楊穎茵 李凌華

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院感染病中心，廣州 510060

隱球菌是一種廣泛存在于自然界的機會性致病真菌，主要感染免疫功能不全的人群，它能突破血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)腦膜炎。據(jù)統(tǒng)計，隱球菌腦膜炎在全球范圍內(nèi)的年發(fā)病人數(shù)約23萬，其中有約18 萬例患者死亡。 近年來，關(guān)于隱球菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)致病機制的研究取得了重大進展，隱球菌侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要毒力因子和突破血腦屏障的途徑被相繼發(fā)現(xiàn)。 本文就隱球菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)致病機制的最新研究進展綜述如下。

一、 隱球菌侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機制

隱球菌能夠利用細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運機制、跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運機制和“特洛伊木馬”機制突破血腦屏障防御，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。

1.細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運機制

細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運是指病原微生物經(jīng)細(xì)胞間隙穿過血腦屏障。 隱球菌分泌的尿素酶是其經(jīng)細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要毒力因子。 尿素酶能將尿素分解為高毒性的氨，血氨濃度的增加會破壞腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）的緊密連接，影響血腦屏障的完整性，以利于隱球菌經(jīng)細(xì)胞間隙進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。 當(dāng)對感染野生型隱球菌的小鼠注射尿素酶抑制劑時，大腦內(nèi)隱球菌數(shù)量顯著減少。 與野生型隱球菌相比，尿素酶基因突變株不能明顯破壞血腦屏障的ZO-1 連接蛋白， 感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力顯著減弱。

隱球菌還能利用宿主的纖溶蛋白溶解系統(tǒng)破壞BMECs 的緊密連接， 經(jīng)細(xì)胞間隙侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。 研究發(fā)現(xiàn)，血漿中富含的纖溶酶原能黏附在隱球菌表面，在纖溶酶原激活因子和尿激酶等作用下被激活為纖溶酶。 纖溶酶還能激活基質(zhì)金屬蛋白酶，兩者共同分解細(xì)胞外基質(zhì)，使細(xì)胞間隙疏松，有利于隱球菌穿過血腦屏障。 進一步研究表明，隱球菌可誘導(dǎo)BMECs 分泌尿激酶， 使用尿激酶抑制劑或干擾尿激酶基因的表達均能抑制纖溶酶原活化，從而減弱隱球菌對血腦屏障的侵襲能力。 另有研究發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞表達的S100A10 鈣結(jié)合蛋白是纖溶酶原受體，通過改變纖溶酶原蛋白的空間構(gòu)象使其更易被尿激酶激活。 隱球菌可誘導(dǎo)BMECs 表達S100A10 蛋白，協(xié)助尿激酶激活纖溶酶原，最終使菌體更易穿過血腦屏障。

2.跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運機制

跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運是隱球菌直接被BMECs 內(nèi)吞后，由膜性小泡包裹轉(zhuǎn)運至細(xì)胞對側(cè)，隨后通過胞吐至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。 研究發(fā)現(xiàn)，莢膜的透明質(zhì)酸是隱球菌跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運過程中的重要毒力因子。 透明質(zhì)酸與BMECs 質(zhì)膜脂筏中的CD44 跨膜蛋白受體結(jié)合后，激活 Ras 同源基因家族成員 A （RhoA）、Ras 相關(guān)的C3 肉毒素底物 （Rac1） 和細(xì)胞分裂周期蛋白42（Cdc42）等Rho GTP 酶，隨后引起局部黏著斑激酶（FAK）、埃茲蛋白（ezrin）和蛋白激酶 C α（PKCα）等下游信號蛋白的磷酸化， 導(dǎo)致BMECs 肌動蛋白骨架結(jié)構(gòu)重組，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，從而有利于隱球菌黏附BMECs，最終經(jīng)脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進入細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。 脂筏上的小窩蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶DYRK3 在脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞及轉(zhuǎn)運過程也起著重要作用。 與野生型隱球菌相比，透明質(zhì)酸編碼基因CPS1 突變株莢膜明顯縮小， 透明質(zhì)酸含量降低，且對BMECs 的黏附率下降，感染小鼠的存活時間增長。 在小鼠隱球菌感染模型中， CD44 敲除小鼠大腦的真菌負(fù)荷較野生型小鼠明顯降低。

Vu 等發(fā)現(xiàn)隱球菌分泌的金屬蛋白酶Mpr1 可以促進菌體與BMECs 的黏附， 從而有利于隱球菌侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。 當(dāng)隱球菌缺乏Mpr1 時，BMECs的膜褶皺明顯減少， 導(dǎo)致Mpr1 突變株不能黏附于BMECs 表面， 感染小鼠的大腦內(nèi)真菌負(fù)荷減少，小鼠存活率顯著提高。 此外，單獨表達隱球菌Mpr1 的釀酒酵母獲得了穿越BMECs 的能力， 鑒于釀酒酵母自身不能表達透明質(zhì)酸， 故Mpr1 可能獨立于透明質(zhì)酸-CD44 途徑在隱球菌跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮作用。 Na Pombejra 等進一步研究發(fā)現(xiàn)，Mpr1 通過靶向質(zhì)膜和細(xì)胞骨架重塑相關(guān)蛋白誘導(dǎo)BMECs 細(xì)胞骨架重塑，從而促進隱球菌跨越BMECs。 在Mpr1誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架重塑中，BMECs 的表面蛋白Annexin A2（ANXA2）起著核心作用：一方面，隱球菌誘導(dǎo)宿主表達ANXA2 并抑制其活化， 引起下游活化的絲切蛋白confilin 去磷酸化， 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架改變細(xì)胞表面形態(tài)， 促進隱球菌黏附BMECs；另一方面， 隱球菌穿越BMECs 的過程依賴ANXA2伴侶蛋白S100A10。 S100A10 通過調(diào)節(jié)BMECs的鈣離子濃度改變肌動蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)， 抑制S100A10 表達能明顯降低宿主細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，進而抑制BMECs 對隱球菌的吞噬和非溶解胞吐，同時ANXA2 能發(fā)揮穩(wěn)定S100A10的作用，從而間接調(diào)節(jié)隱球菌穿越血腦屏障的過程。 隱球菌分泌的磷脂酶B1 還能與BMECs 膜脂質(zhì)相互作用，激活Rac1及其關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）通路，引起細(xì)胞肌動蛋白骨架結(jié)構(gòu)重塑， 促進隱球菌穿越BMECs。此外，隱球菌還可以誘導(dǎo)BMECs 表達Pdlim2 蛋白，Pdlim2 蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架促進隱球菌在BMECs 的轉(zhuǎn)運和排出。

除了隱球菌與BMECs 直接相互作用外， 隱球菌還能分泌直徑為100~200 nm 的微囊泡， 微囊泡離開菌體后與BMECs 融合， 誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜上的脂筏結(jié)構(gòu)重新排布， 從而促進隱球菌與細(xì)胞黏附融合， 增強其侵襲血腦屏障的能力， 且隱球菌對BMECs 的黏附和融合程度呈微囊泡劑量依賴性。

3.“特洛伊木馬”機制

“特洛伊木馬” 機制是病原體通過寄生的巨噬細(xì)胞穿越血腦屏障。 Charlier 等表明，游離隱球菌感染小鼠的腦部細(xì)菌載量明顯低于寄生于單核巨噬細(xì)胞的隱球菌組。 此外，通過注射氯膦酸鹽清除單核巨噬細(xì)胞能夠顯著減輕隱球菌腦膜炎程度，腦部真菌負(fù)荷顯著降低。Santangelo 等發(fā)現(xiàn)隱球菌磷脂酶突變株不能入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但注射含有該突變株的單核細(xì)胞則能造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。 以上研究表明，隱球菌能利用單核巨噬細(xì)胞作為一種載體和偽裝工具，逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)測，有利于在宿主體內(nèi)播散和入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

隱球菌通過“特洛伊木馬”機制進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的首要條件是在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖。 巨噬細(xì)胞主要分為經(jīng)典活化的M1 型巨噬細(xì)胞和選擇性活化的M2 型巨噬細(xì)胞。M1 型巨噬細(xì)胞起到促進炎癥發(fā)生發(fā)展、殺菌及吞噬等作用；M2 型巨噬細(xì)胞則具有抗炎作用，在血管生成和傷口愈合中起關(guān)鍵作用，但不具有抗隱球菌作用。隱球菌分泌的熱休克蛋白 70 同源物 Ssa1， 通過刺激IL-4 和 IL-13 的產(chǎn)生，促進巨噬細(xì)胞向M2 型分化，以利于隱球菌在胞內(nèi)存活，并將其作為逃避宿主識別及殺滅的保護性媒介。莢膜在隱球菌胞內(nèi)生存中發(fā)揮重要作用。無莢膜突變株不能在巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖，但在突變株表面加入莢膜主要成分葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖后可以恢復(fù)其胞內(nèi)的存活能力。 莢膜多糖具有抗氧化性，隱球菌通過增大莢膜來抵抗巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧化物和抗菌肽的殺傷作用。此外，吞噬體酸化是巨噬細(xì)胞殺死胞內(nèi)病原體的關(guān)鍵機制之一。莢膜多糖中的葡萄糖醛酸殘基可以緩沖吞噬體酸化，從而抵抗吞噬體酸化對隱球菌的殺傷作用。 隱球菌尿素酶分解尿素形成的氨也可以提高吞噬溶酶體內(nèi)的pH，抑制溶酶體酸化。 隱球菌磷脂酶B1 可以水解膜上的脂質(zhì)造成吞噬體膜通透性增加，有利于隱球菌從吞噬體外獲得營養(yǎng)物質(zhì)來生存繁殖，并且抗菌物質(zhì)等吞噬體內(nèi)容物外流會降低對隱球菌的殺傷作用。 黑色素也是隱球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存的重要毒力因子，其通過清除吞噬體內(nèi)活性氧和活性氮增強隱球菌的氧化應(yīng)激耐受能力。隱球菌利用漆酶合成黑色素， 同時漆酶本身也是毒力因子，研究表明，高活性漆酶能增強巨噬細(xì)胞對菌體的攝取和非溶解性胞吐，這過程與黑色素產(chǎn)生無關(guān)。

二、 隱球菌在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生存的機制

另一個隱球菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的條件，即能在營養(yǎng)缺乏的腦脊液中生存繁殖。 Chen 等發(fā)現(xiàn)隱球菌體外腦脊液中生長時碳水化合物轉(zhuǎn)運蛋白高度表達，表明隱球菌在營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中能高效利用營養(yǎng)物質(zhì)。 Lee 等研究了隱球菌體內(nèi)轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)參與營養(yǎng)感應(yīng)和代謝的基因?qū)﹄[球菌在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中生存至關(guān)重要。 哺乳動物大腦含有高濃度的肌醇，與其他真菌僅有1~2 個肌醇轉(zhuǎn)運蛋白基因相比， 隱球菌具有超過10 個成員的肌醇轉(zhuǎn)運蛋白基因家族， 能幫助菌體高效獲取肌醇作為碳源進行生長。 Wang 等對從隱球菌腦膜腦炎患者的腦脊液中分離的菌體進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果表明肌醇分解代謝途徑中的肌醇加氧酶高度表達，該酶能將肌醇轉(zhuǎn)化為莢膜的組成部分葡萄糖醛酸，導(dǎo)致隱球菌莢膜增厚，增強菌株毒力及抗逆性。 此外，肌醇轉(zhuǎn)化的葡萄糖醛酸可能是二磷酸尿苷（UDP）葡萄糖醛酸的前體，而UDP 葡萄糖醛酸可用于合成透明質(zhì)酸，增強隱球菌利用跨膜轉(zhuǎn)運機制進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力。 當(dāng)隱球菌缺乏Itr1a 和Itr3c 這兩種主要的肌醇轉(zhuǎn)運蛋白時， 隱球菌透明質(zhì)酸含量降低，感染小鼠腦部的菌荷量顯著減少。 哺乳動物大腦還富含酚類物質(zhì)，隱球菌分泌的漆酶能催化多巴胺等酚類物質(zhì)合成黑色素， 以此抵抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不利條件。 近期研究表明， Hob1 是隱球菌中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能控制漆酶和肌醇轉(zhuǎn)運蛋白Itr1a、Itr3c 的表達。 與野生型新型隱球菌相比， Hob1 突變株感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力顯著減弱，感染小鼠存活率增加。然而，Hob1 的缺失對主要感染肺部的Cryptococcus deuterogattii 的菌株毒力無明顯影響。

三、 結(jié)語

隱球菌及其宿主的多種因素參與了隱球菌腦膜炎的發(fā)生和發(fā)展。 隱球菌的透明質(zhì)酸、莢膜、尿素酶等多種毒力因子，協(xié)助其通過細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運、跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運和“特洛伊木馬”機制突破血腦屏障防御，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成感染。 此外，腦部特殊的環(huán)境也為隱球菌的生存繁殖提供了有利條件。 深入研究上述致病機制有利于加深臨床醫(yī)師對隱球菌腦膜炎的認(rèn)識，為該病的診斷與治療提供新的思路。

利益沖突