凌家艷，劉 慶，馬 威，薛 莎

（1.武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430030；2.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061）

骨質(zhì)疏松癥是以骨密度及骨質(zhì)量下降、骨微結(jié)構(gòu)改變等為主要表現(xiàn)，導(dǎo)致骨脆性增加、骨折及全身性骨病發(fā)生的一類與年齡相關(guān)的代謝性疾病[1]。絕經(jīng)后女性因卵巢功能衰退，雌激素水平下降，導(dǎo)致骨量下降，易發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松癥可導(dǎo)致駝背、骨痛，甚至骨質(zhì)疏松性骨折。流行病學(xué)調(diào)查顯示年齡超過50歲的人群骨質(zhì)疏松癥患病率為19.2%，年齡超過60歲的人群患病率超過30%[2]。研究預(yù)測，至2050年，我國骨質(zhì)疏松性骨折人數(shù)將達(dá)599萬[3]，將會對個體及社會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，越來越多的研究表明Wnt通路是研究骨質(zhì)疏松癥治療方法極為有效的通路之一[4]。補(bǔ)腎中藥可通過調(diào)節(jié)骨吸收與骨形成平衡，減少激素水平降低造成的骨高轉(zhuǎn)換，提高骨密度，減少骨量丟失[5-6]。補(bǔ)腎通絡(luò)方是我院名老中醫(yī)經(jīng)驗方，能改善骨質(zhì)疏松癥狀，提高骨密度。本研究主要通過觀察該方對去勢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠第四腰椎骨密度和骨微結(jié)構(gòu)，血清雌激素、卵泡刺激素、黃體生成素水平，以及子宮內(nèi)膜Wnt/β-catenin信號通路的影響，探討該方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，為其臨床運用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物4個月齡健康SPF級雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量270～300 g，購自湖北省實驗物研究中心，動物合格證編號：No.42000600017472，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。飼養(yǎng)室溫度控制于22～26℃，空氣濕度40%～50%，自由進(jìn)食飲水，12 h間隔照明，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實驗方案經(jīng)武漢市第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 補(bǔ)腎通絡(luò)方，方藥組成：淫羊藿15 g，杜仲10 g，川牛膝10 g，黃芪10 g，生地黃10 g，丹參10 g，雞血藤15 g。以上藥材均購于湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司。補(bǔ)腎通絡(luò)方按照常規(guī)方法煎煮，濃縮至生藥質(zhì)量濃度為1.44 g/mL，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｎ焖岽贫计ㄗ宰C號J20130009，規(guī)格：1 mg）購于法國Delpharm Lille SAS公司，制備成水溶液，質(zhì)量濃度為0.009mg/mL。雌二醇（E2）ELISA試劑盒（批號：C0102210102）、卵泡刺激素（FSH）ELISA試劑盒（批號：C0109460150）、黃體生成素（LH）ELISA試劑盒（批號：C0108460149）均購自華美公司；β-catenin試劑盒（批號：GB11015）、ERα試劑盒（批號：GB13205）均購自賽維爾公司。

1.3 主要儀器PL-203型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）公司]；BR4i型臺式離心機(jī)（法國JOUAN公司）；Epoch型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；Donatello型脫水機(jī)（意大利DIAPATH公司）；RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；uCT50型Micro-CT（瑞士SCANCO公司）。

1.4 造模與分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（8只）和造模組（32只）。參照文獻(xiàn)[7]造模，造模組大鼠禁食不禁水12 h，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，腹部去毛，逐層切開，進(jìn)入腹腔，切除雙側(cè)卵巢。假手術(shù)組大鼠切除卵巢周圍少量脂肪組織。術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素3 d。1周后連續(xù)5 d行陰道涂片檢查，無周期性變化表明去勢成功。全部造模成功后，將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、戊酸雌二醇組、補(bǔ)腎通絡(luò)方高劑量組、補(bǔ)腎通絡(luò)方低劑量組，每組8只。

1.5 實驗給藥 各組藥物劑量按照人鼠體表面積法[8]進(jìn)行折算。戊酸雌二醇組按0.09 mg/kg灌胃，補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組分別按14.4、7.2 g/kg灌胃。各藥物組按1 mL/100 g體質(zhì)量給予相應(yīng)的藥物灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。1次/d，連續(xù)給藥3個月。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 性激素 末次給藥后24 h，大鼠麻醉后心臟取血，3000 r/min離心10 min后分離得到血清。ELISA法檢測血清E2、FSH、LH水平。

1.6.2 micro-CT檢測 將各組大鼠完整的第四腰椎置于micro-CT系統(tǒng)上進(jìn)行掃描，應(yīng)用自帶軟件進(jìn)行骨密度測定和骨組織形態(tài)學(xué)計量分析，包括骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨表面積和骨體積的比例（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）。

1.6.3 子宮內(nèi)膜HE染色 將大鼠子宮投入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，酒精中脫水，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行組織切片，厚度為5 μm。常規(guī)蘇木素-伊紅染色、中性樹膠封片后，光鏡下觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化。

1.6.4 子宮內(nèi)膜ERα、β-catenin免疫組化檢測 分離出大鼠子宮內(nèi)膜，4%多聚甲醛溶液固定1 d，常規(guī)石蠟包埋、切片。室溫封閉30 min，加入稀釋好的一抗，4℃孵育過夜；PBS洗滌后滴加稀釋好的二抗，37℃孵育30 min。PBS清洗后，DAB避光顯色，鏡下觀察直到棕黃色陽性結(jié)果出現(xiàn)。水洗、蘇木素復(fù)染、脫水、中性樹膠封片。以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿著色為棕黃色定為陽性細(xì)胞。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件系統(tǒng)，每張切片選擇5個視野拍照，計算每組標(biāo)本切片中平均光密度值（mean optical density，MOD）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 27.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett’s T3法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清E2、FSH、LH水平比較 模型組大鼠血清E2含量低于假手術(shù)組（P＜0.05），F(xiàn)SH、LH水平高于假手術(shù)組（P<0.05），表明去勢成功。補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組和戊酸雌二醇組大鼠血清E2含量均明顯高于模型組（P<0.05），F(xiàn)SH、LH水平均明顯低于模型組（P<0.05）；補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組大鼠血清E2、FSH、LH水平與戊酸雌二醇組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠血清E2、FSH、LH水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清E2、FSH、LH水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量 E2（pg/mL) FSH（IU/L） LH（IU/L）假手術(shù)組 8 - 124.084±11.72118.550±7.8410.823±0.286模型組 8 - 98.086±7.283a 34.181±6.876a 1.666±0.602a補(bǔ)腎通絡(luò)方高劑量組8 14.40 g/kg 114.241±18.314b 20.658±7.437b 0.949±0.410b補(bǔ)腎通絡(luò)方低劑量組8 7.20 g/kg 112.569±13.982b 22.460±12.827b 0.983±0.369b戊酸雌二醇組 8 0.09 mg/kg 118.538±11.489b 19.030±7.620b 0.818±0.269b F 4.411 4.303 6.092 P 0.000 0.006 0.000

2.2 各組大鼠第四腰椎骨密度及骨微結(jié)構(gòu)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）均明顯降低（P＜0.05），骨表面積和骨體積的比例（BS/BV）、骨小梁分離度（Tb.Sp）均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組和戊酸雌二醇組大鼠骨密度、BV/TV均明顯升高（P＜0.05），Tb.Sp均明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎通絡(luò)方高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠Tb.N和Tb.Th均明顯升高（P<0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠第四腰椎骨密度及骨微結(jié)構(gòu)比較（±s）

表2 各組大鼠第四腰椎骨密度及骨微結(jié)構(gòu)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量 BV/TV BS/BV(1/mm) Tb.N(1/mm) Tb.Th(mm) Tb.Sp(mm) BMD(mg/cm3)假手術(shù)組 8 - 0.512±0.122 15.820±2.717 4.649±0.319 0.151±0.030 0.111±0.025 0.641±0.028模型組 8 - 0.339±0.036a 20.399±2.299a 3.599±0.529a 0.094±0.009a 0.157±0.02a 0.589±0.023a補(bǔ)腎通絡(luò)方高劑量組 8 14.40 g/kg 0.493±0.122b 16.618±3.329 4.224±0.289b 0.142±0.029b 0.117±0.032b 0.629±0.007b補(bǔ)腎通絡(luò)方低劑量組 8 7.20 g/kg 0.459±0.097b 18.024±3.989 4.092±0.273 0.115±0.022 0.123±0.024b 0.626±0.026b戊酸雌二醇組 8 0.09 mg/kg 0.510±0.158b 16.510±3.761 4.303±0.413b 0.141±0.035b 0.116±0.035b 0.635±0.005b F 1.983 1.539 5.107 3.915 3.964 4.865 P 0.136 0.229 0.005 0.017 0.016 0.007

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞排列整齊，腺體上皮呈高柱狀，腺腔較大；模型組大鼠子宮內(nèi)膜變薄，腺體稀少，部分呈囊性；戊酸雌二醇組大鼠子宮內(nèi)膜增厚，少數(shù)腺體扭曲，腺上皮核大呈卵圓形，間質(zhì)細(xì)胞較致密；補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組大鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞梭形，較致密，腺上皮細(xì)胞呈低柱狀，且隨劑量增加，腺體數(shù)量明顯增加。（見圖1）

圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化比較（HE，×100）

圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜β-catenin表達(dá)（免疫組化，×400）

2.4 各組大鼠子宮內(nèi)膜ERα和β-catenin蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組和戊酸雌二醇組大鼠子宮內(nèi)膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組大鼠子宮內(nèi)膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin表達(dá)水平與戊酸雌二醇組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表3、圖2～3）

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜ERα和β-catenin蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜ERα和β-catenin蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量 ERα β-catenin假手術(shù)組 8 - 0.092±0.015 0.089±0.01模型組 8 - 0.062±0.015a 0.062±0.012a補(bǔ)腎通絡(luò)方高劑量組 8 14.40 g/kg 0.084±0.011b 0.084±0.011b補(bǔ)腎通絡(luò)方低劑量組 8 7.20 g/kg 0.081±0.014b 0.079±0.017b戊酸雌二醇組 8 0.09 mg/kg 0.091±0.014b 0.086±0.015b F 6.042 5.166 P 0.000 0.002

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜ERα表達(dá)（免疫組化，×400）

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)學(xué)中“骨痹”“骨痿”“骨枯”等范疇[9-10]?！端貑枴ゐ粽撈吩唬骸澳I主身之骨髓?！薄端貑枴つ嬲{(diào)論篇》曰：“腎者水也，而生于骨。腎不生則髓不能滿，故寒甚至骨也?！蹦I精充足則骨髓生化有源，骨骼得以滋養(yǎng)而強(qiáng)勁有力；腎精虧虛則骨髓生化無源，骨骼失養(yǎng)而痿弱無力。婦女絕經(jīng)后，腎氣漸衰，天癸漸竭，骨髓化生無源，致髓枯骨脆、筋骨不堅；五臟虛損，氣虛血瘀，新血生成受阻，骨髓化源不足，骨骼失養(yǎng)，骨質(zhì)流失[11-12]。腎虛為本，血瘀為標(biāo)，臨床治療在補(bǔ)腎益精同時兼顧益氣活血。補(bǔ)腎通絡(luò)方是我科治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)驗方，臨床效果明顯。方中淫羊藿、杜仲補(bǔ)腎助陽，共為君藥；川牛膝活血化瘀、通利關(guān)節(jié)，雞血藤、丹參活血通絡(luò)，共為臣藥；生地黃養(yǎng)陰生精，黃芪補(bǔ)氣，共為佐藥。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎通絡(luò)、活血壯骨之功。

Micro-CT能夠直觀、立體地從空間結(jié)構(gòu)上評價骨小梁微結(jié)構(gòu)，指導(dǎo)臨床用藥和預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生。本實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨密度明顯降低（P＜0.05），說明骨質(zhì)疏松癥模型制備成功。補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組大鼠骨密度明顯高于模型組（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度均降低，骨小梁分離度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組比較，補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組和戊酸雌二醇組大鼠骨體積分?jǐn)?shù)明顯升高（P＜0.05），骨小梁分離度明顯降低（P＜0.05）；補(bǔ)腎通絡(luò)方高劑量組和戊酸雌二醇組骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度均明顯高于模型組（P＜0.05），骨微結(jié)構(gòu)明顯改善。

絕經(jīng)后由于卵巢功能減退，E2含量明顯降低，在生殖軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)下，腺垂體分泌的FSH和LH濃度升高[13]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清E2含量降低、FSH和LH水平升高（P＜0.05），表明去勢成功。補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組能升高去卵巢大鼠的血清E2含量，降低FSH和LH水平，與戊酸雌二醇組相比無明顯差異。同時，HE染色顯示，模型組大鼠子宮內(nèi)膜變薄，腺體稀少。藥物干預(yù)后，子宮內(nèi)膜增厚，腺體稍增加，補(bǔ)腎通絡(luò)方高、低劑量組和戊酸雌二醇組差異不明顯。說明補(bǔ)腎通絡(luò)方具有雌激素樣作用。

雌激素的生物學(xué)效應(yīng)是通過和雌激素受體（ER）結(jié)合來發(fā)揮的，其作用與ER的類型和數(shù)量有關(guān)[14]。雌激素受體有ERα和ERβ兩種，其中ERα主要分布在子宮和乳腺[15]。ABBOTT M J等[16]研究發(fā)現(xiàn)ERα在女性絕經(jīng)前、后子宮黏膜層、肌層、漿膜層所有細(xì)胞的細(xì)胞漿中均有表達(dá)，絕經(jīng)后水平較絕經(jīng)前降低。ERα和Wnt/β-catenin信號通路在大鼠BMSCs成骨分化過程中具有重要意義[17-18]。Wnt信號刺激后，β-catenin積聚并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子相結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，使細(xì)胞活化增強(qiáng)，加強(qiáng)骨形成[19-20]。本研究免疫組化結(jié)果顯示去勢大鼠子宮內(nèi)膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin蛋白表達(dá)降低，經(jīng)補(bǔ)腎通絡(luò)方干預(yù)后，ERα和β-catenin表達(dá)均增強(qiáng)，與假手術(shù)組無明顯差異。

綜上所述，補(bǔ)腎通絡(luò)方能改善去勢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的骨量流失，具有雌激素樣作用，可能是通過上調(diào)去勢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠子宮內(nèi)膜ERα表達(dá)，激活Wnt/β-catenin信號通路而介導(dǎo)的。下一步研究還需要擴(kuò)大樣本量和體外實驗來證實藥物的有效性與安全性。