陳磊，畢秀芳，焦文成，邢亞閣，車振明

(1.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610039；2.宜賓西華大學(xué)研究院，四川 宜賓 644000)

生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)是一種藥食兩用的草本植物，在熱帶、亞熱帶地區(qū)被廣泛種植，在中國已有5000多年的生產(chǎn)歷史[1]。我國生姜的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展較為穩(wěn)定，常年種植面積約為375萬畝，年產(chǎn)量可達(dá)1000萬噸，是生姜年產(chǎn)量最多的國家[2-3]。生姜具有獨(dú)特的香氣以及一些藥用功效，近年來，研究人員對生姜的研究主要集中在生姜生物活性成分分析、加工與應(yīng)用以及風(fēng)味化學(xué)等方面。已有研究表明，生姜及其提取物含有多酚類化合物[4-7]，具有抗氧化、抗炎、降血脂等生物活性，其中一些還具有潛在的癌癥預(yù)防活性，對人體具有極其重要的生理保健功能[8-13]。Gunathilake等[14]報(bào)道了一種由富含姜辣素的提取物組成的功能性飲料，在自發(fā)性高血壓大鼠中表現(xiàn)出降低膽固醇的作用。Mattje等[15]研究發(fā)現(xiàn)超臨界CO2生姜提取物能有效控制魚肉中的脂質(zhì)氧化，有可能取代人工合成的抗氧化劑。在生姜及其制品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究方面，付云云等[16]研究發(fā)現(xiàn)四川新鮮白口姜在沙土貯藏過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類會明顯減少，并且在貯藏過程中大多數(shù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量會降低。

泡菜是我國傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的典型代表之一，具有健胃理氣、抑菌、減肥、預(yù)防心腦血管疾病等功效[17-19]。香氣風(fēng)味是泡菜中感官質(zhì)量的重要指標(biāo)，會影響消費(fèi)者的接受度和滿意度。近年來，研究學(xué)者利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)對泡菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了許多研究，他們認(rèn)為揮發(fā)性風(fēng)味因其原料種類不同而不同[20]。汪莉莎等[21]采用SPME-GC-MS技術(shù)分析出芋頭葉柄泡菜中主要揮發(fā)性物質(zhì)有4-己烯酸、苯甲醛、甲酸異戊酯等。徐丹萍等[22]采用SPME-GC-MS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)酯類是泡蘿卜、泡芥菜和泡甘藍(lán)中的特征揮發(fā)性成分，醛類、萜類分別是泡黃瓜、泡芹菜的特征揮發(fā)性成分。Rao等[23]首次在泡蘿卜中發(fā)現(xiàn)了DL-異冰片酯、3,5-二甲基苯甲醛、2-氨基-5-甲基苯甲酸和2-羥基十四酸的存在。

泡姜是以嫩生姜為原料發(fā)酵制得的一種具有獨(dú)特風(fēng)味的泡菜。目前對泡姜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究較少，因此，本研究擬用電子鼻技術(shù)、頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)以及香氣活性值(OAV)，對市售不同品牌泡姜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，對泡姜實(shí)際生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種不同品牌泡姜：“老母水”牌泡姜、“龍泉山”牌泡姜、“蜀濃湘”牌泡姜、“味星”牌泡姜、“盈棚”牌泡姜、“真的老”牌泡姜，均購于附近超市，分別編號為PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5和PJ6。

2-甲基-3-庚酮：純度>95%(GC)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；MP-5H型超級恒溫槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense 公司；2020NX型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；57330-U型固相微萃取手柄、57318型 75 μm CAR/PDMS 固相微萃取頭 美國Supelco公司；研缽。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME條件

參照An等的方法，稱取1 g已研磨成勻漿的泡姜樣品于15 mL頂空萃取瓶中，加入3 mL飽和食鹽水，同時(shí)加入0.1 mL 0.816 mg/mL的2-甲基-3-庚酮溶液作為內(nèi)標(biāo)物，將頂空萃取瓶密封并保存在45 ℃恒溫水浴鍋中平衡20 min，然后將老化后的PDMS萃取頭在45 ℃下暴露于頂部空間30 min，使萃取頭能夠完全富集樣品的揮發(fā)性成分。隨后迅速將吸附后的萃取頭取出并插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，在250 ℃下解吸5 min，同時(shí)啟動(dòng)氣相色譜儀采集數(shù)據(jù)。

1.3.2 GC-MS條件

1.3.2.1 GC 條件

采用DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(32 m×0.25 mm，0.25 μm)對泡姜樣品進(jìn)行分析，采用不分流模式，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，載氣流速為1 mL/min，升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，保持1 min 后，以4 ℃/min的升溫速度升至135 ℃，不保留；然后以0.5 ℃/min的速度升至140 ℃，不保留;再以15 ℃/min的速度升至230 ℃，保持3 min，最后回到50 ℃。

1.3.2.2 MS 條件

采用全掃描模式，在電子碰撞離子源(EI)的電離模式下以70 eV記錄，并在40～550 amu的質(zhì)量范圍內(nèi)以0.5 scan/s進(jìn)行掃描。電子碰撞離子源(EI)溫度為220 ℃。

1.3.2.3 定性定量方法

通過質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)信息庫NIST 17.Lib進(jìn)行檢索比對，選取相似度大于90的物質(zhì)進(jìn)行分析定性；采用半定量法，選取2-甲基-3-庚酮為內(nèi)標(biāo)物，對泡姜樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行定量，每組重復(fù)3次，取平均值。質(zhì)量濃度Ci(mg/g)計(jì)算公式如下：

式中：Ai為揮發(fā)性物質(zhì)峰面積，A0為內(nèi)標(biāo)物峰面積，C0為內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)，V0為內(nèi)標(biāo)溶液體積(mL)，mi為樣品質(zhì)量(g)。

1.3.3 OAV法分析

查閱揮發(fā)性成分在水中的閾值，根據(jù)每種揮發(fā)性成分的質(zhì)量濃度與閾值的比值計(jì)算其OAV，以此評價(jià)該揮發(fā)性成分對樣品整體揮發(fā)性風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度[24-25]。OAV<1說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味無實(shí)際影響；OAV>1說明該物質(zhì)可能對總體風(fēng)味有直接影響；且在一定范圍內(nèi)，OAV越大說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)越大[26-27]。OAV 計(jì)算公式如下：

式中：Ci為揮發(fā)性成分的質(zhì)量濃度(mg/g)，OTi為揮發(fā)性成分在水中的閾值(mg/g)。

1.3.4 電子鼻分析

PEN3型電子鼻由10種金屬氧化物氣體傳感器陣列組成。參照陳慧敏等[28]的方法，并做適當(dāng)修改。稱取5 g泡姜?jiǎng)驖{樣品于30 mL樣品瓶中，溫水浴密封靜置10 min，隨后插入電子鼻探頭吸取頂端氣體，測定揮發(fā)性物質(zhì)。電子鼻掃描參數(shù)：采樣間隔時(shí)間1 s，空氣沖洗時(shí)間120 s，調(diào)零時(shí)間5 s，預(yù)采樣時(shí)間5 s，采集時(shí)間120 s，載氣流速300 mL/min，進(jìn)樣流速300 mL/min，金屬傳感器，90 s后基本穩(wěn)定，選取92，93，94 s為響應(yīng)值，每個(gè)樣品重復(fù)操作6次。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用IBM SPSS Statistics 25軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用OriginPro 9.0 軟件進(jìn)行繪圖，運(yùn)用電子鼻自帶WinMuster軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和線性判別分析(LDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品牌泡姜電子鼻PCA和LDA分析

采用PCA方法對電子鼻數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，樣品的揮發(fā)性成分聚集成2個(gè)主成分，可以清楚地看出樣品間的差異[29]。由圖1中a可知，6種品牌泡姜經(jīng)PCA分析，第1主成分的區(qū)分貢獻(xiàn)率達(dá)95.89%，第2主成分的區(qū)分貢獻(xiàn)率達(dá)2.45%，2個(gè)主成分的累計(jì)區(qū)分貢獻(xiàn)率達(dá)98.34%。累計(jì)貢獻(xiàn)率越高，主成分對樣品原始指標(biāo)信息反映越好[30]。因此，本研究中，這2個(gè)主成分可代表泡姜中揮發(fā)性成分的主要特征。PJ2、PJ5、PJ63種品牌泡姜產(chǎn)品之間沒有重疊，表明其在揮發(fā)性物質(zhì)上有一定差異；而其余3種均有部分重疊，表明其在揮發(fā)性物質(zhì)上有相似之處，這也說明PCA法分析不能對6種樣品進(jìn)行獨(dú)立區(qū)分。對數(shù)據(jù)進(jìn)行LDA分析，可以有效地抽取樣品中揮發(fā)性成分信息，使類別區(qū)分達(dá)到更好的分離效果。由圖1中b可知，經(jīng)LDA分析，主成分1和主成分2的區(qū)分貢獻(xiàn)率分別為66.28%和13.74%，總貢獻(xiàn)率為80.02%，但仍有3種泡姜樣品有少量重疊，說明LDA法分析也不能對6種樣品進(jìn)行獨(dú)立區(qū)分。結(jié)果表明，PCA和LDA法分析均能對其中部分產(chǎn)品有較好的區(qū)分，但不能達(dá)到對其完全獨(dú)立區(qū)分，趙江欣等[31]研究自然發(fā)酵和直投式發(fā)酵蘿卜的風(fēng)味時(shí)，也發(fā)現(xiàn)PCA和LDA均不能完全區(qū)分同種發(fā)酵方式的泡蘿卜。因此，需要通過HS-SPME-GC-MS對不同品牌泡姜的具體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)一步探究。

圖1 電子鼻PCA分析圖(a)和LDA分析圖(b)

2.2 不同品牌泡姜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS分析

續(xù) 表

由表1可知，6種品牌泡姜樣品共鑒定出72種揮發(fā)性物質(zhì)，包括40種烯烴類、13種醇類、5種醛類、8種酯類和6種酮類物質(zhì)。其中烯烴類物質(zhì)種類最多，包括姜烯、α-法呢烯、β-倍半水芹烯等；醇類物質(zhì)次之，主要有桉葉油醇、α-松油醇、香葉醇等，說明烯烴類和醇類是泡姜中的主要揮發(fā)性物質(zhì)。采用半定量法進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，6種樣品共有的揮發(fā)性物質(zhì)在含量上存在顯著差異性(P<0.05)，比較同種品牌樣品的不同類物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，姜烯、桉葉油醇、香葉醛和乙酸香葉酯4種物質(zhì)在同類物質(zhì)中含量最高，其中姜烯在整體揮發(fā)性物質(zhì)中含量也最高，分別在PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5和PJ6 6種泡姜揮發(fā)性物質(zhì)中占46.29%、44.65%、43.69%、41.08%、41.62%、43.35%，顯著高于其他揮發(fā)性物質(zhì)(P<0.05)。比較不同品牌樣品同類物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，莰烯、月桂烯、(+)-環(huán)苜蓿烯、α-蒎烯、(+)-7-表-倍半萜烯、反式-β-金合歡烯、香樹烯、α-姜黃烯、桉葉油醇、2-茨醇、α-松油醇、β-桉葉醇、乙酸龍腦酯在PJ2泡姜中的含量顯著高于其他品牌(P<0.05)，而其余物質(zhì)在不同品牌中未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)。王強(qiáng)偉等[32]在新鮮生姜中鑒定出主要揮發(fā)性成分有姜烯、桉葉油醇、香葉醛等。Huang等[33]也從新鮮及干燥生姜中鑒定出其主要揮發(fā)性化合物包括姜烯和香葉醛。本研究中姜烯、桉葉油醇和香葉醛含量較高，可能與原料本身含量較高有關(guān)。同時(shí)，由于發(fā)酵過程是動(dòng)態(tài)變化狀態(tài)，發(fā)酵過程中某些組分會增加或減少，從而影響最終產(chǎn)品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

表1 不同品牌泡姜揮發(fā)性物質(zhì)HS-SPME-GC-MS 鑒定結(jié)果

由圖2中a可知，從種類數(shù)量上看，PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5、PJ6分別共鑒定出48，50，42，50，55，34種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并且6種樣品烯烴類物質(zhì)數(shù)量均顯著高于其他類物質(zhì)，醇類物質(zhì)次之，是重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。由圖2中b可知，從相對含量上看，同一品牌泡姜樣品不同種類物質(zhì)之間，烯烴類物質(zhì)相對含量均顯著高于其他4種物質(zhì)(P<0.05)，相對含量均高達(dá)80%以上，在整個(gè)分類物質(zhì)中占據(jù)較大比重。但在同種類物質(zhì)不同品牌泡姜樣品之間，僅PJ2中烯烴類物質(zhì)相對含量顯著高于其他5種品牌泡姜(P<0.05)，相對含量高達(dá)93.95%。不同品牌泡姜樣品在其余4種物質(zhì)中相對含量上也表現(xiàn)出一定的差異性，PJ4中醇類物質(zhì)相對含量為4.61%，PJ5中醛類物質(zhì)相對含量為6.97%，PJ6中酯類物質(zhì)相對含量為5.46%，分別顯著高于其他品牌(P<0.05)。

圖2 不同品牌泡姜中揮發(fā)性物質(zhì)種類(a)及相對含量(b)

結(jié)果表明，不同品牌泡姜樣品揮發(fā)性物質(zhì)在分類上相似，但是在物質(zhì)含量和數(shù)量上存在一定的差異。在前人研究中，羅松明[34]研究乳酸菌發(fā)酵泡仔姜時(shí)，對揮發(fā)性物質(zhì)也做出了相似的分類，并且發(fā)現(xiàn)烯烴類物質(zhì)種類最多。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，不同產(chǎn)地生姜揮發(fā)性物質(zhì)種類之間也存在差異[35-36]，說明不同品牌泡姜揮發(fā)性物質(zhì)種類可能受到原料產(chǎn)地的影響。不同的發(fā)酵方式也會對泡菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生影響，夏季等[37]研究發(fā)現(xiàn)，與自然發(fā)酵相比，純種發(fā)酵使香菇泡菜中醇類和醛類物質(zhì)相對含量分別增加了5.9%和1.0%。賈潛等[38]研究發(fā)現(xiàn)，與未處理組相比，65 ℃和85 ℃巴氏殺菌5 min會使槽姜中烯烴類和醇類物質(zhì)含量和種類增加。王雙[39]研究發(fā)現(xiàn)，輻照殺菌與熱殺菌會導(dǎo)致泡豇豆中酯類物質(zhì)含量降低。綜上所述，不同品牌泡姜產(chǎn)品之間各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)存在差異可能與原料、發(fā)酵方式、殺菌條件等因素有關(guān)。

2.3 不同品牌泡姜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的OAV分析

盡管通過GC-MS技術(shù)在泡姜中鑒定出了較多揮發(fā)性物質(zhì)，但研究表明，僅有少部分物質(zhì)能在呈現(xiàn)特征風(fēng)味中作出重要貢獻(xiàn)，賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味屬性。香氣活性值(OAV)可作為評價(jià)揮發(fā)性物質(zhì)在食品基質(zhì)中貢獻(xiàn)大小的更精準(zhǔn)的標(biāo)尺[40]，因此，結(jié)合OAV法分析對6種樣品的特征風(fēng)味物質(zhì)作進(jìn)一步判斷。

由表2可知，通過OAV法分析，6種泡姜中OAV>1的特征揮發(fā)性物質(zhì)共有36種，包括15種烯烴類、7種醇類、4種醛類、6種酯類和4種酮類物質(zhì)。其中PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5和PJ6中分別含有21，24，18，26，30，14種，其中，大根香葉烯B是PJ1中獨(dú)有的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；莰烯、α-松油醇、樟腦是PJ2中獨(dú)有的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；β-蒎烯、正辛醛是PJ4中獨(dú)有的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；δ-欖香烯、2-庚醇香茅醇、7-甲基-3-亞甲基-6-辛烯醛、乙酰丙酮是PJ5中獨(dú)有的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。月桂烯、α-蒎烯、(+)-β-芹子烯、桉葉油醇、2-茨醇、香葉醇、檸檬醛、香葉醛、乙酸龍腦酯和乙酸香葉酯是6種泡姜中共有的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，說明其是形成泡姜獨(dú)特風(fēng)味的重要物質(zhì)。烯烴類物質(zhì)廣泛存在于植物體內(nèi)，閾值低，具有特殊氣味，但有些含量較高的烯烴類物質(zhì)在本研究中并沒有確定為特征揮發(fā)性物質(zhì)，可能與鑒定方法有關(guān)，還需要利用其他鑒定方法進(jìn)行進(jìn)一步確定。醛類和酯類一般會呈現(xiàn)出辛辣味，而醇類物質(zhì)對酯類、醛類等成分的產(chǎn)生不可或缺。另外，Luo等采用氣相色譜-嗅感與香氣稀釋分析(AEDA)相結(jié)合鑒定發(fā)現(xiàn)檸檬醛、乙酸香葉酯的稀釋因子(FD)達(dá)到最高(FD=200∶1)，被確定為泡姜中的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)。本研究采用OAV法鑒定的結(jié)果與Luo等的研究結(jié)果有相同之處。

表2 不同品牌泡姜揮發(fā)性物質(zhì)的OAV分析

綜上所述，利用OAV法能對泡姜中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行有效鑒定，并且得到不同品牌泡姜中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有差異性。

3 結(jié)論

電子鼻技術(shù)PCA和LDA分析僅能對部分產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味進(jìn)行較好區(qū)分，而不能對所有產(chǎn)品進(jìn)行完全區(qū)分。通過GC-MS從6種品牌泡姜中共鑒定出72種揮發(fā)性物質(zhì)，包括40種烯烴類、13種醇類、5種醛類、8種酯類和6種酮類物質(zhì)。6種樣品中烯烴類和醇類物質(zhì)的數(shù)量和相對含量均遠(yuǎn)高于其他種類，其中姜烯是所有揮發(fā)性物質(zhì)中含量最高的物質(zhì)，在PJ1泡姜揮發(fā)性物質(zhì)中最高占比達(dá)到46.29%。6種品牌泡姜中OAV>1的物質(zhì)共有36種，包括15種烯烴類、7種醇類、4種醛類、6種酯類和4種酮類物質(zhì)。其中，月桂烯、α-蒎烯、(+)-β-芹子烯、桉葉油醇、2-茨醇、香葉醇、檸檬醛、香葉醛、乙酸龍腦酯和乙酸香葉酯是6種泡姜中共有的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。結(jié)果表明，不同品牌泡姜在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)方面既存在共性，也存在差異性。由于泡姜的發(fā)酵過程處于動(dòng)態(tài)變化，加上原料品種和發(fā)酵工藝的差異，最終形成了具有不同獨(dú)特風(fēng)味的泡姜產(chǎn)品。