覃英梅，王 強(qiáng)，尹 瑋，潘紅丹

（廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院健康管理中心，南寧 530001）

二甲雙胍是目前干預(yù)糖尿病的一線藥物，不僅可降糖、減重，還能保護(hù)神經(jīng)、抗衰老。二甲雙胍可通過減少循環(huán)支鏈氨基酸減輕胰島素抵抗小鼠的抗焦慮和抗抑郁樣反應(yīng)，提示其抗抑郁作用[1]。本研究通過建立糖尿病合并抑郁癥大鼠模型，觀察二甲雙胍對其抑郁行為的影響，并探討可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

45只SD大鼠，SPF級，雄性，8周齡，體質(zhì)量（320±20）g，購自北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0001。

1.2 藥物與試劑

鹽酸二甲雙胍片（國藥準(zhǔn)字H20123035，0.5 g，上海信誼藥廠有限公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），CAS（18883-66-4，成都貝斯特試劑有限公司）；皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）放射免疫分析試劑盒；兔抗大鼠閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、IV型膠原蛋白（type IV collagen，CoIV）一抗（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 儀器

大小鼠自發(fā)活動曠場實(shí)驗(yàn)裝置（上海欣軟信息科技有限公司）；Synergy-HD顯微鏡（日本東芝公司）；CheniDoc XRS凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Biorad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立模型[2]

采用一次性腹腔注射STZ的方式建立糖尿病模型。大鼠腹腔注射STZ（采用pH為4.5的枸櫞酸緩沖液配置為濃度80 g·L-1）65 mg·kg-1，給藥后第1、5、10天后隨機(jī)血糖＞16.70 mmol·L-1，且表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、多尿?yàn)榻３晒?。糖尿病模型建立成功的大鼠采用慢性刺激法建立抑郁模型：每天隨機(jī)從禁食24 h、禁水24 h、夾尾1 min、束縛3 h、4 ℃冰水游泳、45 ℃環(huán)境5 min、每分鐘160次水平振蕩30 min 7種刺激方式中隨機(jī)選1種刺激大鼠，1周中7種刺激均進(jìn)行1次，連續(xù)3周，以大鼠表現(xiàn)為主動性活動減少、興趣缺失、食欲不振為建模成功。

2.2 分組與干預(yù)方式[3]

從45只大鼠中隨機(jī)抽取10只僅注射等量枸櫞酸緩沖液，設(shè)為對照組，其余35只建立糖尿病合并抑郁癥模型，30只建模成功，隨機(jī)分為模型組、實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組，各10只。實(shí)驗(yàn)A、B組腹腔注射二甲雙胍生理鹽水溶液1 mL，用藥劑量分別為150 mg·kg-1、300 mg·kg-1，對照組、模型組腹腔注射等體積生理鹽水。每天1次，連續(xù)干預(yù)4周。

2.3 曠場實(shí)驗(yàn)檢測大鼠自發(fā)活動度[4]

末次干預(yù)后次日，采用曠場實(shí)驗(yàn)測試大鼠運(yùn)動能力。在80 cm×120 cm×100 cm實(shí)驗(yàn)黑箱上方放置全方位攝像頭，將大鼠置于中央，攝像頭記錄大鼠5 min內(nèi)活動影像，計算大鼠總移動距離縮短、移動速度。每只實(shí)驗(yàn)后擦拭、消毒黑箱底面、內(nèi)壁，避免氣味殘留對后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響。實(shí)驗(yàn)前10 min將大鼠帶入實(shí)驗(yàn)房間適應(yīng)環(huán)境，期間保持房間安靜。

2.4 糖水消耗實(shí)驗(yàn)檢測大鼠糖水偏嗜度[5]

造模前訓(xùn)練大鼠逐漸適應(yīng)糖水，末次干預(yù)后次日進(jìn)行糖水消耗實(shí)驗(yàn)。第1天飼喂2瓶1%蔗糖水，第2天將其中1瓶糖水替換為去離子水，第3天禁食、禁水24 h，飼喂去離子水、蔗糖水各1瓶，每瓶100 mL，1 h后檢測去離子水與蔗糖水消耗量（mL），計算糖水偏嗜度（%）=糖水消耗量÷液體總消耗量×100%。

2.5放射免疫分析法檢測下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA）軸活性[6]

糖水消耗實(shí)驗(yàn)完成后采集大鼠腹主動脈血2 mL，冰浴試管中靜置30 min，每分鐘3 000轉(zhuǎn)離心10 min，取血清。采用放射免疫分析法檢測血清CORT、ACTH水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.6 免疫印跡法檢測海馬組織ZO-1、CoIV蛋白表達(dá)[7]

采血后處死脫頸大鼠，剝離顱骨，迅速取出腦組織，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》分離海馬組織，分成2份，1份保存于液氮中，1份固定于4%多聚甲醛中，病理切片機(jī)切片（厚度5 μm）。取液氮保存海馬組織，充分剪碎，勻漿，加入RIPA裂解液，轉(zhuǎn)移至離心管，離心后定量蛋白。取50 μg樣本，混合上樣緩沖液混合，100℃金屬浴5 min，離心取上清，電泳，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉2 h，加入兔抗大鼠ZO-1、CoIV一抗（1:500），4 ℃搖床孵育2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（1:2 000），常溫孵育2 h，TBST洗膜，發(fā)光液顯色、曝光，凝膠成像系統(tǒng)分析，蛋白表達(dá)量以待測蛋白/內(nèi)參GAPDH的灰度值表示。

2.7 HE染色觀察海馬組織病理變化[8]

取海馬組織切片，二甲苯脫蠟，無水乙醇沖洗，自來水沖洗30 s，蘇木精染液染色5 min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化，自來水沖洗，反藍(lán)，伊紅染液染色2 min，梯度乙醇脫水、透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)病理變化。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計、分析數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計量資料，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較多樣本計量資料，以LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

見表1。

表1 各組曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s，n= 10）

表1 各組曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s，n= 10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)A組比較，▲P＜0.05

組別 劑量/（mg·kg-1）總移動距離 /cm 移動速度/（cm·s-1）對照組 0 1623.54±175.73 6.35±0.74模型組 0 832.14±95.43# 2.24±0.32#實(shí)驗(yàn)A組 150 1119.98±130.54△ 3.98±0.48△實(shí)驗(yàn)B組 300 1365.52±158.27▲ 5.06±0.65▲

3.2 各組糖水偏嗜度比較

見表2。

表2 各組糖水偏嗜度比較（±s，n= 10）

表2 各組糖水偏嗜度比較（±s，n= 10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)A組比較，▲P＜0.05

組別 劑量/（mg·kg-1） 糖水偏嗜度/%對照組 0 82.51±8.96模型組 0 51.33±6.52#實(shí)驗(yàn)A組 150 62.32±7.49△實(shí)驗(yàn)B組 300 75.67±8.71▲

3.3 各組HPA軸活性比較

見表3。

表3 各組HPA軸活性比較（±s，n= 10）

表3 各組HPA軸活性比較（±s，n= 10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)A組比較，▲P＜0.05

ACTH/（pg·mL-1）對照組 0 8.15±0.74 72.59±9.63模型組 0 14.96±2.31# 116.98±25.54#實(shí)驗(yàn)A組 150 11.52±2.46△ 102.52±12.47△實(shí)驗(yàn)B組 300 8.97±1.12▲ 89.63±11.20▲組別 劑量/（mg·kg-1）CORT/（ng·mL-1）

3.4 各組海馬組織ZO-1、CoIV蛋白表達(dá)量比較

見表4、圖1。

表4 各組海馬組織ZO-1、CoIV蛋白表達(dá)量比較（±s，n= 10）

表4 各組海馬組織ZO-1、CoIV蛋白表達(dá)量比較（±s，n= 10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)A組比較，▲P＜0.05

組別 劑量/（mg·kg-1） ZO-1 CoIV對照組 0 0.96±0.14 0.14±0.02模型組 0 0.12±0.02# 1.15±0.17#實(shí)驗(yàn)A組 150 0.25±0.03△ 0.88±0.13△實(shí)驗(yàn)B組 300 0.87±0.09▲ 0.64±0.07▲

圖 1 免疫印跡法檢測各組海馬組織ZO-1、CoIV蛋白表達(dá)

3.5 各組海馬組織病理變化

HE染色結(jié)果顯示，對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)規(guī)則、核仁清晰，具有明顯的極性；模型組神經(jīng)元腫脹或萎縮，溶解或碎裂，細(xì)胞層數(shù)減少，較多發(fā)生壞死，排列疏松；實(shí)驗(yàn)A、B組神經(jīng)元數(shù)量有所增加，細(xì)胞排列較為緊密、層數(shù)增加，腫脹、萎縮、溶解、碎裂減少，其中實(shí)驗(yàn)B組改善效果優(yōu)于實(shí)驗(yàn)A組。見圖2。

圖 2 各組蘇木精—伊紅染色后光學(xué)顯微鏡下海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變（×400）

4 討論

ZO-1是一種高分子量磷蛋白，分布在上皮與血管內(nèi)皮細(xì)胞，主要功能是緊密連接內(nèi)皮細(xì)胞，其表達(dá)量高低與血腦屏障的關(guān)閉與開放密切相關(guān)[9]。CoIV主要分布在血腦屏障基底膜的透明層，可結(jié)合層黏連蛋白構(gòu)成基底膜骨架。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可誘導(dǎo)層黏連蛋白、CoIV合成，導(dǎo)致毛細(xì)血管基底膜厚度增加。二甲雙胍屬于雙胍類口服降血糖藥，可延緩胃腸道攝取葡萄糖，并增強(qiáng)機(jī)體對胰島素的敏感性從而提高外周葡萄糖利用效率，降低血糖。此次，二甲雙胍被食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)為是神經(jīng)再生、優(yōu)化的藥物，可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化，從而保護(hù)神經(jīng)功能。二甲雙胍可改善脂多糖誘導(dǎo)的抑郁小鼠抑郁樣行為并糾正異常的谷氨酸能傳遞[10]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)A組總移動距離延長，移動速度加快，糖水偏嗜度、ZO-1蛋白表達(dá)量升高，CoIV蛋白表達(dá)量降低，且實(shí)驗(yàn)B組效果優(yōu)于實(shí)驗(yàn)A組，提示二甲雙胍可改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠抑郁樣行為，減輕血腦屏障損傷。

HPA軸是由下丘腦、垂體及腎上腺構(gòu)成的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，三者互相協(xié)調(diào)，形成神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)樞紐，通過對外界刺激做出心理與生理反應(yīng)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[11]。HPA軸功能亢進(jìn)是抑郁癥的主要發(fā)病機(jī)制之一，機(jī)體長期處于應(yīng)激狀態(tài)，下丘腦釋放大量促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，誘導(dǎo)垂體合成并釋放大量ACTH，作用于腎上腺皮質(zhì)，刺激腎上腺皮質(zhì)與外周血中CORT水平升高。HPA軸功能的改變是抑郁癥發(fā)生及認(rèn)知惡化的一種可能機(jī)制，抑郁癥與較高的CORT、ACTH水平有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)A組血清CORT、ACTH水平降低，且實(shí)驗(yàn)B組效果優(yōu)于實(shí)驗(yàn)A組，提示二甲雙胍對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的治療作用可能通過抑制HPA軸活性來實(shí)現(xiàn)。