劉聰，徐鵬飛

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，杭州 310058）

早在19 世紀(jì)末，Hans DRIESCH 發(fā)現(xiàn)從海膽胚胎中分離的2 個(gè)細(xì)胞可以發(fā)育成尺寸較小但結(jié)構(gòu)完整的海膽胚胎，由此認(rèn)為在早期發(fā)育的胚胎中存在能夠指定每個(gè)細(xì)胞位置的坐標(biāo)系統(tǒng)。1969 年，WOLPERT 構(gòu)建了“法國(guó)國(guó)旗”模型，首次提出了胚胎發(fā)育過程中存在位置信息的概念[1]，同時(shí)，該模型從分子水平上揭示了一種介導(dǎo)細(xì)胞位置調(diào)控和圖式形成的信號(hào)，這種信號(hào)（形態(tài)素）能夠通過給予位置信息來調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)，并進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)大范圍的形態(tài)發(fā)生。目前的研究對(duì)形態(tài)素已經(jīng)有了一定的了解：形態(tài)素從局部組織分泌，通過擴(kuò)散等方式形成濃度梯度，細(xì)胞響應(yīng)不同濃度的形態(tài)素并被誘導(dǎo)表達(dá)相應(yīng)的下游基因，從而進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的決定及其空間排布；同時(shí)，形態(tài)素下游的信號(hào)也可進(jìn)一步通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移等過程來調(diào)控不同細(xì)胞群之間邊界的形成。

脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前體——神經(jīng)管的形成是一個(gè)復(fù)雜而有序的發(fā)育過程，需要正確的細(xì)胞命運(yùn)誘導(dǎo)和空間位置調(diào)控?？茖W(xué)家們已經(jīng)證實(shí)許多形態(tài)素參與調(diào)控神經(jīng)管的發(fā)育，包括參與神經(jīng)管前-后圖式形成的維甲酸（retinoic acid,RA）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor, FGF）、生長(zhǎng)分化因子（growth differentiation factor,GDF），以及參與神經(jīng)管背-腹圖式細(xì)胞分化和位置決定的Wingless-Int（Wnt）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）和音猬因子（Sonic hedgehog,Shh）[2]（圖1）。

圖1 脊椎動(dòng)物神經(jīng)管背-腹圖式Fig.1 Dorsal-ventral pattern of vertebrate neural tube

Shh信號(hào)源自脊索并參與早期胚胎發(fā)育和身體圖式的形成。實(shí)驗(yàn)證明，Shh信號(hào)負(fù)責(zé)調(diào)控神經(jīng)管腹側(cè)的細(xì)胞圖式，抑制Shh信號(hào)會(huì)導(dǎo)致雞、斑馬魚和小鼠胚胎中嚴(yán)重的神經(jīng)管背-腹圖式缺陷[3-4]。另外，體外實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)神經(jīng)前體細(xì)胞暴露于不同濃度的Shh蛋白中時(shí)，神經(jīng)管腹側(cè)細(xì)胞特異性基因的表達(dá)會(huì)顯著增加[5]。BMP信號(hào)在早期胚胎發(fā)育中也發(fā)揮重要作用，它與其自身拮抗基因相互作用，將胚胎的3個(gè)胚層細(xì)分為具有不同發(fā)育命運(yùn)的區(qū)域。在神經(jīng)管發(fā)育過程中，不同濃度的BMP信號(hào)會(huì)沿著背腹軸誘導(dǎo)神經(jīng)管不同區(qū)域細(xì)胞命運(yùn)的形成。抑制BMP 信號(hào)會(huì)導(dǎo)致雞和斑馬魚胚胎神經(jīng)管背側(cè)細(xì)胞圖式的嚴(yán)重缺陷[6]，BMP信號(hào)（如BMP4/7）或其受體的過表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致大量的背側(cè)神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生[7]。

近年來，類器官培養(yǎng)技術(shù)的興起進(jìn)一步推動(dòng)了對(duì)脊椎動(dòng)物神經(jīng)管形成中BMP和Shh這2種信號(hào)的研究。類器官作為一種在體外由全能/多能干細(xì)胞培養(yǎng)的三維細(xì)胞組織，具有相應(yīng)體內(nèi)器官的主要特征和一定的功能，其為探索形態(tài)素濃度梯度在胚胎發(fā)育中的作用提供了理想的體外模型。2019 年，LORENZ 實(shí)驗(yàn)室通過模擬Shh 信號(hào)濃度梯度，成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了多種前腦細(xì)胞類型，這些細(xì)胞具有與體內(nèi)前腦圖式類似的空間分布，在一定程度上形成了前腦的背-腹和前-后圖式[8]，為探究前腦發(fā)育提供了優(yōu)秀的體外模型。

在本綜述中，我們主要從BMP和Shh配體的產(chǎn)生及濃度梯度的形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞應(yīng)答、圖式建成的調(diào)控機(jī)制這3 部分出發(fā)，討論BMP 和Shh 信號(hào)作為形態(tài)素在脊椎動(dòng)物神經(jīng)管發(fā)育中的作用。盡管這3 部分在神經(jīng)管發(fā)育過程中緊密相連，不能單獨(dú)考慮，但我們希望這種劃分能夠?yàn)榧棺祫?dòng)物神經(jīng)管發(fā)育中BMP 和Shh 信號(hào)的系統(tǒng)研究提供方便的框架。同時(shí)，我們也總結(jié)了近年來利用形態(tài)素構(gòu)建神經(jīng)管類器官的一些研究工作。

1 神經(jīng)管發(fā)育中BMP 信號(hào)和Shh 信號(hào)反向平行濃度梯度的形成

神經(jīng)管來源于早期胚胎的神經(jīng)板或神經(jīng)上皮。在胚胎發(fā)育的原腸胚階段，BMP配體濃度梯度呈現(xiàn)為腹側(cè)較高而背側(cè)較低。這種從腹側(cè)至背側(cè)的BMP 濃度梯度的建立依賴于胚胎中表達(dá)于背側(cè)的BMP 抑制蛋白的作用，主要為背組織者（dorsal organizer）分泌的Noggin[9]、Chordin[10]和Follistatin[11]等。背側(cè)BMP 信號(hào)的抑制使得神經(jīng)外胚層從原始外胚層中特化產(chǎn)生[12]，然后在原腸運(yùn)動(dòng)過程中細(xì)胞向背中線匯聚，導(dǎo)致外胚層增厚并產(chǎn)生神經(jīng)管的前體——神經(jīng)板，隨后神經(jīng)板通過稱為神經(jīng)發(fā)生（neurulation）的形態(tài)重塑過程形成神經(jīng)管。

脊椎動(dòng)物中兩棲類、鳥類和哺乳類等的神經(jīng)管形成方式可分為2 種類型：一種是初級(jí)神經(jīng)發(fā)生（primary neurulation），產(chǎn)生體軸前部的神經(jīng)管，在未來發(fā)育為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦；另一種是次級(jí)神經(jīng)發(fā)生（secondary neurulation），作為體軸后部神經(jīng)管的形成方式，在未來發(fā)育為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊髓[13]。

初級(jí)神經(jīng)發(fā)生包括神經(jīng)板的折疊以及在中線處的融合（圖2A～C，H）。神經(jīng)板在原腸運(yùn)動(dòng)的匯聚作用下彎曲折疊形成神經(jīng)褶（neural fold）[13]，這種形態(tài)的發(fā)生依賴于神經(jīng)板上的特殊結(jié)構(gòu)——鉸鏈點(diǎn)：一種是中線鉸鏈點(diǎn)（median hinge point,MHP），位于神經(jīng)板的腹側(cè)中線，是存在于底板的一組特定細(xì)胞，可使神經(jīng)板從中線處彎曲而產(chǎn)生具有V 形橫截面的神經(jīng)溝（neural groove）；另一種是成對(duì)的背外側(cè)鉸鏈點(diǎn)（dorsolateral hinge point, DLHP），位于神經(jīng)板兩側(cè)，依賴于DLHPs的折疊，神經(jīng)板形成縱向溝，且神經(jīng)板兩側(cè)末端在背中線處彼此相對(duì)。隨后，神經(jīng)褶的邊緣在中線處匯合并融合，形成封閉的中空神經(jīng)管[13]。

次級(jí)神經(jīng)發(fā)生形成未來中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊柱尾部到骶骨中部的部分（圖2A，D，E，H）。次級(jí)神經(jīng)發(fā)生與初級(jí)神經(jīng)發(fā)生差異較大，前者不是通過神經(jīng)板折疊的方式形成，而是神經(jīng)板細(xì)胞在原腸運(yùn)動(dòng)的匯聚作用下向中間聚集，并排列成與初級(jí)神經(jīng)管相連的實(shí)心柱狀結(jié)構(gòu)——髓索，而與初級(jí)神經(jīng)管相連的中央管腔的形成依賴于髓索中多個(gè)小腔的進(jìn)一步擴(kuò)大和隨后的融合[13]。

然而，在斑馬魚等硬骨魚（teleost fish）中，其神經(jīng)管的形成不同于上述2 種神經(jīng)發(fā)生方式，而是采用一種類似于次級(jí)神經(jīng)發(fā)生的方式（圖2A，F(xiàn)～H）。首先，神經(jīng)板細(xì)胞在原腸運(yùn)動(dòng)的匯聚作用下向背中線聚集并內(nèi)化，形成實(shí)心的神經(jīng)龍骨（neural keel）。然后，神經(jīng)龍骨進(jìn)一步發(fā)育為堅(jiān)固的神經(jīng)條（neural rod）；而神經(jīng)管中央空腔的形成依賴于神經(jīng)條中線兩側(cè)的神經(jīng)管細(xì)胞頂端特化以及隨后沿著中線的對(duì)稱分裂。最后，神經(jīng)管前部發(fā)育為腦，后部發(fā)育為脊髓，從而形成完整的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[14]。

圖2 神經(jīng)管的形成過程Fig.2 Formation process of neural tube

這3種神經(jīng)發(fā)生方式最初都是由原腸胚時(shí)期的匯聚延伸運(yùn)動(dòng)驅(qū)動(dòng)的。在這種強(qiáng)烈的細(xì)胞遷移過程中，最初胚胎中從腹側(cè)到背側(cè)（從高到低）的BMP濃度梯度轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)管中從背側(cè)到腹側(cè)（從高到低）的濃度梯度[13-14]（圖3）。而在神經(jīng)管形成過程中，Shh從腹側(cè)脊索中分泌出來并擴(kuò)散，建立了神經(jīng)管中從腹側(cè)至背側(cè)的濃度梯度。BMP和Shh這2種形態(tài)素在神經(jīng)管中形成了反向平行的濃度梯度，并進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)管的背-腹圖式進(jìn)行誘導(dǎo)。在神經(jīng)管形成之后，頂板和底板作為神經(jīng)管中新的信號(hào)源，分泌形態(tài)素并維持其濃度梯度，沿著背-腹軸將神經(jīng)祖細(xì)胞誘導(dǎo)劃分為11個(gè)區(qū)域（圖1），包括6個(gè)背側(cè)祖細(xì)胞域（dP1～dP6）和5 個(gè)腹側(cè)祖細(xì)胞域（p0～p3和pMN），且分別進(jìn)一步分化為相應(yīng)的背側(cè)中間神經(jīng)元群（dI1～dI6）和腹側(cè)中間神經(jīng)元群（v0～v3 和MN）[15]。

圖3 斑馬魚早期發(fā)育中BMP濃度梯度轉(zhuǎn)換過程Fig.3 BMP concentration gradient shifting process during the zebrafish early development

2 BMP 信號(hào)與神經(jīng)管背側(cè)細(xì)胞命運(yùn)

BMP 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）家族的成員之一，在胚胎發(fā)育（如細(xì)胞增殖、分化和遷移等過程）中起著重要作用[16]。有關(guān)證據(jù)表明，BMP信號(hào)參與了從神經(jīng)外胚層產(chǎn)生階段開始的整個(gè)神經(jīng)管的形成過程，以及對(duì)神經(jīng)祖細(xì)胞和下級(jí)神經(jīng)元的分化和空間排布的調(diào)控[17]。以下部分將重點(diǎn)總結(jié)BMP 信號(hào)在脊椎動(dòng)物神經(jīng)管圖式形成中的作用及調(diào)控機(jī)制。

2.1 BMP 信號(hào)的產(chǎn)生

在神經(jīng)管中，BMP配體由位于神經(jīng)管背中線的頂板分泌產(chǎn)生，并通過擴(kuò)散形成濃度梯度。頂板作為BMP配體的信號(hào)源，形成于神經(jīng)板的折疊閉合過程。隨著神經(jīng)板的折疊，神經(jīng)板邊界（神經(jīng)外胚層和非神經(jīng)外胚層之間的較寬區(qū)域）移動(dòng)到神經(jīng)管的背側(cè)[18]（圖4），同時(shí)，頂板祖細(xì)胞也向神經(jīng)板邊界遷移，到達(dá)未來神經(jīng)管最背側(cè)中線位置。神經(jīng)板邊界具有較高水平的BMP 活性[19]，在這種細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中，頂板祖細(xì)胞暴露于活性水平更高的BMP信號(hào)中，從而分化為成熟的頂板細(xì)胞[18,20]。較高濃度的BMP信號(hào)誘導(dǎo)頂板細(xì)胞表達(dá)Hairy 1蛋白，該蛋白可以通過抑制Foxd3（神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)記物）的表達(dá)來鞏固頂板的細(xì)胞命運(yùn)，促進(jìn)其退出細(xì)胞周期和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[18,20]。

圖4 神經(jīng)管頂板的形成過程Fig.4 Formation process of roof plate in neural tube

2.2 BMP 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞應(yīng)答

2.2.1 BMP 配體

在BMP 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，BMP 配體通過二硫鍵之間的共價(jià)鍵連接，以二聚體的形式發(fā)揮作用[21]（圖5）。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，BMP 的異二聚體比同二聚體具有更高的活性[22]。同時(shí)，分子遺傳學(xué)研究表明，斑馬魚胚胎中同時(shí)存在BMP同二聚體和異二聚體，但只有Bmp2b/Bmp7a 異二聚體可以磷酸化TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵信使Smad1/5[22]。并且Bmp2b/Bmp7a 異二聚體可以通過與Alk3/6 和Alk2形成復(fù)合物來參與神經(jīng)管背-腹圖式的形成。

2.2.2 BMP 受體復(fù)合物

BMP 信號(hào)由胞外向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于細(xì)胞膜上的Ⅰ型和Ⅱ型受體復(fù)合物[23]，這2 種類型的受體都包含作為配體結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和具有絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase,STK）活性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在與BMP配體結(jié)合后，Ⅱ型受體會(huì)磷酸化Ⅰ型受體[23]，而磷酸化的Ⅰ型受體可以激活細(xì)胞內(nèi)的下游介體[16]（圖5）。

圖5 BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Fig.5 BMP signaling transduction

目前，已經(jīng)鑒定出6種不同的BMP信號(hào)通路受體，包括Ⅰ型受體BmprⅠ（BmprⅠa 或BmprⅠb）和ActRⅠA，Ⅱ型受體BmprⅡ和ActRⅡ（ActRⅡA 或ActRⅡB）[24]。研究表明，在神經(jīng)管發(fā)育中主要的功能性BMP受體復(fù)合物是BmprⅡ/BmprⅠ，在BmprⅠ突變體小鼠中存在dP1祖細(xì)胞域的缺失及dP2祖細(xì)胞域的明顯減少[25]，而過表達(dá)BmprⅠ則會(huì)導(dǎo)致雞或小鼠背側(cè)和中部神經(jīng)元命運(yùn)的增加及腹側(cè)神經(jīng)元命運(yùn)的減少[26-27]。

2.2.3 Smads 蛋白

Smads蛋白作為BMP信號(hào)通路中的胞內(nèi)組分，參與BMP 信號(hào)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前，已經(jīng)鑒定出的Smads蛋白共有3種，包括激活受體的Smads（receptor activated Smads,R-Smads）、抑制性Smads（inhibitory Smads,I-Smads）和輔助型Smads（common mediator Smads,Co-Smads）[23]。

R-Smads 蛋白作為胞內(nèi)介體，負(fù)責(zé)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有2 個(gè)結(jié)構(gòu)域：N 端的MH1 結(jié)構(gòu)域和C 端的MH2 結(jié)構(gòu)域。作為R-Smads 在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中行使功能的核心，這2 個(gè)結(jié)構(gòu)域都非常保守。其中，MH1 結(jié)構(gòu)域具有DNA 和蛋白質(zhì)結(jié)合功能，MH2 結(jié)構(gòu)域具有受體識(shí)別功能并能夠被Ⅰ型受體磷酸化，從而協(xié)助Smads 復(fù)合物入核[16]。當(dāng)RSmads 蛋白的C 端被磷酸化后，MH1-MH2 自抑制結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出核定位序列，隨后與Co-Smad4結(jié)合并作為復(fù)合物遷移到核中，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)[16]（圖5）。

特定于BMP信號(hào)通路的R-Smads包括Smad1、Smad5 和Smad8[28]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同的R-Smads在神經(jīng)管圖式形成中具有不同的功能。在雞胚胎中敲低Smad1 或Smad5 可以減少dI1～dI6 中間神經(jīng)元的命運(yùn)，其中最為明顯的是dI1、dI3和dI5中間神經(jīng)元[2]，而使用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）敲降雞胚胎中的Smad8 僅能減少dI1 中間神經(jīng)元的命運(yùn)[28]。在小鼠的功能喪失實(shí)驗(yàn)中，背部神經(jīng)元命運(yùn)需要Smad5，而Smad1 在dI1 軸突生長(zhǎng)中起重要作用[28]。

I-Smads 在BMP 信號(hào)通路中起負(fù)調(diào)控作用[29]（圖5），已被鑒定出的I-Smads包括Smad6和Smad7。Smad6 被發(fā)現(xiàn)是幾乎在所有脊椎動(dòng)物中保守的I-Smads，能夠競(jìng)爭(zhēng)性地與磷酸化R-Smads結(jié)合，從而阻止其與Co-Smad4形成復(fù)合物。而Smad7能夠通過與R-Smads競(jìng)爭(zhēng)來激活BmprⅠ，從而抑制BMP信號(hào)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)，Smad6 和Smad7 都可以與Smuf1 綴合以促進(jìn)BMP 受體的降解[29]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)管的不同神經(jīng)元中表達(dá)的不同的I-Smad 似乎具有不同的功能：在雞神經(jīng)管發(fā)育過程中，Smad7在脊髓中部新分化的神經(jīng)元中高表達(dá)，而Smad6在脊髓背部和中部的成熟神經(jīng)元中高表達(dá)；在背側(cè)激活Smad7能夠抑制dI1和dI3中間神經(jīng)元的分化，而Smad6的異位表達(dá)能夠?qū)е耫I1軸突生長(zhǎng)的缺陷[30]。

對(duì)于Co-Smads 在神經(jīng)管發(fā)育方面的研究非常有限，僅有實(shí)驗(yàn)表明，通過小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）敲降雛雞中的Smad4 會(huì)導(dǎo)致dI1和dI3中間神經(jīng)元的缺失[6]。

2.3 BMP 調(diào)控背-腹圖式形成的機(jī)制

2.3.1 BMP 濃度梯度模型

關(guān)于BMP 信號(hào)調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生具有空間性的命運(yùn)決定和排布的機(jī)制，最被認(rèn)可的觀點(diǎn)是BMP作為一種形態(tài)素，其濃度梯度會(huì)影響背側(cè)神經(jīng)祖細(xì)胞命運(yùn)的決定并調(diào)控3 種感覺神經(jīng)元（dI1、dI2和dI3）的分化[4]。

在BMP 濃度梯度模型中，高水平的BMP 活性有利于背側(cè)神經(jīng)祖細(xì)胞命運(yùn)的產(chǎn)生，而低水平的BMP活性則有利于靠近腹側(cè)的神經(jīng)祖細(xì)胞的命運(yùn)決定。2002年，NISWANDER實(shí)驗(yàn)室的體內(nèi)功能獲得性實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了這一模型，他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中成功利用不同濃度的BMP 信號(hào)分別誘導(dǎo)了dI1、dI2 和dI3神經(jīng)元的產(chǎn)生[27]。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，正確的BMP濃度梯度是維持神經(jīng)管背側(cè)和腹側(cè)神經(jīng)元之間的平衡所必需的。在雛雞或小鼠胚胎中過表達(dá)BmprⅠa和BmprⅠb會(huì)導(dǎo)致背側(cè)和中間區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量的增加及腹側(cè)神經(jīng)元的缺失[26-27]，而BmprⅠa 和BmprⅠb 的缺失則會(huì)導(dǎo)致背側(cè)dI1 中間神經(jīng)元的完全喪失及dI3 和dI4 中間神經(jīng)元的增加[25]。Noggin作為BMP信號(hào)通路的抑制基因，能夠在胞外競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合BMP 配體。Noggin的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致dI1 中間神經(jīng)元的缺失和dI2～dI4 中間神經(jīng)元的增加[6]。Follistatin作為另一種BMP 信號(hào)通路的抑制基因，其過表達(dá)能夠?qū)е耫P1～dP3 祖細(xì)胞域命運(yùn)的減少[31]。Bmp4/7 或激活的BmprⅠ轉(zhuǎn)基因過表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致dI1中間神經(jīng)元的增加[7]。

2.3.2 BMP 配體誘導(dǎo)模型

不同物種中參與神經(jīng)管背-腹圖式形成的BMP配體是不同的，并且有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在雞的神經(jīng)組織外植體中，BMP4 轉(zhuǎn)染的COS 細(xì)胞能夠誘導(dǎo)dI1 神經(jīng)元命運(yùn)的產(chǎn)生，而用稀釋的BMP4 條件培養(yǎng)基處理卻不能有效地誘導(dǎo)dI3神經(jīng)元的命運(yùn)[32-33]，表明低濃度的BMP4可能無(wú)法誘導(dǎo)dI3神經(jīng)元。因此，研究人員提出了BMP配體誘導(dǎo)模型來解釋神經(jīng)管背-腹圖式的形成。該模型認(rèn)為不同的BMP 配體參與誘導(dǎo)不同神經(jīng)祖細(xì)胞域的產(chǎn)生和空間排布，如BMP4和BMP7 在雞神經(jīng)管發(fā)育中發(fā)揮作用，而在小鼠神經(jīng)管發(fā)育中則是BMP5、BMP6 和BMP7 發(fā)揮作用[32-33]。同樣，在雞胚胎中敲低BMP4僅導(dǎo)致dI1 神經(jīng)元的減少，而敲除BMP7則明顯減少了dI1、dI3和dI5 神經(jīng)元的數(shù)量[17,34]。該機(jī)制可以通過顯性負(fù)型Ⅰ型BMP受體實(shí)驗(yàn)來解釋：通過電轉(zhuǎn)激酶結(jié)構(gòu)域截?cái)嘈问降腂mprⅠ發(fā)現(xiàn)，不同的BMP 配體可以激活不同的Ⅰ型受體并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而參與神經(jīng)元分化的調(diào)控。小鼠中BMP6和雛雞中BMP7誘導(dǎo)頂板的形成均是通過BmprⅠa發(fā)揮作用。在小鼠和雛雞中，dP1 祖細(xì)胞都由BMP4 和BMP7 通過BmprⅠa或BmprⅠb 誘導(dǎo)，而dI1 神經(jīng)元?jiǎng)t只能由BMP4 誘導(dǎo)。雛雞中dI2神經(jīng)元只能由BMP4誘導(dǎo)，而dI3神經(jīng)元可以由所有BMP配體誘導(dǎo)，但dI4～dI6在任何BMP配體作用下都未能被誘導(dǎo)，說明可能存在其他機(jī)制來誘導(dǎo)偏向于神經(jīng)管中部的神經(jīng)元命運(yùn)[33]。

2.3.3 時(shí)間形態(tài)素誘導(dǎo)模型

一些研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于神經(jīng)管這樣一個(gè)復(fù)雜的三維組織，不僅BMP 信號(hào)的空間分布參與背-腹圖式的形成，靶細(xì)胞在信號(hào)中的暴露時(shí)間也參與細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)節(jié)。在雛雞神經(jīng)板外植體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)時(shí)間的Bmp4信號(hào)暴露會(huì)導(dǎo)致較多的背祖細(xì)胞命運(yùn)的產(chǎn)生，而在體內(nèi)，在不同階段抑制BMP 信號(hào)會(huì)導(dǎo)致不同的缺陷表型，早期抑制BMP 信號(hào)會(huì)導(dǎo)致整個(gè)dI1～dI3 神經(jīng)元的缺失，而后期抑制則能夠依次產(chǎn)生dI3和dI2神經(jīng)元[35]。

3 Shh 信號(hào)與神經(jīng)管腹側(cè)細(xì)胞命運(yùn)

Shh 是經(jīng)典刺猬（hedgehog）信號(hào)中最重要的糖蛋白之一，在脊椎動(dòng)物肢體、神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道及心臟等各種重要系統(tǒng)、器官的發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。此外，相關(guān)研究表明，Shh的激活也參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移以及血管的生成和存活[36]。在本綜述中，總結(jié)了Shh在脊椎動(dòng)物神經(jīng)管發(fā)育中的作用及調(diào)控機(jī)制。

3.1 神經(jīng)管中Shh 蛋白的表達(dá)

在脊椎動(dòng)物神經(jīng)管發(fā)育過程中，Shh 蛋白由位于神經(jīng)管腹側(cè)的脊索和底板分泌產(chǎn)生[37]。在原腸胚時(shí)期，Shh在中胚層處表達(dá)，隨著中線處中胚層形成實(shí)心棒狀的脊索，Shh 開始在脊索中表達(dá)[37]。在羊膜動(dòng)物中，由脊索分泌的Shh 在神經(jīng)管中誘導(dǎo)了底板的形成，且其是Shh 產(chǎn)生和分泌的第2 個(gè)中心[37]。然而在其他脊椎動(dòng)物中，底板的形成機(jī)制似乎與脊索衍生的Shh信號(hào)的相關(guān)性較小[38]。

3.2 Shh 濃度梯度的形成

與其他形態(tài)素相似，Shh 信號(hào)濃度梯度的形成涉及3 個(gè)主要問題：1）如何以活性形式產(chǎn)生和分泌Shh 配體；2）Shh 配體如何在組織中擴(kuò)散；3）過量的Shh 如何降解并從組織中去除。其中，每個(gè)過程都有特定的分子途徑進(jìn)行精確調(diào)控，并構(gòu)成了復(fù)雜的Shh濃度梯度形成和維持系統(tǒng)。

3.2.1 Shh 的產(chǎn)生和擴(kuò)散受脂化作用的影響

活性Shh 配體的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過程。Shh蛋白最初在分泌細(xì)胞中被翻譯成45 kDa 的Shh 前體，隨后經(jīng)過蛋白酶的水解作用產(chǎn)生2個(gè)較短的肽，即19 kDa的N端區(qū)域（Shh-N）和26 kDa的C端區(qū)域（Shh-C）（圖6），抑制這種蛋白酶水解切割能夠使Shh信號(hào)失活[39]。在水解切割過程中，羧基末端會(huì)連接膽固醇，這是Shh-N的分泌、遷移和膜插入所必需的[39]，缺乏膽固醇修飾的Shh會(huì)更快地在組織中擴(kuò)散和滲透[40]。水解切割之后，Shh-N與Shh-C分離，酰基轉(zhuǎn)移酶Skn會(huì)催化棕櫚?；cShh-N的N末端結(jié)合[39]，從而增強(qiáng)Shh信號(hào)的誘導(dǎo)能力[41]。非棕櫚?；问降腟hh活性較低[41]，同時(shí)，這種修飾對(duì)于脊椎動(dòng)物神經(jīng)管的發(fā)育是必需的，因?yàn)镾kn－/－小鼠胚胎表現(xiàn)出與Skn－/－小鼠相似的畸形——神經(jīng)管中存在嚴(yán)重的背-腹圖式混亂[41-42]。Shh的雙重脂化作用（圖6）確保了其在脊椎動(dòng)物神經(jīng)管發(fā)育過程中的擴(kuò)散性和對(duì)遠(yuǎn)距離信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性[40-41]，為誘導(dǎo)神經(jīng)管腹側(cè)細(xì)胞圖式提供了支持。

3.2.2 Shh 的分泌依賴Disp1 跨膜蛋白的協(xié)助

脊索和底板細(xì)胞中活性Shh配體的分泌需要跨膜蛋白Disp1的協(xié)助（圖6）。Disp1上存在固醇感應(yīng)結(jié)構(gòu)域（sterol-sensing domain,SSD），可以識(shí)別膽固醇修飾的Shh-N，從而促進(jìn)其分泌以及在組織中的長(zhǎng)距離信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[43]。在純合的Disp1突變小鼠中，神經(jīng)管的背-腹圖式，尤其是腹側(cè)部分被嚴(yán)重破壞，并且沒有檢測(cè)到呈活性狀態(tài)的Shh配體[43]。然而也有實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出存在缺乏膽固醇修飾的Shh配體的非Disp1依賴性分泌途徑[44]，對(duì)此的解釋是：Disp1可以促進(jìn)具有長(zhǎng)距離和高活性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的活性Shh的組裝，而在短距離信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，非Disp1依賴的途徑被激活，可調(diào)控神經(jīng)管腹側(cè)部分高濃度的Shh信號(hào)[40]。

3.2.3 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖協(xié)助Shh 擴(kuò)散

Shh沿著神經(jīng)管背-腹軸的擴(kuò)散受幾種細(xì)胞外蛋白的調(diào)節(jié)，這些蛋白可以與Shh配體結(jié)合，從而限制雙脂質(zhì)修飾的Shh-N 的擴(kuò)散，并改變其降解速率。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan,HSPG）是細(xì)胞外基質(zhì)的一種保守成分，被認(rèn)為是調(diào)控Shh 擴(kuò)散的胞外蛋白[45]。功能性HSPG 的形成依賴于由多種催化酶驅(qū)動(dòng)的復(fù)雜翻譯后修飾過程，硫酸酯酶1作為催化過程中的關(guān)鍵酶，能夠催化HSPG的硫酸化，具有與高濃度的Shh蛋白和Nkx2.2（脊椎動(dòng)物腹側(cè)神經(jīng)管中的保守標(biāo)記基因）相同的表達(dá)模式[45]。

3.2.4 神經(jīng)祖細(xì)胞上的膜蛋白協(xié)助Shh 濃度梯度的建立

在Shh 從神經(jīng)管腹側(cè)擴(kuò)散到背側(cè)的過程中，其與幾種跨膜蛋白之間的相互作用被認(rèn)為是協(xié)助其濃度梯度形成的不可忽略的因素（圖6）。根據(jù)這些跨膜蛋白對(duì)Shh 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，可將其分為2 種類型：1）抑制性蛋白，包括Patch1 和Hhip1；2）促進(jìn)性蛋白，包括Cdo、Boc（Cdo的同族）和Gas1[46-48]。

Patch1 在神經(jīng)祖細(xì)胞膜上表達(dá)，是Shh 蛋白的受體，可通過螯合配體和促進(jìn)配體降解的方式引起Shh信號(hào)的細(xì)胞自主性抑制[49]。隨著Shh蛋白在組織中的擴(kuò)散，螯合作用會(huì)逐漸降低Shh配體的利用率，導(dǎo)致受體細(xì)胞接收到的Shh配體減少，從而使其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力減弱[49]。當(dāng)這些由Patch1 和Hhip1 介導(dǎo)的配體依賴性拮抗作用（ligand-dependent antagonism,LDA）被阻斷時(shí)，呈現(xiàn)出p0～p2 神經(jīng)祖細(xì)胞的缺失及p3 和pMN 神經(jīng)祖細(xì)胞的增加[49]。在Shh 配體擴(kuò)散過程中，內(nèi)吞作用和降解作用在遠(yuǎn)離信號(hào)源的區(qū)域中增強(qiáng)，減弱了Shh信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度，與螯合作用一起維持Shh的濃度梯度[50]。

上述Shh信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和濃度梯度形成的調(diào)控機(jī)制都是通過細(xì)胞自主途徑進(jìn)行的。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Hhip1 存在通過硫酸乙酰肝素相互作用對(duì)Shh 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行調(diào)控的非細(xì)胞自主抑制途徑[51]。這一發(fā)現(xiàn)表明，盡管Shh 在胚胎發(fā)育過程中的作用機(jī)制已被很好地理解，但仍可能存在其他調(diào)節(jié)Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的新機(jī)制。

針對(duì)作用于Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的3種促進(jìn)性蛋白Cdo、Boc和Gas1，它們能夠促進(jìn)腹側(cè)細(xì)胞命運(yùn)的決定，協(xié)助Shh 對(duì)腹側(cè)細(xì)胞圖式形成的調(diào)控。Cdo最初是在神經(jīng)管的腹側(cè)中線外表達(dá)，并與底板特化有關(guān)，敲除小鼠的Cdo基因會(huì)導(dǎo)致底板細(xì)胞減少[48]。而Gas1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎的神經(jīng)管腹側(cè)細(xì)胞圖式的缺陷，并且這種缺陷在敲除Shh的胚胎中更為嚴(yán)重[47]。此外，Gas1－/－和Cdo－/－雙突變小鼠胚胎的底板、p3或pMN祖細(xì)胞域的缺失表明這2種蛋白對(duì)神經(jīng)管發(fā)育具有協(xié)同作用[47]。Cdo、Boc和Gas1基因突變小鼠已經(jīng)證實(shí)了這3種膜蛋白在神經(jīng)管腹側(cè)細(xì)胞圖式形成中的必要性[46-48]，并表明這3種蛋白可能在功能上存在相互補(bǔ)償作用[47-48]。同時(shí)，這3種蛋白的表達(dá)均受到Shh 信號(hào)的抑制作用，表明存在Shh信號(hào)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)來為局部Shh濃度的波動(dòng)提供補(bǔ)償機(jī)制，從而為形成和維持腹-背濃度梯度提供了一定程度的穩(wěn)定作用。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些分子（如Scube2）參與調(diào)節(jié)Shh的擴(kuò)散以及濃度梯度的形成[52]，但關(guān)于其功能的研究仍然有限。一個(gè)非常有趣的發(fā)現(xiàn)是，Scube2 可以在Shh 分泌細(xì)胞的細(xì)胞膜上與硫酸乙酰肝素形成釋放復(fù)合物，以協(xié)助Shh的分泌[52]。

由于有關(guān)Shh結(jié)合伴侶及其相應(yīng)機(jī)制的大量研究都是基于腫瘤模型，因此，后續(xù)應(yīng)更關(guān)注在神經(jīng)管器官發(fā)生中驗(yàn)證Shh 信號(hào)的這些已知結(jié)論，以對(duì)Shh 信號(hào)進(jìn)行更全面的探究。此外，動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)和數(shù)學(xué)建模的結(jié)合將有助于對(duì)Shh濃度梯度的形成過程進(jìn)行更好地概括。

3.3 Shh 信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞應(yīng)答

當(dāng)Shh信號(hào)在神經(jīng)管中形成從腹側(cè)到背側(cè)的濃度梯度后，神經(jīng)前體細(xì)胞可以感知并響應(yīng)Shh信號(hào)，從而產(chǎn)生整齊排列的腹側(cè)細(xì)胞圖式。其中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的過程，Shh配體的濃度和持續(xù)時(shí)間都可以參與神經(jīng)前體細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控。

3.3.1 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的開關(guān)——Smo 蛋白

在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的開始，胞外Shh 配體能夠與受體細(xì)胞上的跨膜蛋白Patch1 結(jié)合，從而解除對(duì)另一個(gè)跨膜蛋白Smo 的抑制作用[53]。隨后，Smo 的激活將細(xì)胞外Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活聯(lián)系起來（圖6）。Smo激動(dòng)劑和拮抗劑在神經(jīng)細(xì)胞中的協(xié)同應(yīng)用表明，Smo 的逐級(jí)激活（階梯式）而不是漸進(jìn)激活（連續(xù)式）可能是細(xì)胞對(duì)Shh 濃度梯度響應(yīng)的重要機(jī)制[5]。

在脊椎動(dòng)物中，纖毛對(duì)Shh細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要作用[54]。在沒有Shh信號(hào)的情況下，位于纖毛底部的Patch1受體會(huì)抑制Smo向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而阻止下游信號(hào)激活。而當(dāng)活性Shh配體與Patch1結(jié)合后，Patch1 會(huì)發(fā)生內(nèi)化和降解，從而解除對(duì)Smo 的抑制作用，并進(jìn)一步在初級(jí)纖毛膜上積聚更多的Smo[54]。

為了更好地理解Shh的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，仍需要對(duì)Smo激活后的下游機(jī)制做更多的研究。在過去的20年中，已經(jīng)確定了位于Smo下游的幾個(gè)關(guān)鍵成分[54]。Cos2（Costal 2）是果蠅中一種與微管相關(guān)的驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白，可以直接與Smo的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用[55]，在沒有Shh信號(hào)的情況下，Cos2可以阻斷Smo 下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，Cos2 還可以激活Gli（glioma-associated oncogene）家族鋅指蛋白直系同源物Ci（cubitus interruptus），這是Shh轉(zhuǎn)錄激活功能所需的細(xì)胞質(zhì)鋅指蛋白[56]。但是，脊椎動(dòng)物中的2 個(gè)Cos2直系同源基因Kif和Kif27似乎并不參與Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用shRNA進(jìn)行的敲低實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持了這種差異[57]，表明哺乳動(dòng)物中Cos2相關(guān)蛋白的功能與Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)無(wú)關(guān)，這可能是因?yàn)榧棺祫?dòng)物的Smo含有與果蠅的Smo截然不同的Cos2相互作用的結(jié)構(gòu)域。然而，在某些脊椎動(dòng)物（如斑馬魚）中，通過對(duì)反義嗎啉代（morpholino）寡核苷酸介導(dǎo)的Kif7（Cos2直系同源物）的敲低實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Kif7-KD魚系與野生型斑馬魚之間存在一定差異[58]。類似地，當(dāng)通過抑制Gli 入核及調(diào)節(jié)基因表達(dá)時(shí)，Sufu（suppressor of fused）可以與Cos2 一起發(fā)揮作用，進(jìn)一步抑制下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[59]。

3.3.2 分級(jí)Gli 活性介導(dǎo)分級(jí)Shh 信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)

Shh信號(hào)通過Smo在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)后，能夠催化不同類型的Gli作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)節(jié)基因表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)Shh信號(hào)對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控作用[56]（圖6）。在脊椎動(dòng)物中，介導(dǎo)Shh 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Gli 有3種（Gli1～Gli3）[60-61]：Gli1為依賴于Shh信號(hào)的促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄因子；Gli3能夠抑制Shh信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和相關(guān)基因的表達(dá)；與Gli1和Gli3不同，Gli2具有強(qiáng)大的基因激活和抑制功能，作為促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄因子，Gli2能夠被催化成抑制形式，但其阻遏物活性不受Shh的調(diào)節(jié)，從而具有獨(dú)立的抑制Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力[60]。目前的實(shí)驗(yàn)表明，Gli2 在神經(jīng)管中的主要作用是激活性的，在Gli2－/－小鼠胚胎中，神經(jīng)管腹側(cè)，尤其是底板中的細(xì)胞類型受到嚴(yán)重破壞[61]。Gli3 在Shh 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起劑量依賴性的轉(zhuǎn)錄抑制子的作用，在Gli3突變體小鼠中觀察到神經(jīng)管細(xì)胞強(qiáng)烈的腹側(cè)化表型，這支持了Gli3對(duì)Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有抑制作用的結(jié)論[62]。

圖6 Shh信號(hào)的產(chǎn)生、分泌和轉(zhuǎn)導(dǎo)Fig.6 Production,secretion and transduction of Shh signaling

在Shh 配體濃度梯度作用下，在神經(jīng)管中也誘導(dǎo)出了相似的Gli濃度梯度[63]，這種濃度梯度對(duì)于腹側(cè)細(xì)胞圖式的產(chǎn)生是必需的。功能獲得實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持了這一結(jié)論，該實(shí)驗(yàn)通過逐漸改變Gli 的活性成功地重現(xiàn)了部分背-腹圖式[64]。

3.3.3 Shh 信號(hào)的時(shí)間調(diào)控機(jī)制

與BMP相似，神經(jīng)管腹側(cè)圖式的精確形成不僅取決于Shh 的濃度梯度，還與細(xì)胞暴露于Shh 配體的階段和持續(xù)時(shí)間有關(guān)[5,49,64]。2007 年，DESSAUD等[5]提出了Shh調(diào)控神經(jīng)管背-腹圖式形成的時(shí)間模型，該模型結(jié)合了Shh 信號(hào)的濃度作用和持續(xù)時(shí)間作用，認(rèn)為受體細(xì)胞的敏感性將經(jīng)歷逐漸降低的過程。最初，由于細(xì)胞對(duì)Shh配體具有高敏感度，所以較低的Shh濃度即可激活足夠水平的Gli活性，以用于調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)決定。而隨著神經(jīng)管的發(fā)育，脫敏的神經(jīng)祖細(xì)胞在與初始階段相同的Shh濃度作用下只能誘導(dǎo)較低的細(xì)胞反應(yīng)。在這種機(jī)制的作用下，相同濃度的Shh 信號(hào)實(shí)現(xiàn)了在不同的發(fā)育階段誘導(dǎo)出不同細(xì)胞命運(yùn)的能力[65]。該模型和脫敏假設(shè)獲得了Patch1 響應(yīng)實(shí)驗(yàn)的支持：在Shh的誘導(dǎo)下，反應(yīng)細(xì)胞傾向于表達(dá)更多的抑制性蛋白，如Patch1[66]，而為了補(bǔ)償這些抑制性相互作用以實(shí)現(xiàn)正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞反應(yīng)，就需要更高濃度的Shh配體[5]。

4 神經(jīng)管類器官的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

類器官是在體外構(gòu)建的含有多種器官特異性細(xì)胞類型的自組織結(jié)構(gòu)，并具有相應(yīng)器官的特定功能。近年來，類器官技術(shù)發(fā)展迅速，已成為研究器官發(fā)育、信號(hào)調(diào)控和疾病發(fā)生的重要手段。類器官通常由胚胎干細(xì)胞、器官祖細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞組織并分化而成。目前比較成熟的類型包括腦、腸、肝、胰和上皮類器官等，已廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)探索和疾病研究。

近年來，神經(jīng)系統(tǒng)類器官?gòu)V泛發(fā)展，并被應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)生和疾病方面的研究。2013 年建立的利用hPSC 誘導(dǎo)神經(jīng)類器官的培養(yǎng)系統(tǒng)，部分真實(shí)地再現(xiàn)了人類大腦的發(fā)育和組織過程[67]，同時(shí)，該培養(yǎng)系統(tǒng)將神經(jīng)系統(tǒng)類器官?gòu)膫鹘y(tǒng)的二維組織培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)雜的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)體內(nèi)環(huán)境的較好模擬。其他培養(yǎng)方式包括培養(yǎng)具有早期神經(jīng)命運(yùn)的類器官球、無(wú)血清培養(yǎng)的類胚體樣聚集體（SFEBq）等，以及LANCASTER 實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的最新的腦類器官培養(yǎng)體系及其進(jìn)一步的改進(jìn)，都能夠獲得極為復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，甚至是培養(yǎng)出難以通過離體獲得的星形膠質(zhì)命運(yùn)的細(xì)胞[67-70]。對(duì)于神經(jīng)管這樣一個(gè)模式化且復(fù)雜的重要結(jié)構(gòu)，其類器官的培養(yǎng)經(jīng)歷了不斷發(fā)展的過程，然而培養(yǎng)出能夠重現(xiàn)體內(nèi)類似的細(xì)胞空間分布（每種細(xì)胞類型和細(xì)胞外基質(zhì)沿著3個(gè)體軸位于其對(duì)應(yīng)的位置處）的類器官已成為目前整個(gè)類器官技術(shù)發(fā)展所面臨的棘手挑戰(zhàn)。

2013年初，SASAI提出了一個(gè)想法：為通過細(xì)胞自組織培養(yǎng)的三維類器官提供與在胚胎發(fā)育過程中位置和濃度相同的形態(tài)素，以誘導(dǎo)具有更高體內(nèi)類似性的類器官模型[71]。令人高興的是，近年來，對(duì)形態(tài)素濃度梯度的深入研究和先進(jìn)生物工程技術(shù)的發(fā)展，為克服這一挑戰(zhàn)提供了樂觀的前景。例如：將含有不同濃度形態(tài)素的微珠遞送至特定區(qū)域來實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞水平上誘導(dǎo)不對(duì)稱的干細(xì)胞分裂[72]，或是利用微流體裝置在類器官中產(chǎn)生時(shí)空可調(diào)節(jié)的形態(tài)素濃度梯度，以及通過模擬Shh和BMP的反平行濃度梯度和其他2個(gè)相關(guān)信號(hào)（Wnt和視黃酸）的轉(zhuǎn)導(dǎo)，以在小鼠胚胎干細(xì)胞的不同區(qū)域誘導(dǎo)不同類型的神經(jīng)細(xì)胞命運(yùn)[73]。這些技術(shù)為人們以正確的方式誘導(dǎo)特定細(xì)胞的自組織提供了足夠的信心。除了利用這些技術(shù)，最近，CEDERQUIST 等使用能夠誘導(dǎo)表達(dá)Shh的轉(zhuǎn)基因hPSC模擬信號(hào)源，利用產(chǎn)生并擴(kuò)散的Shh 在類器官中形成了適當(dāng)?shù)臐舛忍荻龋⒃谶@種Shh 濃度梯度下成功地誘導(dǎo)了具有高度體內(nèi)相似性細(xì)胞命運(yùn)和空間排布的獨(dú)特的人前腦類器官[8]（圖7）。

圖7 利用Shh濃度梯度體外指導(dǎo)前腦類器官的形成示意圖Fig.7 Schematic description of applying Shh concentration gradient to instruct forebrain organoid formation in vitro

5 小結(jié)與展望

本綜述主要總結(jié)了2 個(gè)關(guān)鍵的形態(tài)素（BMP 和Shh）在脊椎動(dòng)物神經(jīng)管背-腹圖式形成過程中的作用。在神經(jīng)管形成過程中，位于神經(jīng)管最背側(cè)區(qū)域的頂板分泌的BMP 及位于腹側(cè)的脊索和底板分泌的Shh形成反平行濃度梯度，以誘導(dǎo)背-腹圖式的形成。Shh 可以通過分泌、擴(kuò)散和降解的不同調(diào)控機(jī)制形成腹-背濃度梯度，而BMP 的背-腹?jié)舛忍荻鹊男纬珊途S持方式尚待確定。建立濃度梯度后，這2個(gè)形態(tài)素都可以通過時(shí)空調(diào)節(jié)機(jī)制和相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)。近年來，越來越多的體內(nèi)研究揭示了形態(tài)素濃度梯度在器官發(fā)生中的作用，并被逐步應(yīng)用于構(gòu)建類器官的研究中。

然而，要真正通過構(gòu)建形態(tài)素濃度梯度模仿生物體發(fā)育過程并進(jìn)行深入研究仍然存在一些挑戰(zhàn)。第一，基于當(dāng)前的技術(shù)，在特定時(shí)間和特定位置直接測(cè)量體內(nèi)形態(tài)素的絕對(duì)濃度非常困難；第二，要在體外建立適當(dāng)?shù)男螒B(tài)素濃度梯度，不僅要考慮形態(tài)素的產(chǎn)生，還要考慮其擴(kuò)散和降解；第三，由自組織產(chǎn)生的極高局部濃度極大地增加了形態(tài)素濃度梯度的復(fù)雜性；第四，由于細(xì)胞圖式的產(chǎn)生不僅依賴于形態(tài)素的空間調(diào)節(jié)，還與暴露于形態(tài)素的時(shí)間相關(guān)，因此，對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)時(shí)間需要精確控制；第五，對(duì)于某些形態(tài)素（如BMP），圖式的誘導(dǎo)可能依賴于由不同配體組合成的二聚體，并且對(duì)于不同的二聚體，其功能是否依賴于濃度梯度仍有待驗(yàn)證。但我們相信，利用形態(tài)素濃度梯度并結(jié)合三維打印等生物工程方法是指導(dǎo)胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在體外產(chǎn)生具有正確結(jié)構(gòu)和功能的類器官的最有前景的策略，克服這些挑戰(zhàn)必將大力推動(dòng)整個(gè)發(fā)育生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。