度；剩余上清液按4∶1的比例加loading buffer緩沖液，煮沸，500 μL/管分裝，-80℃凍存。蛋白濃度測定后，取適量組織蛋白電泳。電泳步驟：制備分離膠和濃縮膠，注入玻璃板，插入梳子，待膠凝固，取出梳子，上樣，注入電泳液電泳，截取目的蛋白的凝膠，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉，TBST洗膜，一抗孵育過夜，TBST洗膜，二抗孵育，TBST洗膜，顯影，測目的蛋白。采用Image J軟件分析蛋白灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布計量資料用“均數(shù)±標準差”（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態(tài)分布計量資料采用非參數(shù)秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠背部皮膚癥狀比較 干預(yù)結(jié)束后，空白組小鼠背部皮膚無紅斑、鱗屑等癥狀，皮膚厚度正常；模型組小鼠背部皮膚出現(xiàn)明顯紅斑、鱗屑和皮膚增厚等癥狀；甲氨蝶呤組小鼠背部皮膚可見少量鱗屑，無明顯紅斑，無明顯皮膚增厚癥狀；清血毒膠囊低劑量組小鼠背部皮膚可見少量鱗屑覆蓋，伴有紅斑，皮膚輕度增厚；清血毒膠囊中劑量組小鼠背部皮膚可見少量鱗屑，無明顯皮膚增厚，可見少量紅斑；清血毒膠囊高劑量組小鼠背部皮膚可見少量鱗屑，無明顯紅斑，無明顯皮膚增厚。（見圖1）

圖1 各組小鼠皮損癥狀比較

2.2 各組小鼠PASI評分比較 除空白組外，其余各組大鼠的PASI評分均隨時間的延長（第1天、第3天、第7天）而逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），即存在時間效應(yīng)。6組小鼠PASI評分總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），即存在分組效應(yīng)。干預(yù)第1天，與空白組比較，模型組和清血毒膠囊低、中劑量組小鼠PASI評分明顯升高（P<0.05），甲氨蝶呤和清血毒膠囊高劑量組小鼠PASI評分與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組和清血毒膠囊高劑量組小鼠PASI評分明顯降低（P<0.05）；清血毒膠囊低、中、高劑量組小鼠PASI評分與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；清血毒膠囊中、高劑量組小鼠PASI評分與清血毒膠囊低劑量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；清血毒膠囊高劑量組小鼠PASI評分與清血毒膠囊中劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)第3天，與空白組比較，模型組、甲氨蝶呤組和清血毒膠囊低、中、高劑量組小鼠PASI評分均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組和清血毒膠囊中、高劑量組小鼠PASI評分明顯降低（P<0.05）；與甲氨蝶呤組比較，清血毒膠囊低、中劑量組小鼠PASI評分明顯升高（P<0.05）；與清血毒膠囊低劑量組比較，清血毒膠囊中、高劑量組小鼠PASI評分明顯降低（P<0.05）；與清血毒膠囊中劑量組比較，清血毒膠囊高劑量組小鼠PASI評分明顯降低（P<0.05）。干預(yù)第7天，與空白組比較，模型組、甲氨蝶呤組和清血毒膠囊低、中、高劑量組小鼠PASI評分均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組和清血毒膠囊中、高劑量組小鼠PASI評分均明顯降低（P<0.05）；與甲氨蝶呤組比較，清血毒膠囊中、低劑量組小鼠PASI評分明顯升高（P<0.05）；與清血毒膠囊低劑量組比較，清血毒膠囊中、高劑量組小鼠PASI評分均明顯降低（P<0.05）；與清血毒膠囊中劑量組比較，清血毒膠囊高劑量組小鼠PASI評分明顯降低（P<0.05）。時間因素和組別因素存在交互效應(yīng)（P<0.05）。（見圖2、表1）

表1 各組小鼠PASI評分比較（±s，分）

表1 各組小鼠PASI評分比較（±s，分）

注：F時間主效應(yīng)=2.081，P時間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=335.283，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=126.638，P交互效應(yīng)=0.000；與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與甲氨蝶呤組比較，cP<0.05；與清血毒膠囊低劑量組比較，dP<0.05；與清血毒膠囊中劑量組比較，eP<0.05；與第1天比較，fP<0.05；與第3天比較，gP<0.05

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量[mg/（kg·d）]第1天 第3天 第7天 F P空白組 10 - 0±0 0±0 0±0模型組 10 - 1.40±0.52a c 1.90±0.31ac 8.50±0.52acfg 731.017 0.000甲氨蝶呤組 10 0.65 0.60±0.52b 0.80±0.42abd 4.20±0.42abfg 197.357 0.000清血毒膠囊低劑量組 10 195.00 1.20±0.42a 1.80±0.42acf 8.40±0.52acfg 769.500 0.000清血毒膠囊中劑量組 10 390.00 0.80±0.42a 1.40±0.52af 5.90±0.57abcdfg 304.043 0.000清血毒膠囊高劑量組 10 780.00 0.77±0.62b 0.90±0.32abd 4.30±0.48abdefg 211.167 0.000 F 12.808 37.265 376.518 P 0.000 0.000 0.000

圖2 各組小鼠PASI評分交互效應(yīng)輪廓圖

2.3 各組小鼠皮膚組織的病理變化比較 空白組小鼠表皮無增厚，無鱗屑，無明顯炎癥細胞浸潤，無表皮突延長，無角質(zhì)形成細胞角化不全等病理表現(xiàn)；模型組小鼠表皮明顯增厚，脫屑明顯、局部可見角化不全細胞，表皮突向下延長，真皮層可見炎癥細胞浸潤；甲氨蝶呤組小鼠表皮略見增厚，有少許鱗屑，炎癥細胞浸潤明顯減少，表皮突明顯變短；清血毒膠囊低劑量組小鼠表皮增厚明顯，表皮突明顯延長，可見明顯脫屑，伴有炎癥細胞浸潤；清血毒膠囊中劑量組小鼠表皮明顯變薄，表皮突變短，可見少量鱗屑脫落，伴有角化不全和角化過度細胞；清血毒膠囊高劑量組小鼠表皮增厚明顯減輕，無明顯炎癥細胞浸潤，表皮突明顯變短，無鱗屑。（見圖3）

圖3 各組小鼠皮膚組織病理變化情況（HE，×100）

2.4 各組小鼠Baker法評分比較 與空白組比較，模型組小鼠Baker法評分明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，甲氨蝶呤組和清血毒膠囊中、高劑量組小鼠Baker法評分均明顯降低（P<0.05）；清血毒膠囊低劑量組小鼠Baker法評分與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與甲氨蝶呤組比較，清血毒膠囊中、低劑量組小鼠Baker法評分均明顯升高（P<0.05）；清血毒膠囊高劑量組小鼠Baker法評分與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與清血毒膠囊低劑量組比較，清血毒膠囊中、高劑量組小鼠Baker法評分均明顯降低（P<0.05）。與清血毒膠囊中劑量組比較，清血毒膠囊高劑量組小鼠Baker法評分明顯降低（P<0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠的Baker評分比較（±s，分）

表2 各組小鼠的Baker評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與甲氨蝶呤組比較，cP<0.05；與清血毒膠囊低劑量組比較，dP<0.05；與清血毒膠囊中劑量組比較，eP<0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量[mg/（kg·d）]Baker評分空白組 10 - 0.15±0.24模型組 10 - 6.40±0.66a甲氨蝶呤組 10 0.65 1.60±0.52ab清血毒膠囊低劑量組10 195.00 6.30±0.35ac清血毒膠囊中劑量組10 390.00 4.90±0.52abcd清血毒膠囊高劑量組10 780.00 2.05±0.69abde F 260.672 P 0.000

2.4 各組小鼠皮膚組織HDAC1和Gli1蛋白表達比較 與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織Gli1蛋白相對表達量明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組和清血毒膠囊低、中、高劑量組小鼠皮膚組織Gli1蛋白相對表達量均明顯降低（P<0.05），且4組間小鼠皮膚組織Gli1蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織HDAC1蛋白相對表達量明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組和清血毒膠囊中、高劑量組小鼠皮膚組織HDAC1蛋白相對表達量均明顯降低（P<0.05）；與甲氨蝶呤組比較，清血毒膠囊高劑量組小鼠皮膚組織HDAC1蛋白相對表達量明顯降低（P<0.05），清血毒膠囊低劑量組小鼠皮膚組織HDAC1蛋白相對表達量明顯升高（P<0.05）；清血毒膠囊高劑量組小鼠皮膚組織HDAC1蛋白相對表達量明顯低于清血毒膠囊中、高劑量組（P<0.05）。（見圖4、表4）

圖4 各組小鼠皮膚組織HDAC1、Gli1蛋白表達Western blotting圖

表4 各組小鼠皮膚組織HDAC1、Gli1蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組小鼠皮膚組織HDAC1、Gli1蛋白相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與甲胺蝶呤組比較，cP<0.05；與清血毒膠囊低劑量組比較，dP<0.05；與清血毒膠囊中劑量組比較，eP<0.05

分組 動物數(shù)（只）給藥劑量[mg/(kg·d）] HDAC1 Gli1空白組 10 - 0.57±0.15 0.44±0.13模型組 10 - 0.88±0.16a 0.71±0.20a甲氨蝶呤組 10 0.65 0.56±0.07b 0.42±0.12b清血毒膠囊低劑量組10 195.00 0.76±0.10c 0.31±0.09b清血毒膠囊中劑量組10 390.00 0.59±0.05b 0.36±0.12b清血毒膠囊高劑量組10 780.00 0.37±0.03abcde 0.27±0.15b F 8.207 3.681 P 0.001 0.030

3 討論

銀屑病患者皮損中存在真皮和表皮免疫細胞浸潤，以及表皮角質(zhì)形成細胞過度增生等病理表現(xiàn)，臨床表現(xiàn)為連續(xù)、反復(fù)出現(xiàn)的鱗屑脫落及局部炎癥的難以消退[10]。本研究結(jié)果顯示，銀屑病模型小鼠表皮明顯增厚，脫屑明顯，局部可見角化不全細胞，表皮細胞角化過度明顯，表皮突向下延長，真皮層可見炎癥細胞浸潤，PASI評分、Baker法評分均顯著升高（P<0.05），說明銀屑病小鼠造模成功。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，清血毒膠囊具有抑制銀屑病小鼠角質(zhì)形成細胞增殖的作用[11]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)清血毒膠囊治療后，銀屑病小鼠的PASI評分和Baker法評分均明顯降低（P<0.05）。再次證實清血毒膠囊干預(yù)銀屑病療效肯定，且其治療效果與干預(yù)時間和藥物濃度相關(guān)。

Hedgehog信號通路由NüSSLEIN-VOLHARD C和WIESCHAUS E在果蠅中首次發(fā)現(xiàn)[12]，該通路對胚胎發(fā)育和組織再生具有重要作用[13]。研究[3-4]表明，Hedgehog途徑參與細胞存活、增殖和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換等細胞生理過程。最近的研究[14]表明，Hedgehog信號的異常激活，可能會誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞過度增殖和異常分化。且有研究[15]證實，阻斷Hedgehog通路能抑制HaCaT細胞的增殖能力和抑制炎癥細胞因子的表達。本實驗結(jié)果也顯示，銀屑病模型小鼠Gli1的蛋白相對表達量明顯升高（P<0.05）。清血毒膠囊低、中、高劑量組小鼠皮損部Gli1蛋白相對表達量均明顯降低（P<0.05）。由此可見，清血毒膠囊對銀屑病皮損部Gli1蛋白表達具有顯著抑制作用，且其抑制作用與藥物濃度相關(guān)。

邵依等[16]研究表明銀屑病皮損組織中HDAC1表達明顯升高。HWANG Y J等[17]也發(fā)現(xiàn)斑塊狀銀屑病患者皮損中HDAC1的含量明顯高于健康人。因此，抑制HDAC1的表達，干預(yù)非經(jīng)典通路調(diào)控Gli1的去乙?；揎?，阻斷Hedgehog活性，可能是干預(yù)銀屑病的作用機制。本研究結(jié)果表明，清血毒膠囊中、高劑量組小鼠皮損部HDAC1蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。由此可見，清血毒膠囊對銀屑病小鼠皮損部HDAC1蛋白表達具有顯著抑制作用，且其抑制作用隨藥物濃度的升高逐漸增強。

綜上所述，清血毒膠囊具有改善銀屑病小鼠皮損部病理變化，抑制HDAC1、Gli1蛋白表達的作用，其機制可能是通過抑制HDAC1、Gli1蛋白表達，調(diào)控下游靶基因，從而抑制角質(zhì)形成細胞增殖，發(fā)揮干預(yù)銀屑病的作用。本研究下一步將采用細胞實驗，通過抑制或過表達HDAC1，深入探究清血毒膠囊對HDAC1表達、Gli1去乙?；挠绊?。