郭軒彤，馬麗紅

心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段?！吨袊难芙】蹬c疾病報告2019概要》流行病學數(shù)據(jù)顯示，心力衰竭已影響全球約4 000萬人，我國心力衰竭現(xiàn)患病人數(shù)約為1370萬例，較2000年增長44%，再住院率約為69%，住院死亡率約為4%，其高患病率、高住院率和高死亡率給我國經濟帶來沉重負擔，已成為重要的公共衛(wèi)生問題[1-2]。中醫(yī)藥在減少心力衰竭終點事件、改善臨床癥狀和預后、提高生活質量、降低死亡率方面具有多途徑、多靶點的治療特點和優(yōu)勢。臨床研究顯示，中藥可顯著降低慢性心力衰竭病人心血管不良事件發(fā)生率，中藥的多種活性成分通過抗氧化、抗炎、改善能量代謝等途徑拮抗心力衰竭發(fā)生發(fā)展[3]。

心復力顆粒是北京名醫(yī)丁鳴九治療慢性心力衰竭的經驗方，主要由人參、黃芪、黑順片、丹參等組成，作為內部制劑，在中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院臨床應用50余年，療效顯著。前期研究發(fā)現(xiàn)，心復力顆?？筛纳坡孕牧λソ卟∪伺R床癥狀，提高左室射血分數(shù)，降低血漿腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)水平；通過調節(jié)能量代謝、抑制心肌細胞凋亡和心肌纖維化等機制發(fā)揮心力衰竭心肌保護作用[4-5]。由于心復力顆粒成分多樣，活性成分復雜，藥理作用具有多靶點、多途徑、多層次的特點，因而常規(guī)基礎研究難以全面揭示心復力顆粒的作用機制，極大阻礙了藥物優(yōu)化和臨床應用發(fā)展。

網絡藥理學是基于藥物和疾病的網絡數(shù)據(jù)庫檢索、高通量組學數(shù)據(jù)分析和計算機虛擬計算的新興藥理學方法，通過構建并分析生物網絡實現(xiàn)對藥物與疾病交叉作用靶點的初步預測，廣泛用于中藥的基礎機制研究。分子對接是以空間結構為基礎，依據(jù)配體與受體作用“鎖-鑰原理”，預測分子相互作用的一種模擬技術。本研究通過網絡藥理學方法，篩選得到心復力顆粒治療心力衰竭的活性成分和潛在作用靶點，并結合基因本體(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析結果，初步探討心復力顆粒治療心力衰竭的潛在分子作用機制。利用分子對接技術，進一步模擬預測心復力顆粒潛在藥效成分與心力衰竭作用靶點之間的結合模式與強度，從而為心復力顆粒在心力衰竭中的治療優(yōu)化和研究提供線索和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫、軟件和網站 數(shù)據(jù)庫包括TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetpredic tion.ch/)、GeneCards(http://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、STRING(https://stringdb.org/)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)、PDB(http://www.rcsb.org/)。使用軟件包括SAS 9.4(http://www.sas.com/)、Cytoscape 3.7.0(https://cytoscape.org/)、AutoDock Tools 1.5.6(http://autodock.scripps.edu/resources/adt)、PyMol(https://pymol.org/)。使用在線網站包括韋恩在線繪制(http://jvenn.toulouse.inra.fr/)、Bioinformatics (http://www.bioinformatics.com.cn/)。

1.2 心復力顆粒藥效成分及作用靶點的篩選 以人參、黑順片、茯苓、丹參、檳榔、黃芪、三棱、木瓜和葶藶子為心復力顆粒主要成分，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲取所有化學成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選標準，構建心復力顆粒藥效成分數(shù)據(jù)庫。利用PubChem數(shù)據(jù)庫獲取藥效成分的Canonical SMILES序列，并在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中以可能性分值>0.1、居前15位作為篩選標準，得到心復力顆粒藥效成分作用靶點，構建心復力顆粒藥效成分靶點數(shù)據(jù)庫，同時檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫中靶點信息，對數(shù)據(jù)庫進行查漏補充。

1.3 心力衰竭相關作用靶點的篩選 以“heart failure”“congestive heart failure”“cardiac failure”“cardiac insufficiency”“coronary failure”為心力衰竭關鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫及DrugBank數(shù)據(jù)庫中檢索心力衰竭相關作用靶點，以相關性分數(shù)>30為篩選標準，建立心力衰竭作用靶點數(shù)據(jù)庫。

1.4 心復力顆粒與心力衰竭相互作用網絡的構建 使用SAS 9.4軟件對心復力顆粒藥效成分靶點數(shù)據(jù)庫和心力衰竭作用靶點數(shù)據(jù)庫進行合并分析，導出交叉共同靶點，建立心復力顆粒治療心力衰竭靶點數(shù)據(jù)庫。利用韋恩圖在線網站繪制心復力顆粒治療心力衰竭潛在靶點韋恩圖。將心復力顆粒治療心力衰竭靶點數(shù)據(jù)庫導入STRING數(shù)據(jù)庫，得到靶點互作關系圖，構建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網絡模型。使用Cytoscape 3.7.0軟件對網絡拓撲學參數(shù)進行分析，以Degree值居前10位為篩選標準，構建心復力顆粒治療心力衰竭關鍵靶點數(shù)據(jù)庫。

1.5 靶點通路富集與可視化分析 將心復力顆粒治療心力衰竭的潛在靶點數(shù)據(jù)庫導入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行GO、KEGG富集分析，得到心復力顆粒治療心力衰竭的潛在理論上的生物學過程與代謝通路。將結果上傳至Bioinformatics網站，繪制高級氣泡圖及基因富集分析柱狀圖，對結果進行可視化分析。

1.6 分子對接分析 結合心復力顆粒、心力衰竭關鍵靶點數(shù)據(jù)庫與GO、KEGG富集分析結果，通過PubChem數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫下載得到擬分析的心復力顆粒藥效成分和心力衰竭作用靶點3D晶體結構。使用PyMol軟件對3D結構進行去水、加氫等預處理。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件進行分子對接分析，獲取藥效成分與靶點結合的自由能和構象數(shù)據(jù)，并在PyMol軟件中進行可視化分析。

2 結 果

2.1 心復力顆粒成分及靶點 以OB≥30%，DL≥0.18為篩選標準，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到人參藥效成分22種、黑順片藥效成分21種、茯苓藥效成分15種、丹參藥效成分65種、檳榔藥效成分8種、黃芪藥效成分20種、三棱藥效成分5種、木瓜藥效成分4種、葶藶子藥效成分22種，經合并整理后，獲得心復力顆粒藥效成分共160種。詳見表1。將心復力顆粒藥效成分導入PubChem和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，獲得心復力顆粒藥效成分作用靶點575個。

表1 心復力顆粒藥效成分基本信息

2.2 心復力顆粒治療心力衰竭潛在靶點 檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫和DrugBank數(shù)據(jù)庫，獲取心力衰竭作用靶點355個。使用SAS 9.4軟件對心復力顆粒藥效成分作用靶點與心力衰竭作用靶點進行重復性分析，提取到共同作用靶點62個，即心復力顆粒治療心力衰竭靶點。將心復力顆粒治療心力衰竭靶點與心復力顆粒內單藥的藥效成分作用靶點進行比對分析，獲得單藥藥效成分治療心力衰竭的潛在靶點114個，其中，人參潛在靶點27個、黑順片潛在靶點12個、茯苓潛在靶點7個、丹參潛在靶點39個、檳榔潛在靶點9個、黃芪潛在靶點46個、三棱潛在靶點19個、木瓜潛在靶點36個、葶藶子潛在靶點45個。詳見圖1、圖2。

圖1 心復力顆粒藥效成分作用靶點-心力衰竭靶點Venn圖

圖2 心復力顆粒藥效成分作用靶點-心力衰竭靶點網絡圖

2.3 心復力顆粒治療心力衰竭的潛在藥效成分-作用靶點PPI網絡 將心復力顆粒治療心力衰竭靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，得到心復力顆粒治療心力衰竭PPI網絡。結果顯示：PPI網絡共61個節(jié)點、656條邊，高于同等數(shù)量下隨機蛋白互作關系度，提示心復力顆粒治療心力衰竭靶點蛋白之間存在高度生物相互作用關系，心復力顆粒治療心力衰竭有明確機制可循，詳見圖3。將PPI網絡導入Cytoscape 3.7.0軟件，通過“Network Analyzer”進行分析，發(fā)現(xiàn)網絡內節(jié)點59個、邊656條，最短路徑3 422條，網絡中心度0.406，平均鄰居節(jié)點數(shù)22.237個，聚類系數(shù)0.716，無孤立蛋白節(jié)點，進一步證實心復力顆粒治療心力衰竭PPI網絡靶點相互作用緊密，心復力顆粒治療心力衰竭存在確切的作用機制。導出富集組織為心臟且關聯(lián)強度Degree值居前10位的靶點，構建心復力顆粒治療心力衰竭關鍵靶點數(shù)據(jù)庫，包括：內皮素1(endothelin-1，EDN1)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3，NOS3)、趨化因子2(CCL2)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤蛋白p53(tumor protein 53，TP53)、血管細胞黏附因子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1)、纖溶酶原激活物抑制因子1(serpin family E member 1，SERPINE1)、小窩蛋白(caveolin 1，CAV1)、選擇素-E(selectin E，SELE)。詳見表2。

圖3 心復力顆粒治療心力衰竭作用靶點PPI網絡

表2 心復力顆粒治療心力衰竭關鍵靶點基本信息

2.4 靶點通路富集分析與可視化分析 提交心復力顆粒治療心力衰竭作用靶點至DAVID數(shù)據(jù)庫，進行基因富集分析，包括KEGG通路、GO的生物過程(biological process，BP)、細胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，以富集值為篩選標準，取前20位的分析結果導入Bioinformatics平臺，繪制氣泡圖及基因富集分析柱狀圖進行可視化分析。詳見圖4、圖5。

圖4 心復力顆粒治療心力衰竭KEGG通路分析結果

圖5 心復力顆粒治療心力衰竭GO富集分析結果

KEGG通路富集分析結果顯示，共94條代謝通路可能與心復力顆粒治療心力衰竭的分子機制相關，主要包括信號傳遞、免疫系統(tǒng)、能量代謝、血管新生，內分泌激素等。前期研究已初步證實心復力顆粒通過促進改善心肌能量代謝和血管新生，調節(jié)氧化應激等機制發(fā)揮心力衰竭心肌保護作用。進一步研究對缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路、核苷酸寡聚化結構域(NOD)樣受體(NOD-like receptor，NLRs)信號通路、血管內皮生長因子(VEGF)信號通路等及關鍵作用靶點VEGFA、EDN1、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、蛋白激酶Cα(PRKCA)、NOS3和腎素(REN)在心復力顆粒治療心力衰竭的作用機制進行深入探討。

GO功能富集分析結果顯示，共399種潛在分子生物功能與心復力顆粒治療心力衰竭的作用相關，主要包括平滑肌細胞增殖、去甲腎上腺素作用下心臟收縮與心率調節(jié)、細胞凋亡及內皮素相關動脈血壓調節(jié)等321條生物過程；軸突、細胞骨架、RNA轉錄復合物和細胞表面等31處與細胞成分相關的功能；NO合酶活性、腎上腺素能受體活性、去甲腎上腺素結合及血管內皮生長因子受體結合等47種分子功能。以上各機制對心復力顆粒治療心力衰竭的作用機制進行了初步概括與揭示。

2.5 分子對接分析 EDN1是血管平滑肌和心肌細胞合成并分泌的具有強烈縮血管作用的活性肽，在心力衰竭中表達升高，通過活化磷脂酶C促進血管平滑肌細胞收縮，升高血壓，并可激活蛋白激酶C引起心肌細胞肥厚和纖維化，影響心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。多項臨床研究顯示，血漿EDN1濃度與心力衰竭病人短期院內臨床終點事件和住院死亡率呈正相關，拮抗EDN1的治療策略可使病人獲益[6-8]。VEGFA是血管新生的重要作用因子，可促進缺血心肌內分支血管生成，改善冠狀動脈血流灌注和心肌氧供，通過磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路抑制心肌細胞凋亡[9]。心復力顆粒治療心力衰竭PPI網絡拓撲學參數(shù)分析結果顯示，EDN1與VEGFA是心復力顆粒治療心力衰竭的關鍵靶點，關聯(lián)Degree值居首位。GO、KEGG富集分析提示，HIF-1信號通路是心復力顆粒發(fā)揮心力衰竭心肌保護作用的機制中重要潛在通路，而HIF-1信號通路激活引起下游VEGF通路與EDN1通路活化，促進血管新生與血管張力調節(jié)。課題組前期研究結果初步證實，心復力顆粒可降低心力衰竭大鼠心肌內EDN1含量，改善心肌缺氧與細胞凋亡[5]。因此，初步以VEGF信號通路和EDN1信號通路作為本研究切入點，探討心復力顆粒是否通過結合EDN1降低其循環(huán)含量，拮抗不利作用，同時選取VEGFR和EDNR為心復力顆粒作用靶點，探討心復力顆粒通過結合受體發(fā)揮藥效作用的可能機制。 檢索心復力顆粒藥效成分靶點數(shù)據(jù)庫，選取丹參中的有效成分木犀草素、隱丹參酮、丹參酮ⅡA；檳榔中的有效成分原花青素；黃芪、葶藶子和木瓜中的有效成分五羥黃酮進行分子對接分析。詳見表3。

表3 心復力顆粒藥效成分與心力衰竭作用靶點的分子對接結果

對接結果顯示，心復力顆粒藥效成分與心力衰竭相關靶點的結合自由能均為負值，提示其結合為自發(fā)放能反應，可形成穩(wěn)定復合物，為心復力顆粒的藥效作用機制提供了理論基礎。因此，心復力顆粒治療心力衰竭的基礎作用機制可能通過結合激活或抑制VEGFR和EDNR受體或與EDN1配體形成復合物有關，表明心復力顆粒可能通過調節(jié)血壓、促進血管新生、抑制心肌纖維化及病理重構發(fā)揮藥物活性和心力衰竭保護作用，且丹參、黃芪、葶藶子、木瓜及檳榔中含有較多作用成分，為藥物優(yōu)化指明了方向。提交主要結果在PyMol軟件中進行可視化，詳見圖6。

圖6 心復力顆粒藥效成分原花青素與VEGFR分子對接圖

3 討 論

一項中藥治療心力衰竭的系統(tǒng)性綜述納入了芪藶強心膠囊等9項隨機對照臨床研究，指出中藥聯(lián)合西藥可降低心力衰竭病人不良心血管事件發(fā)生率，中西醫(yī)結合是心力衰竭治療策略的潛在優(yōu)化方向[10]。心復力顆粒是阜外醫(yī)院名老中醫(yī)丁鳴九治療心力衰竭的經驗方，本研究在網絡藥理學方法基礎上，通過構建心復力顆粒與心力衰竭作用靶點PPI網絡和GO與KEGG基因富集分析，發(fā)現(xiàn)心復力顆粒中160種藥效成分可作用于心力衰竭62個相關靶點，其中關鍵靶點包括EDN1、VEGFA、NOS3、CCL2、IL8、TP53、VCAM1、SERPINE1、CAV1和SELE等，涉及信號通路包括HIF-1信號通路、TNF信號通路、NLRs信號通路、VEGF信號通路等。在前期研究基礎上，選取關鍵靶點通路進行分子對接分析，實現(xiàn)對心復力顆粒治療心力衰竭潛在機制的科學系統(tǒng)分析。

3.1 心復力顆粒治療心力衰竭現(xiàn)有證據(jù)分析 網絡分析與數(shù)據(jù)庫檢索結果顯示，參與心復力顆粒治療心力衰竭的114種藥效成分主要來自丹參、人參、黑順片、茯苓、檳榔、黃芪、三棱、木瓜和葶藶子。相關研究表明，丹參通過作用于核受體類視黃醇X受體α和核因子(NF)-κB通路減輕氧化應激導致的能量代謝障礙和心肌肥厚，提高線粒體功能[11-12]。人參通過調節(jié)心肌能量代謝發(fā)揮心力衰竭保護作用外，還可介導腺苷酸活化蛋白激酶-結節(jié)性硬化癥蛋白2-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase-tuberous sclerosis 2-mammalian target of rapamycin，AMPK-TSC2-mTOR)信號通路參與細胞自噬的調節(jié)，通過調節(jié)多種炎性介質表達實現(xiàn)對心肌肥厚和心室不利重構的抑制[13-14]。黑順片通過線粒體合成相關的組蛋白脫乙酰酶/過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(sirtuin 1/peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator，Sirt1/PGC-1α)信號通路促進線粒體合成及鈣離子信號通路和心肌收縮相關基因SERCA2a表達的調節(jié)，提高心力衰竭大鼠心功能[15-16]。在減輕心臟負荷方面，茯苓通過作用于水的重吸收相關精氨酸加壓素-血管加壓素受體2-水通道蛋白2(arginine vasopression-vasopressin receptor 2-aquaporin 2，AVP-V2R-AQP2)軸發(fā)揮利尿作用，降低心力衰竭大鼠循環(huán)BNP含量，拮抗心力衰竭[17]。黃芪作為心力衰竭的常用治療藥物，通過促進血管新生，抑制心肌組織重構和調節(jié)心肌能量代謝等作用機制發(fā)揮心力衰竭心肌保護作用，并作用于去甲腎上腺素、醛固酮等神經體液因子水平改善心功能[18-19]。葶藶子通過抑制心力衰竭大鼠模型中神經內分泌系統(tǒng)過度激活，改善體內氧化應激失衡，抑制心肌細胞凋亡與心室重構等發(fā)揮作用[20]。

檢索既往相關文獻，心復力顆粒治療心力衰竭發(fā)生發(fā)展的關鍵藥效物質可能包括丹參、人參、黑順片、茯苓、黃芪和葶藶子。心復力顆粒的多種藥效成分是否由于相互作用影響其藥理機制、已有研究證據(jù)缺乏對通路的功能缺失性雙重驗證、相關藥物療效缺乏設計嚴密的臨床觀察或研究佐證等問題，有待進一步解決。

3.2 心復力顆粒治療心力衰竭關鍵靶點和通路分析 心復力顆粒治療心力衰竭關鍵靶點基因富集分析顯示，心復力顆粒通過EDN1、VEGFA、NOS3和SERPINE1作用于HIF-1信號通路；EDN1、CCL2、VCAM1、IL-8和SELE作用于TNF信號通路；NOS3及其他靶點作用于環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G(cGMP-PKG)和鈣離子信號通路；CCL2和IL-8作用于NLRs信號通路；VEGFA、NOS3和TP53作用于PI3K/Akt信號通路；NOS3和VEGFA作用于VEGF信號通路。其中，HIF-1通路在心肌缺氧條件下被激活，通過調節(jié)葡萄糖代謝相關酶類基因表達，作用于葡萄糖運輸、線粒體氧化磷酸化和ATP生成等途徑，導致線粒體功能障礙、代謝紊亂和心肌細胞凋亡，引起不利重構和心功能惡化，通過影響血管新生和心肌炎性反應促進心力衰竭發(fā)生發(fā)展[21]。TNF信號通路通過促炎作用影響心肌細胞收縮功能，介導微血管炎癥和障礙，參與成纖維細胞活化，引起心室重構，使心力衰竭惡化[22]。在心力衰竭心肌神經內分泌活化和心肌損傷刺激下，cGMP-PKG信號通路活化可減輕心肌纖維化，抑制心肌細胞凋亡和調節(jié)血管內皮通透性等，已有臨床研究初步證實促進cGMP-PKG信號通路可降低心力衰竭病人心血管死亡率和再住院率，改善預后[23]。鈣離子作為第二信使，通過影響心肌收縮、促進心肌肥厚與重構相關基因表達和心律失常等機制參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展，作用于線粒體，干擾電子轉移與三羧酸循環(huán)，引起能量代謝障礙和ATP生成減少[24]。有研究顯示，腎上腺素能信號不僅影響心肌收縮力與心肌變力儲備，同時引起胰島素抵抗、心肌纖維化和心室重構，導致心力衰竭；NLRs信號通路通過激活下游NF-κB信號及鈣離子信號，引起轉化生長因子(TGF)-β等細胞因子分泌、心肌細胞凋亡和纖維化，導致心功能障礙[25]。心力衰竭心肌中VEGF信號通路的激活促進血管新生，提高血管通透性，改善局部血流灌注，通過激活PI3K/AKT信號通路，促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，抑制促凋亡蛋白Caspase-3等活性，發(fā)揮抑制心肌細胞凋亡和提高血管穩(wěn)定性作用[26-27]。詳見圖7。

圖7 心復力顆粒治療心力衰竭潛在的分子機制示意圖

結合心復力顆粒中單藥成分治療心力衰竭的研究證據(jù)和富集分析結果，本研究從理論層面初步探討了心復力顆粒治療心力衰竭的機制可能包括調節(jié)心肌能量代謝、抑制不利重構、促進血管新生、減輕心臟負荷、調節(jié)細胞凋亡與自噬和抑制神經內分泌系統(tǒng)過度激活等，體現(xiàn)了心復力顆粒治療心力衰竭多成分、多靶點、多通路的藥效特點，從整體探討了心復力顆粒治療心力衰竭的潛在機制，為進一步開展基礎和臨床研究提供理論支持與研究方向。