柳倩，潘丁晨，杜樂，黃河，蔣國靜*

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指女性跟同一性伴侶，在妊娠28周以內(nèi)出現(xiàn)兩次或兩次以上的妊娠丟失，妊娠終止時胎兒體重不足1 000 g[1]。歐洲人類生殖和胚胎學(xué)學(xué)會認為，臨床若發(fā)生兩次妊娠丟失即要考慮診斷為RSA，其會影響1%～2%夫婦的生殖健康[2]，已知的病因包括血栓形成傾向、內(nèi)分泌代謝紊亂、解剖結(jié)構(gòu)異常，以及免疫、遺傳、不良生活方式等[3]，除以上外仍無法找到病因的患者屬于不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。一項研究調(diào)查了2011年1月至2017年8月就診于哥倫比亞婦女醫(yī)院的RSA患者，發(fā)現(xiàn)URSA患者約占40%～50%[4]。Notch信號通路屬于進化保守的細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，參與生長發(fā)育和細胞的分化、增殖、凋亡等[5]。Notch信號通路通過介導(dǎo)內(nèi)皮細胞和壁細胞(又稱周細胞)形成，維持血管系統(tǒng)[6]，調(diào)節(jié)胚胎滋養(yǎng)層侵襲母體子宮組織[7]，促進子宮內(nèi)膜蛻膜化[8]，在母胎界面滋養(yǎng)層侵襲與螺旋動脈重塑方面尤為顯著，與URSA等病理妊娠狀態(tài)密切相關(guān)。

1 Notch信號通路

Notch家族包括Notch(1～4)四種受體以及五種配體：Delta樣配體(DLL1、3、4)和鋸齒樣配體(Jagged1、2)[9]。其中，Notch1、2參與生長發(fā)育過程，而Notch3、4廣泛表達于血管系統(tǒng)的細胞亞群中，包括平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞[10]。Notch受體前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中經(jīng)歷廣泛的翻譯和修飾[11]，成熟后成為細胞表面的跨膜受體。Notch1～Notch4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基本一致，但靶基因和效應(yīng)蛋白不盡相同，經(jīng)典基因靶點有分裂增強子(HES)和與HES相關(guān)的YRPW基序(HEY)[12]等。

經(jīng)典的Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程始于受體與鄰近細胞表面以反式表達的膜結(jié)合配體結(jié)合，配體被泛素化，通過類似胞吞、機械拉伸的作用促進配受體結(jié)合，受體在整合素金屬蛋白酶10(ADAM10)和γ-分泌酶的作用下發(fā)生蛋白水解[13]，使其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被釋放到胞質(zhì)溶膠中，進入細胞核與核轉(zhuǎn)錄抑制子(recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region，RBPJ)和Mastermind-like的輔助激活劑(mastermind like transcriptional coactivator，MAML)蛋白家族相互作用形成Notch輔激活子復(fù)合物[14]。

非經(jīng)典的Notch信號中，受體也可以被非經(jīng)典的配體或在沒有配體的情況下激發(fā)，Notch受體無需切割產(chǎn)生胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，甚至有些非經(jīng)典途徑無需RBPJ的參與，可以與其他胞核、胞質(zhì)的效應(yīng)物相互作用[11]。目前非經(jīng)典的Notch信號通路在腫瘤學(xué)中的研究有較新進展，不過在病理性妊娠或妊娠并發(fā)癥的相關(guān)機制研究中幾乎沒有涉及。

2 滋養(yǎng)層侵襲

2.1 胚胎植入與滋養(yǎng)層侵襲

胚泡的種植包括定位、黏附、穿透三個過程；人類胚胎的極端滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜的黏附需要表達于胚泡或子宮內(nèi)膜表面相關(guān)細胞因子及黏附分子配受體的結(jié)合，促進胚泡與子宮內(nèi)膜接觸，滋養(yǎng)層細胞穿透內(nèi)膜上皮，侵入子宮內(nèi)膜間質(zhì)，達到母體血管[15]，參與母體螺旋動脈重塑，屬于胎盤形成的一部分，促進胎盤形成前母胎物質(zhì)交換。滋養(yǎng)層逐漸分化為細胞滋養(yǎng)層(cytotrophoblasts，CTB)和合體滋養(yǎng)層(syncytiotrophoblasts，STB)，與胚外中胚層共同構(gòu)成胚胎的絨毛膜結(jié)構(gòu)[16]。

2.2 Notch信號通路與滋養(yǎng)層侵襲

Notch信號通路在滋養(yǎng)層的作用既表現(xiàn)為促進CTB不斷向絨毛外滋養(yǎng)層(extravillous trophoblasts,EVTs)分化，并影響小鼠胚胎滋養(yǎng)層干細胞樣祖細胞(trophoblast stem cell-like progenitor cells，TSPCs)自我更新的過程，促進滋養(yǎng)層向子宮內(nèi)膜侵襲。目前的研究涉及Notch配受體及靶基因分子在胚胎組織的定位、與細胞因子的調(diào)控、互作以及具體通路機制。

Notch信號通路的相關(guān)配受體在人類胚泡的內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞中廣泛表達，與細胞滋養(yǎng)層向EVTs的分化相關(guān)：Notch1、3和DLL1在CTB和STB中都有表達，Notch2、4和Jagged1、2僅定位于STB中[17]；體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)未分化的小鼠滋養(yǎng)層干細胞表達Notch家族的所有成員，免疫熒光標記母胎界面的Notch配受體，發(fā)現(xiàn)人類胚胎CTB不表達Notch1，且隨著滋養(yǎng)層侵襲Notch2表達上調(diào)、Notch4表達下調(diào)；DLL1在鄰近滋養(yǎng)層的間質(zhì)和血管腔室中表達，DLL4在CTB侵襲延伸的細胞柱中逐漸增加，卻在其侵入子宮壁后迅速下調(diào)，Jagged1在滋養(yǎng)層分化侵襲的早期階段是缺失的，卻在母體螺旋動脈相關(guān)的CTB中顯著上調(diào)[7]。以上研究中，Notch配受體在不同組織中的表達差異，可能反應(yīng)了其功能差異，例如Notch2、4和DLL4的動態(tài)變化說明Notch2、4調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層侵襲的先后順序，DLL4可能與細胞滋養(yǎng)層向合體滋養(yǎng)層的分化遷移有關(guān)。

早期妊娠的建立涉及母胎界面廣泛的血管重構(gòu)、滋養(yǎng)層侵襲、及聚集于螺旋動脈周圍的蛻膜NK細胞間的相互作用，Notch信號通路在其中都有參與，如動脈血的高氧狀態(tài)與蛻膜NK細胞促進滋養(yǎng)層侵襲血管[18]。EphrinB2是血管內(nèi)皮細胞的標記物之一，研究發(fā)現(xiàn)DLL4-Notch信號可以彌補EphrinB2表達缺失的HTR-8/SVneo細胞株的遷移和侵襲[19]。γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域切割和釋放，抑制其活性[20]，研究發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細胞的侵襲受表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7(EGFL7)的調(diào)節(jié)，EGFL7與Notch1在JEG3細胞(人絨毛膜癌細胞)中表達促進細胞遷移；γ-分泌酶抑制劑的存在下，過度表達EGFL7的滋養(yǎng)層細胞對基底膠的侵襲減弱[21]。小鼠胎盤滋養(yǎng)層侵襲過程中Notch2受體的條件性缺失損害了動脈侵襲，使母體血流量減少了30%～40%，胎盤灌注減少了23%[7]。

已經(jīng)有研究表明Notch1是促進人胎盤絨毛外滋養(yǎng)層祖細胞增殖和存活的關(guān)鍵因素；另一方面，它又抑制TEAD4(TEA Domain Transcription Factor4)和p63基因表達對合體滋養(yǎng)層化的作用，這兩種調(diào)節(jié)作用控制CTB自我更新[22]。轉(zhuǎn)錄因子TEAD4選擇性在胚胎植入早期的小鼠胚胎TSPCs中表達，缺失的小鼠在妊娠9 d之前發(fā)生胚胎死亡。此外，通過收集URSA患者的胎盤，發(fā)現(xiàn)其絨毛形成的缺陷——僅存單一的滋養(yǎng)層斑塊或缺乏滋養(yǎng)層細胞，滋養(yǎng)層柱受損。所以推測與胎盤絨毛形成缺陷相關(guān)的URSA與TSPCs中轉(zhuǎn)錄因子TEAD4的表達缺失相關(guān)[23]。

3 蛻膜化及母胎界面血管重建

狹義的蛻膜化是指子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖分化為蛻膜基質(zhì)細胞，糖原、脂滴和分泌顆粒在胞質(zhì)中積累，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體擴張[15-16]，形成分泌型子宮內(nèi)膜。廣義的蛻膜化還包括血管重塑、子宮腺上皮細胞分泌增多、免疫細胞募集和分化[24]，其中，母胎界面的血管重建主要包括子宮螺旋動脈重塑和蛻膜毛細血管形成，Notch信號通路在其中發(fā)揮重要作用。

內(nèi)皮細胞和周細胞不僅構(gòu)成血管，也體現(xiàn)血管功能。VEGF、Notch信號通路共同協(xié)調(diào)血管內(nèi)皮細胞形成“芽”“莖”的功能；周細胞又稱為Rouget細胞(該細胞由Charles Rouget發(fā)現(xiàn)并命名)、壁細胞，位于血管基底膜內(nèi)，胞核突出，胞質(zhì)細長突起，沿血管走向包圍其表面并延伸至鄰近血管，維持微血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)、促進血管發(fā)育和成熟[25]。Notch信號通路通過周細胞募集和分化調(diào)節(jié)血管功能[26]；周細胞中Notch信號的丟失降低了血小板衍生生長因子受體的水平，增加了周細胞凋亡[27]，并且，周細胞被認為是血管平滑肌細胞的前體[26]。目前的研究已明確Notch信號通路調(diào)控血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的命運：新的血管形成時，尖端表型內(nèi)皮細胞形成新的血管分支，而拖尾的莖細胞分化增殖形成管狀結(jié)構(gòu)，是因為Notch受體與不同的配體結(jié)合后產(chǎn)生不同的效應(yīng)——高表達DLL膜蛋白的內(nèi)皮細胞形成血管芽，高表達Jagged膜蛋白的內(nèi)皮細胞形成血管莖[28]，其中，DLL4在調(diào)控與妊娠相關(guān)的蛻膜血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。新的研究發(fā)現(xiàn)，Notch受體表達水平的高低可能更具意義，且與內(nèi)皮細胞表達的血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)和趨化因子受體4(CXCR4)相關(guān)，而DLL4缺失的內(nèi)皮頂端細胞的功能并不受影響[30]。此外，血管平滑肌細胞表達的Notch受體與配體Jagged1結(jié)合，促進了其本身的進一步增殖和分化[31-32]。

3.1 Notch信號通路與子宮螺旋動脈重塑

螺旋動脈重塑是EVTs與子宮螺旋動脈相互作用的結(jié)果。絨毛結(jié)構(gòu)是母胎血管系統(tǒng)的一部分，也是胎盤形成過程中的一部分。EVTs侵入母體蛻膜，破壞了子宮螺旋動脈的收縮性，表現(xiàn)為動脈壁內(nèi)血管平滑肌細胞逐漸被纖維組織和EVTs取代[15]，研究表明其與蛻膜NK細胞和EVTs分泌的血管生成素1、2(Angiopoietin,Ang)直接作用于血管平滑肌細胞有關(guān)[33]。

滋養(yǎng)細胞直接調(diào)控血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換，其衍生的血小板衍生因子BB(PDGF-BB)是調(diào)節(jié)因子之一，大鼠子宮腺α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達量可以反映平滑肌細胞被破壞的程度[34]。孕酮和絨毛膜促性腺激素激活Notch1通路，Notch1通過啟動基質(zhì)細胞向蛻膜細胞的分化來促進α-SMA的表達并抑制基質(zhì)細胞的凋亡——通過向卵母細胞供體子宮內(nèi)輸注人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)，使腺體和蛻膜基質(zhì)Notch1蛋白表達水平顯著增加，編碼α-SMA的ACTA2基因?qū)m內(nèi)hCG的反應(yīng)顯著增加，而ACTA2是Notch4的靶基因之一，體現(xiàn)了Notch信號通路在其中的作用網(wǎng)絡(luò)[35]。

母胎界面的白細胞也參與子宮內(nèi)膜蛻膜化中的螺旋動脈重塑：在妊娠期間，子宮自然殺傷細胞在蛻膜積累，又稱為蛻膜自然殺傷細胞，在滋養(yǎng)細胞侵襲和子宮螺旋動脈重塑期間大量聚集[36]。蛻膜NK細胞與Notch信號通路雖然分別屬于細胞水平和分子水平，但其作用在血管重塑方面有所交叉，而二者之間的關(guān)系尚未明確。目前有研究發(fā)現(xiàn)雙花扁豆凝集素(DBA)染色陽性的蛻膜NK細胞表達DLL1，蛻膜NK細胞促進蛻膜非平面血管的生成[37]；DLL1和DLL4與人類蛻膜NK細胞的相應(yīng)受體結(jié)合后，Notch信號通路被激活，促進蛻膜NK細胞產(chǎn)生IFNγ和血管生成因子，與母胎界面的血管修飾相關(guān)[38]。此外，Notch與VEGF信號通路在血管生成中的相互作用被廣泛研究[39-40]，Notch信號通路與血管內(nèi)皮生長因子及其受體和血管生成素在母胎界面相互作用，促進蛻膜血管系統(tǒng)發(fā)育。多氯聯(lián)苯混合物Aroclor 1254(A-1254)是一種有毒物質(zhì)，可以通過Notch4/DLL4/HEY2通路，誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞三維管形成的破壞，使小鼠胎盤和人滋養(yǎng)層或內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)表達被抑制[41]。此外，Notch信號通路在3種人原代內(nèi)皮細胞系(人臍靜脈內(nèi)皮細胞、人動脈內(nèi)皮細胞和人微血管內(nèi)皮細胞)中皆誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR3)轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)表達，內(nèi)皮細胞中VEGFR3的反式激活需要Notch/RBPJ結(jié)合位點[42]。

3.2 Notch信號通路與蛻膜毛細血管新生

除了子宮螺旋動脈的重塑，蛻膜新生毛細血管網(wǎng)也對胚胎植入后的生長發(fā)育至關(guān)重要，Notch信號通路中關(guān)鍵分子、蛋白或酶的缺失引起植入部位的毛細血管系統(tǒng)發(fā)育紊亂。ADAM10是一種Notch通路的調(diào)節(jié)因子，內(nèi)皮細胞定向缺乏ADAM10的雌性A10 δ EC小鼠，具有高度特化的血管結(jié)構(gòu)缺陷，生育能力嚴重低下，蛻膜化過程中血管擴張和重塑受損，妊娠4.5 d的A10 δ EC小鼠子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細胞的核糖核酸測序顯示Notch靶基因(HEY1，HES1)的下調(diào)[43]。運用植入后、胎盤形成前母體內(nèi)皮細胞缺失Jagged1的小鼠，探討母體螺旋動脈和蛻膜毛細血管在胎盤形成前如何支持胚胎發(fā)育，發(fā)現(xiàn)Notch信號通路的效應(yīng)物HEY2和錨蛋白重復(fù)蛋白(NRARP)的表達增加，從而增加了蛻膜重塑血管生成區(qū)域的內(nèi)皮細胞中Notch信號活性，VEGFR2表達減少，該病理變化僅限于植入部位的毛細血管內(nèi)皮細胞[44]。

4 結(jié)語與展望

Notch信號通路參與胚胎種植與蛻膜化機制，其相關(guān)配受體、轉(zhuǎn)錄因子、靶基因在母胎界面廣泛表達和分布，并受雌孕激素及絨毛膜促性腺激素的調(diào)節(jié)和互作，其通路相關(guān)蛋白和負調(diào)節(jié)因子的研究為Notch信號通路在胚胎種植和蛻膜化的作用提供了間接證明。URSA是排除染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、解剖結(jié)構(gòu)異常及抗磷脂抗體綜合征等原因后的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，母胎界面Notch信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)失常導(dǎo)致滋養(yǎng)層侵襲或血管重塑異常均不利于胚胎的順利植入和發(fā)育，是URSA發(fā)病機制的可能性之一。URSA患者妊娠期間螺旋動脈的重塑程度與對照組相比明顯減輕，且與蛻膜NK細胞數(shù)量增加呈大致的同步變化[45]，螺旋動脈壁厚度也明顯增高，與蛻膜NK細胞的密度有關(guān)[46]，說明聚集在蛻膜組織螺旋動脈周圍的NK細胞對螺旋動脈重塑有著關(guān)鍵的作用——Notch信號通路不但參與到滋養(yǎng)層侵襲和螺旋動脈的過程中，甚至有可能通過調(diào)節(jié)NK細胞的功能而發(fā)揮作用，有望據(jù)此進一步展開研究。