邱金龍，史延，李爽，張坤

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院哺乳動(dòng)物分子胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

自20 世紀(jì)80 年代活體采卵（ovum pick-up,OPU）/體外胚胎生產(chǎn)（in vitroembryo production,IVP）技術(shù)應(yīng)用相繼在牛上獲得成功后，大量的研究和實(shí)踐致力于改進(jìn)這2 項(xiàng)技術(shù)，使得這2 項(xiàng)技術(shù)更加成熟和完善。如今，OPU結(jié)合IVP已經(jīng)成為?？焖贁U(kuò)繁的最主要技術(shù)手段。在商業(yè)化運(yùn)營(yíng)的胚胎移植公司，通過OPU/IVP技術(shù)手段可以實(shí)現(xiàn)每頭供體母牛每年生產(chǎn)80～100 頭犢牛，牛的繁殖效率得到極大提高[1]。

在過去的30多年間，雖然牛OPU/IVP的技術(shù)方案在不斷完善，但是大量研究表明，OPU/IVP 技術(shù)依舊有許多需要改進(jìn)和提高的地方。因此，本文將概述近年來OPU/IVP 技術(shù)在牛胚胎生產(chǎn)中取得的研究進(jìn)展，從方法和機(jī)制方面闡述影響OPU/IVP技術(shù)整體效率的因素、OPU/IVP的技術(shù)缺陷以及優(yōu)化OPU/IVP技術(shù)體系的措施，并對(duì)OPU/IVP技術(shù)在未來中國(guó)市場(chǎng)的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 OPU/IVP 技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

相較于超數(shù)排卵和體內(nèi)胚胎生產(chǎn)（in vivoderived,IVD）等技術(shù)，OPU/IVP 技術(shù)是相對(duì)新型的輔助生殖技術(shù)。OPU/IVP技術(shù)具有效率高、運(yùn)用靈活以及對(duì)供體影響小的特點(diǎn)，因此在胚胎商業(yè)化生產(chǎn)中OPU/IVP技術(shù)正逐步取代IVD技術(shù)，成為種牛擴(kuò)繁的最主要技術(shù)手段。由于OPU/IVP的絕大部分操作都是在體外完成的，因此OPU/IVP技術(shù)還可以應(yīng)用在超數(shù)排卵效果不理想和患有輸卵管堵塞等疾病的不孕不育個(gè)體上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)優(yōu)秀遺傳資源的拯救。同時(shí)，OPU/IVP技術(shù)結(jié)合胚胎冷凍技術(shù)被廣泛運(yùn)用在種質(zhì)資源保護(hù)和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸中。在我國(guó)，OPU/IVP技術(shù)已經(jīng)被運(yùn)用到地方優(yōu)秀種質(zhì)資源的改良和保護(hù)中。除此之外，在基礎(chǔ)科研工作中，破解牛生殖生物學(xué)機(jī)制的相關(guān)研究也依賴于OPU/IVP技術(shù)[2]。

國(guó)際胚胎技術(shù)協(xié)會(huì)（International Embryo Technology Society,IETS）發(fā)布的牛胚胎生產(chǎn)和移植數(shù)據(jù)[3]顯示：2016—2020年全球范圍內(nèi)（不包含中國(guó)、印度和日本）通過OPU技術(shù)獲得的牛卵母細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)高于屠宰場(chǎng)來源的牛卵母細(xì)胞的數(shù)量，而且從2016年開始，屠宰場(chǎng)來源的牛卵母細(xì)胞呈明顯的下降趨勢(shì)；2017—2019年全球每年由OPU技術(shù)生產(chǎn)的牛卵母細(xì)胞數(shù)均超過了300萬(wàn)枚（圖1）。IETS統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)[3]還顯示：牛胚胎移植在所有的家畜中所占的比例最高，在2011—2020 年的10 年里，全球范圍內(nèi)（不包含中國(guó)、印度和日本）每年生產(chǎn)的牛胚胎總數(shù)超過了100萬(wàn)枚；2016年之前通過體內(nèi)生產(chǎn)技術(shù)獲得的胚胎是牛胚胎移植的主要來源，之后呈現(xiàn)出逐年下降的趨勢(shì)；而通過IVP技術(shù)生產(chǎn)的胚胎自2012年以來逐年上升，并在2016年超過IVD技術(shù)生產(chǎn)的胚胎量，而這一差距在2017 年之后呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢(shì)（圖2）。由此可見，通過IVP技術(shù)生產(chǎn)的牛胚胎在全球范圍內(nèi)已經(jīng)成了商業(yè)化牛胚胎移植的主要來源。

圖1 IETS統(tǒng)計(jì)的2016—2020年全球范圍內(nèi)（不包含中國(guó)、印度和日本）通過OPU技術(shù)生產(chǎn)的牛卵母細(xì)胞及其生產(chǎn)的胚胎數(shù)量和屠宰場(chǎng)來源的牛卵母細(xì)胞及其生產(chǎn)的胚胎數(shù)量Fig.1 Numbers of bovine OPU-derived oocytes, OPU-derived embryos, abattoir-derived oocytes and abattoir-derived embryos in the world (not including China, India and Japan)from 2016 to 2020

圖2 IETS統(tǒng)計(jì)的2001—2020年全球范圍內(nèi)（不包含中國(guó)、印度和日本）牛IVD胚胎、IVP胚胎以及總胚胎數(shù)量Fig.2 Numbers of total bovine embryos, IVD embryos and IVP embryos in the world (not including China, India and Japan)from 2001 to 2020

2 影響OPU/IVP 的因素

牛體外胚胎的生產(chǎn)流程是從卵細(xì)胞的采集開始，隨后經(jīng)過卵母細(xì)胞的體外成熟（in vitromature,IVM）、體外受精（in vitrofertilization,IVF）以及受精卵的體外培養(yǎng)（in vitroculture,IVC）發(fā)育成可供移植的胚胎（圖3）。由于體外胚胎生產(chǎn)過程完全是人為操作的，與自然繁殖過程有顯著差別，因此體外胚胎生產(chǎn)過程中的每一步操作都可能對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響。

2.1 影響OPU 的因素

采卵方法對(duì)OPU 的效率有重要影響。卵母細(xì)胞的采集方法主要有手術(shù)法采卵、盲采法采卵、腹腔鏡/內(nèi)窺鏡法采卵和超聲波輔助法采卵。相較于另外3 種采卵方法，超聲波輔助法采卵因其操作方便、對(duì)供體母牛刺激小、采卵數(shù)量多、效率高等優(yōu)勢(shì)，在商業(yè)化胚胎生產(chǎn)中被廣泛推廣使用。研究發(fā)現(xiàn)，利用超聲波輔助法采卵可實(shí)現(xiàn)每頭奶牛單次采卵10～20枚，而且卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的回收率可達(dá)到60%～80%，遠(yuǎn)高于其他活體采卵方法[4]。

圖3顯示了利用超聲波輔助采卵法收集牛卵母細(xì)胞的過程。借助于超聲波信號(hào)的指示，將采卵針插入牛卵巢上充滿液體的卵泡中，卵泡中含有卵母細(xì)胞，卵泡的內(nèi)容物被抽出并通過過濾器進(jìn)入收集管。隨后，收集管被帶進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，在顯微鏡下對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行清洗和篩選，取出卵母細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分級(jí)，篩選出的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中進(jìn)行成熟培養(yǎng)。卵母細(xì)胞成熟以后，在培養(yǎng)皿中進(jìn)行體外受精。受精卵母細(xì)胞在培養(yǎng)皿中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，最終部分受精卵可發(fā)育成可供移植的胚胎。因此，理論上影響胚胎生產(chǎn)流程的因素都會(huì)對(duì)體外胚胎的生產(chǎn)效率產(chǎn)生影響，研究清楚OPU/IVP的影響因素對(duì)提高體外胚胎的生產(chǎn)效率至關(guān)重要。

圖3 牛的OPU/IVP流程Fig.3 Procedure of bovine OPU/IVP

OPU 的生產(chǎn)效率主要受到采卵的技術(shù)因素和供體牛的生理因素影響。技術(shù)因素主要包括采卵設(shè)備是否先進(jìn)、采卵技師的操作熟練程度，生理因素包括供體牛的年齡、身體狀態(tài)、發(fā)情周期、采卵頻率、激素、優(yōu)勢(shì)卵泡等。技術(shù)性的影響因素可以通過購(gòu)置先進(jìn)的設(shè)備以及雇傭熟練的采卵技師來消除，而牛生理因素的影響則需要通過更多的科學(xué)研究來規(guī)避。

研究顯示，牛的年齡會(huì)對(duì)采卵的數(shù)量和質(zhì)量產(chǎn)生影響（表1）。犢牛在8 周齡左右就可以用于開展活體采卵，但是這個(gè)時(shí)期卵的質(zhì)量要低一些。隨著犢牛年齡的增長(zhǎng)，卵泡數(shù)量明顯增加，卵的數(shù)量和質(zhì)量也會(huì)逐漸提高。但對(duì)于成年牛來說，隨著年齡的增長(zhǎng)，卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量反而會(huì)有所下降。在采卵前24 h進(jìn)行激素促排卵，卵的數(shù)量和質(zhì)量都會(huì)得到明顯提升[4-5]。牛發(fā)情周期的特點(diǎn)決定了采卵的時(shí)間間隔，奶牛的一個(gè)發(fā)情周期主要有3 個(gè)卵泡發(fā)育波，一般分布在發(fā)情后第3—4、9—10、15—16 天。在不同的卵泡發(fā)育波里，卵泡的發(fā)育數(shù)量和質(zhì)量有很大差別。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情后第3—4 天進(jìn)行采卵可以獲得最多的卵母細(xì)胞[6]。MACHATKOVA 等研究發(fā)現(xiàn)由于優(yōu)勢(shì)卵泡在OPU后約3 d 出現(xiàn)，每次OPU 后3～4 d 的間隔可以防止優(yōu)勢(shì)卵泡對(duì)較小卵泡的卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能產(chǎn)生負(fù)面影響[7]。與每周1 次OPU 相比，每周2 次OPU可以獲得更多的卵母細(xì)胞，并且生產(chǎn)的胚胎質(zhì)量更高[8]。

表1 部分牛的OPU實(shí)驗(yàn)Table 1 Some of bovine OPU experiments

2.2 影響IVP 的因素

IVP 是牛胚胎生產(chǎn)中最復(fù)雜的一步，圖4 顯示了牛卵母細(xì)胞體外受精后胚胎的發(fā)育過程，即受精卵階段、2 細(xì)胞階段、4 細(xì)胞階段、8 細(xì)胞階段、16 細(xì)胞階段、32細(xì)胞階段、囊胚階段以及孵化囊胚階段。以成熟的牛卵母細(xì)胞與精子結(jié)合那一刻為0 d 算起，受精卵經(jīng)過7～8 d 可以發(fā)育成可供移植的囊胚，經(jīng)過8～9 d可發(fā)育到孵化囊胚階段。通過OPU收集的卵母細(xì)胞需要經(jīng)過22～24 h 的體外培養(yǎng)（IVC）才能夠成熟。成熟的卵母細(xì)胞經(jīng)過體外受精（IVF）形成受精卵，受精卵在體外需要經(jīng)過7～8 d才能發(fā)育成可供移植的胚胎[10]。從圖4 可以看出，整個(gè)IVP過程都在體外進(jìn)行，相較于母體環(huán)境，體外培養(yǎng)環(huán)境是次優(yōu)的，因此理論上IVP 過程的每一步操作都會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響。

圖4 體外生產(chǎn)的牛胚胎發(fā)育過程Fig.4 Developmental procedure of bovine embryos produced in vitro

卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）是IVP的第一步，卵母細(xì)胞成熟的質(zhì)量直接決定著后續(xù)IVP的成敗。任何細(xì)胞的生長(zhǎng)都離不開充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、適宜的溫度和合理的氣相（氧氣和二氧化碳濃度）環(huán)境。牛卵母細(xì)胞IVM需要非常全面的營(yíng)養(yǎng)供給，目前最常用的培養(yǎng)基是TCM199 培養(yǎng)基（組織培養(yǎng)基）。此外，培養(yǎng)基中需要添加比例均衡的營(yíng)養(yǎng)因子比如胎牛血清、卵泡刺激素、黃體生成素、雌二醇和表皮生長(zhǎng)因子等，否則卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育將會(huì)受到影響[11]。溫度和二氧化碳對(duì)卵母細(xì)胞的成熟也非常重要，溫度和二氧化碳含量過高或者過低都會(huì)抑制卵母細(xì)胞成熟（表2），通常在牛卵母細(xì)胞成熟的環(huán)境中，溫度應(yīng)該控制在38～39 ℃，二氧化碳含量控制在5%[10]。

體外受精（IVF）是緊隨IVM的另一個(gè)關(guān)鍵步驟，完全成熟的卵母細(xì)胞才能有較高的受精率，因此上述影響卵母細(xì)胞成熟的因素都會(huì)對(duì)受精效率產(chǎn)生影響。精子的質(zhì)量和濃度也是決定受精質(zhì)量的關(guān)鍵因素。在開展商業(yè)化的OPU/IVP技術(shù)實(shí)踐時(shí)，通常先將公牛精液在屠宰場(chǎng)來源的卵母細(xì)胞上進(jìn)行受精測(cè)試，以確定精液的最佳受精濃度。此外，精液的處理方式、受精環(huán)境以及外源因子也會(huì)對(duì)受精效率產(chǎn)生影響[12]。

體外培養(yǎng)（IVC）是整個(gè)IVP 過程中的最后一步，也是整個(gè)IVP 階段最復(fù)雜的一步。影響體外胚胎發(fā)育的因素有很多，目前關(guān)于影響胚胎IVC的因素也還有很多未解之謎。受精卵自身的質(zhì)量是影響體外胚胎發(fā)育的直接因素，研究發(fā)現(xiàn)有卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞受精后的囊胚率要遠(yuǎn)比裸卵受精后的囊胚率高，而且卵丘細(xì)胞越完整囊胚率越高。另外，培養(yǎng)體系也是關(guān)系體外胚胎發(fā)育質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。最常用的IVC體系是用TCM199培養(yǎng)基或合成輸卵管液（synthetic oviduct fluid, SOF）培養(yǎng)基與各種類型的細(xì)胞如輸卵管細(xì)胞、水牛鼠肝細(xì)胞、Vero細(xì)胞、顆粒細(xì)胞或條件培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)。近年來，多數(shù)共培養(yǎng)體系已被放棄，取而代之的是低氧無細(xì)胞培養(yǎng)體系。IVC體系在過去幾年中已經(jīng)有了顯著的改進(jìn)，市場(chǎng)上已有多種商業(yè)化的培養(yǎng)基。除此之外，其他環(huán)境因素如培養(yǎng)的環(huán)境溫度、氣相（氧氣和二氧化碳濃度）都會(huì)對(duì)體外胚胎的發(fā)育有影響（表2）。研究發(fā)現(xiàn)，溫度為38.5～39.0 ℃，氮?dú)夂靠刂圃?0%，二氧化碳和氧氣含量均為5%的培養(yǎng)環(huán)境更有利于牛胚胎的發(fā)育[13]。

表2 部分牛的IVP實(shí)驗(yàn)Table 2 Some of bovine IVP experiments

3 OPU/IVP 技術(shù)面臨的問題

3.1 生產(chǎn)效率低

雖然相比傳統(tǒng)的輔助生殖技術(shù)如人工授精（artificial insemination,AI）、超數(shù)排卵和胚胎移植（multiple ovulation and embryo transfer, MOET）技術(shù)等，OPU/IVP技術(shù)繁殖效率高很多（每年AI技術(shù)平均繁殖1頭，MOET技術(shù)繁殖20～25頭，OPU/IVP技術(shù)繁殖80～100頭），但是OPU/IVP技術(shù)的成功率仍然不夠高。表3對(duì)比了不同生殖技術(shù)對(duì)每100枚未成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行移植的成功率。從中可知，相比AI技術(shù)和MOET技術(shù)，OPU/IVP技術(shù)在受精率、囊胚率、妊娠率以及最后產(chǎn)犢的數(shù)目上都要低很多。

表3 不同生殖技術(shù)的相對(duì)成功率Table 3 Relative success rates of different reproductive technologies

3.2 胚胎質(zhì)量低

OPU/IVP 技術(shù)的另一個(gè)問題是胚胎的妊娠率低，與超數(shù)排卵產(chǎn)生的胚胎相比，植入IVP 胚胎的牛妊娠率要低10%～40%。研究表明，只有約27%的IVP 胚胎受體牛能生產(chǎn)出存活小牛，其中約60%的IVP 胚胎的妊娠失敗發(fā)生在胚胎植入后30～40 d。EALY等[22]總結(jié)了胚胎妊娠失敗的原因，發(fā)現(xiàn)1/3 的妊娠失敗是由受體牛相關(guān)的因素引起的，其余2/3 的妊娠失敗則是由胚胎自身的因素引起，其中胚胎的發(fā)育異常是妊娠失敗的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，IVP 的胚胎延長(zhǎng)慢，胎盤直徑變小，卵黃囊發(fā)育受阻。同時(shí)IVP胚胎也會(huì)出現(xiàn)邊緣雙核細(xì)胞和子葉發(fā)育異常以及胎盤血管形成異常等問題，從而大大增加了犢牛出生綜合征發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，對(duì)于上述IVP 胚胎發(fā)育異常的原因還沒有明確的定論，但是有研究指出，OPU 過程中的卵巢刺激、卵泡抽吸，以及IVP 過程中的卵母細(xì)胞成熟、精子處理和胚胎培養(yǎng)這一系列外部的操作都會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生刺激，從而引起胚胎不可逆的表觀遺傳紊亂和基因表達(dá)異常，最終導(dǎo)致IVP 胚胎在發(fā)育上出現(xiàn)各種問題[23]。通過對(duì)比體內(nèi)胚胎生產(chǎn)（IVD）胚胎發(fā)現(xiàn)，IVP胚胎代謝更加旺盛，消耗的葡萄糖和氧氣以及產(chǎn)生的乳酸都比IVD胚胎高[24]。IVP胚胎的超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了一些變化，體外發(fā)育的囊胚與滋養(yǎng)層細(xì)胞之間的連接復(fù)合體發(fā)育不良，滋養(yǎng)層細(xì)胞上的頂端微絨毛發(fā)育不健全，并含有大量脂滴，而且透明帶更薄[25]。此外，在人的胚胎中，染色質(zhì)非整倍體是胚胎著床困難和自然流產(chǎn)的重要原因[26]。在非整倍體細(xì)胞中，染色質(zhì)不穩(wěn)定性（chromosome instability, CIN）的發(fā)生率達(dá)70%～90%，這表明染色質(zhì)不穩(wěn)定性與早期胚胎的死亡率密切相關(guān)。而CIN 的發(fā)生率在牛IVP 胚胎中明顯高于IVD 胚胎[27]。通過OPU/IVP 技術(shù)生產(chǎn)的牛也面臨著同樣的問題。SIQUEIRA 等[28]研究發(fā)現(xiàn)IVP 生產(chǎn)的小牛在90～180 日齡的死亡率更高，而且IVP 生產(chǎn)的奶牛在第一次泌乳時(shí)產(chǎn)生的牛奶量以及牛奶中的脂肪和蛋白質(zhì)含量更少。

4 提高OPU/IVP技術(shù)生產(chǎn)效率的途徑

4.1 提高卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量

提高活體采卵中卵母細(xì)胞的數(shù)目和質(zhì)量，可以從根本上解決OPU/IVP 技術(shù)生產(chǎn)效率低的問題。研究結(jié)果顯示，7～10 月齡的小母牛體內(nèi)抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone,AMH）的濃度與活體采卵的卵泡數(shù)量呈正相關(guān)（r=0.647）[29]，因此可以通過檢測(cè)AMH的濃度篩選出卵泡數(shù)量多的母牛進(jìn)行活體采卵，從而提高卵母細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)現(xiàn)卵泡發(fā)育波與促卵泡素（follicle stimulating hormone,FSH）刺激同步化可以顯著提升卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育優(yōu)良率。研究表明，在活體采卵之前對(duì)荷斯坦奶牛進(jìn)行促卵泡素刺激，可以有效提高中等尺寸大小（直徑6～10 mm）卵母細(xì)胞的比例[30]。在實(shí)際生產(chǎn)中OPU 卵母細(xì)胞需運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行體外成熟（IVM）和后續(xù)的生產(chǎn)操作，因此長(zhǎng)距離運(yùn)輸會(huì)影響卵母細(xì)胞成熟的效率和后續(xù)胚胎發(fā)育的潛能。最新研究顯示，在運(yùn)輸中將卵母細(xì)胞存儲(chǔ)在脫離了CO2的卵母細(xì)胞成熟液中，可以明顯提高卵母細(xì)胞的成熟率和胚胎的發(fā)育率[31]。

在整個(gè)體外胚胎生產(chǎn)過程中，卵母細(xì)胞成熟后的質(zhì)量關(guān)乎到胚胎發(fā)育的質(zhì)量。GILCHRIST 等研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)成熟過程中，卵母細(xì)胞內(nèi)的環(huán)腺苷單磷酸（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）含量會(huì)短暫激增，但是這一變化在IVM 過程并沒有發(fā)生，因此在IVM過程中添加cAMP可以提高受精率和囊胚率[32]。顆粒細(xì)胞對(duì)于卵母細(xì)胞的成熟至關(guān)重要，去除顆粒細(xì)胞，會(huì)使卵母細(xì)胞成熟率下降55.5%[33]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Mx1 和STC1 可以作為衡量卵母細(xì)胞質(zhì)量的分子標(biāo)記，因此可以通過篩選帶有Mx1和STC1標(biāo)記的卵母細(xì)胞來篩選出高質(zhì)量的成熟卵母細(xì)胞，從而提高生產(chǎn)效率[34]。此外，卵母細(xì)胞成熟液或胚胎培養(yǎng)液中補(bǔ)充胞外囊泡也可以提高卵母細(xì)胞成熟率和囊胚發(fā)育率[35]。

4.2 選擇優(yōu)質(zhì)精子

精子攜帶著胚胎發(fā)育的另一半DNA，它與胚胎發(fā)育密切相關(guān)。精子的活力對(duì)于體外受精（IVF）極為重要。研究顯示，相比于凍精，5 ℃下冷藏24 h的精子在牛胚胎發(fā)育中有更好的效果[36]。同等活力的精子，因其父本來源不同，對(duì)胚胎發(fā)育的影響也參差不齊。因此，如何衡量精子的品質(zhì)顯得尤為重要。最新研究發(fā)現(xiàn)，精子轉(zhuǎn)錄組分析顯示，線粒體轉(zhuǎn)錄因子B2（transcription factor B2 of mitochondria,TFB2M）和體細(xì)胞細(xì)胞色素C（cytochrome C of somatopiasm,CYCS）在高受胎率的公牛精子中表達(dá)顯著上調(diào)[34]。此外，TFB2M敲低也會(huì)顯著減少囊胚的發(fā)育率，這都暗示著它可以作為篩選優(yōu)良精子的分子標(biāo)記[37]。

4.3 優(yōu)化IVP 技術(shù)體系

胚胎培養(yǎng)是整個(gè)IVP 環(huán)節(jié)中最復(fù)雜的一環(huán)，大量的研究針對(duì)胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行了優(yōu)化，以期模擬體內(nèi)胚胎相似的生存環(huán)境。胚胎培養(yǎng)過程中，添加雌性生殖液體（輸卵管和子宮分泌物）可以提高胚胎的發(fā)育質(zhì)量，出生犢牛的異常率也顯著降低[38]。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)，通過包埋技術(shù)可以模擬出胚胎在子宮發(fā)育過程中的漂浮狀態(tài)，這種更接近母體的狀況可以提高胚胎的發(fā)育能力和質(zhì)量[39]。培養(yǎng)過程中添加生長(zhǎng)因子如白介素6（interleukin-6,IL-6）等也可以顯著增大囊胚內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目，從而顯著提高囊胚發(fā)育質(zhì)量[40]。

5 小結(jié)與展望

OPU/IVP 技術(shù)具有快速擴(kuò)繁的顯著優(yōu)勢(shì)，它可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的可供移植的胚胎，相較于傳統(tǒng)的體內(nèi)胚胎移植技術(shù)，通過IVP 技術(shù)產(chǎn)生的胚胎數(shù)目和母牛妊娠率都要高出3 倍多[19]，從而實(shí)現(xiàn)了充分利用優(yōu)質(zhì)母牛的遺傳資源的目的。此外，全基因選擇育種與OPU/IVP 繁殖技術(shù)相結(jié)合可以進(jìn)一步減少奶牛的世代間隔，便于生產(chǎn)高遺傳性狀的犢牛[41]。因此，在未來的牛繁殖管理過程中，OPU/IVP技術(shù)將發(fā)揮重要作用。

當(dāng)然，OPU/IVP 技術(shù)仍然存在很多缺點(diǎn)和不足。在未來發(fā)展中，OPU/IVP技術(shù)需要克服的主要障礙是生產(chǎn)效率低、成本高及妊娠和犢牛的異常問題。如果OPU/IVP技術(shù)的效率提高一倍，則每個(gè)胚胎的培養(yǎng)成本將會(huì)減半。高妊娠率必然需要選擇最佳時(shí)間、最佳發(fā)情階段和最佳質(zhì)量的胚胎[42]。前沿技術(shù)如高通量深度測(cè)序和代謝組學(xué)的發(fā)展，將有助于高質(zhì)量卵母細(xì)胞和胚胎所需的條件的優(yōu)化。此外，培養(yǎng)基配方的改進(jìn)和動(dòng)態(tài)化培養(yǎng)系統(tǒng)的實(shí)施也將創(chuàng)造出更加貼近母體子宮的內(nèi)環(huán)境，從而盡可能地減少胚胎發(fā)育異常情況的出現(xiàn)[43]。

在未來，中國(guó)是乳制品和牛肉產(chǎn)品量增長(zhǎng)最快的市場(chǎng)，但是目前中國(guó)的牛養(yǎng)殖水平與發(fā)達(dá)國(guó)家還存在一定差距，優(yōu)良種畜主要依賴于國(guó)外進(jìn)口，而且OPU/IVP 技術(shù)在中國(guó)的應(yīng)用也僅僅處于起步階段。為了減少對(duì)海外市場(chǎng)的依賴，提高牛養(yǎng)殖的整體水平，中國(guó)需要建立起自己的優(yōu)良種畜繁殖體系。OPU/IVP 技術(shù)是目前較成熟的繁殖技術(shù)，因此，為了擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)種畜的規(guī)模，中國(guó)需要一批熟練操作OPU/IVP 技術(shù)的技術(shù)人員。繁殖效率是制約養(yǎng)殖規(guī)模的重要因素，因此OPU/IVP技術(shù)作為主要的繁殖技術(shù)在中國(guó)未來牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)潛力巨大。