萬 里 程如煥 鄒紹靜 邱 振 王昌成

結(jié)腸癌是一種臨床上常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高，給患者的生命安全帶來巨大威脅[1]。結(jié)腸癌起病隱匿，缺乏典型的早期癥狀，多數(shù)患者確診時已為晚期。目前臨床上主要采用姑息性手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療等方式治療腫瘤轉(zhuǎn)移患者，但其5年生存率仍然＜10%[2]。探究與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的指標(biāo)，有助于臨床擬定治療方案并改善預(yù)后。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)因子，可在缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生，與結(jié)腸癌的臨床病理特征密切相關(guān)[3]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1（FoxM1）主要通過調(diào)節(jié)紡錘體的形成和細(xì)胞周期在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮作用。研究表明，F(xiàn)oxM1可通過逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4]。目前關(guān)于結(jié)腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的報道較少。本文探究了80例結(jié)腸癌患者組織中HIF-1α和FoxM1的表達(dá)水平及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以期為改善患者的預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2021年3月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院及洪澤區(qū)人民醫(yī)院收治的80例行手術(shù)切除治療的結(jié)腸癌患者作為研究對象，術(shù)中采集患者的結(jié)腸癌組織和癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞5 cm的正常組織）。80例患者中男51例，女29例；年齡21～82歲，平均年齡為（52.73±10.25）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《結(jié)腸癌規(guī)范化診療指南（試行）》[5]中結(jié)腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理檢查確診；（2）均行結(jié)腸癌切除術(shù)治療；（3）術(shù)前未進(jìn)行放射治療或化學(xué)治療；（4）均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并結(jié)締組織病；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）妊娠期或哺乳期孕婦；（4）合并自身免疫??；（5）伴有精神疾病、凝血功能障礙；（6）術(shù)前發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；（7）合并心、肝、腎等重要器官功能障礙。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批件號 20171225）。

1.2 HIF-1α和FoxM1表達(dá)水平的檢測

采用免疫組織化學(xué)法檢測HIF-1α和FoxM1的表達(dá)水平。收集80例患者的結(jié)腸癌組織和癌旁組織標(biāo)本，使用4%甲醛溶液固定，隨后脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片（厚度約4 μm）、微波修復(fù)，隨后實(shí)施血清封閉。30 min后加入兔抗人HIF-1α、FoxM1單克隆抗體（購自美國Abcam公司）與鏈霉素親和素-生物素復(fù)合物，4 ℃孵育過夜，使用磷酸緩沖鹽溶液沖洗，滴加二氨基聯(lián)苯顯色液，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。免疫組織化學(xué)試劑盒購自上海羽哚生物科技有限公司。陽性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞核、細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色、棕黃色或黃色記為陽性。HIF-1α主要位于細(xì)胞核，F(xiàn)oxM1主要位于細(xì)胞漿。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)量評估陽性表達(dá)情況。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：無色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。陽性細(xì)胞數(shù)量評分標(biāo)準(zhǔn)：＞50%記3分，25%～50%記2分，5%～25%記1分，＜5%記0分?？偡郑饺旧珡?qiáng)度評分×陽性細(xì)胞數(shù)量評分，0～1分為陰性，≥2分為陽性。所有患者均由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立閱片，意見不同時協(xié)商一致。

1.3 臨床資料收集

收集患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、TNM分期、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無神經(jīng)侵襲、腫瘤直徑及有無脈管癌栓等。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；（2）比較結(jié)腸癌組織與癌旁組織中HIF-1α和FoxM1的表達(dá)水平；（3）分析結(jié)腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系；（4）分析結(jié)腸癌組織中HIF-1α與FoxM1表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.5 隨訪

在術(shù)后即刻開始為期1年的隨訪，隨訪截止時間為2022年3月31日，每月隨訪1次。采用門診復(fù)查的方式進(jìn)行隨訪，記錄患者的無進(jìn)展生存情況，以腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、患者死亡及隨訪時間截止作為終點(diǎn)事件。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)分析結(jié)腸癌組織中HIF-1α與FoxM1表達(dá)水平的相關(guān)性，rs值越大表示相關(guān)性越強(qiáng)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rankχ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中HIF-1α和FoxM1的表達(dá)水平比較

由表1可知，結(jié)腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的陽性表達(dá)率均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，HIF-1α在結(jié)腸癌組織中呈局部高表達(dá)，在癌旁組織中呈局部低表達(dá)或不表達(dá)；FoxM1在結(jié)腸癌組織中表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色，少量位于細(xì)胞核，大量位于細(xì)胞漿，而其在癌旁組織中表現(xiàn)為局部低表達(dá)或不表達(dá)。見圖1。

圖1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中HIF-1 和FoxM1表達(dá)病理圖 免疫組織化學(xué)染色法 ×100 A 結(jié)腸癌組織中FoxM1高表達(dá) B 癌旁組織中FoxM1低表達(dá) C 結(jié)腸癌組織中HIF-1 高表達(dá) D 癌旁組織中HIF-1 低表達(dá)

表1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中HIF-1 和FoxM1的表達(dá)水平比較/例（%）

2.2 結(jié)腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

由表2可知，不同年齡、性別、腫瘤直徑，以及有無脈管癌栓的結(jié)腸癌患者組織中HIF-1α和FoxM1的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無神經(jīng)侵襲、浸潤深度為T3～T4的結(jié)腸癌患者組織中HIF-1α和FoxM1的陽性表達(dá)率分別高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有神經(jīng)侵襲、浸潤深度為T1～T2的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

表2 結(jié)腸癌組織中HIF-1 和FoxM1的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

2.3 結(jié)腸癌組織中HIF-1α與FoxM1表達(dá)的相關(guān)性

Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中HIF-1α與FoxM1的表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs＝0.756，P＝0.002），見表 3。

表3 結(jié)腸癌組織中HIF-1 與FoxM1表達(dá)的相關(guān)性

2.4 結(jié)腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

80例患者隨訪1年，其中有4例失訪。HIF-1α陽性患者的中位無進(jìn)展生存期為7.65個月（95%CI：3.73～8.56），低于 HIF-1α陰性患者[8.79個月（95%CI：4.35～9.87）]，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝21.933，P＜0.001），見圖 2。FoxM1 陽性患者的中位無進(jìn)展生存期為7.81個月（95%CI：3.82～8.43）， 低 于 FoxM1陰 性 患 者 [8.92個 月（95%CI：5.13～10.96）]，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝31.829，P＜0.001），見圖3。

圖2 HIF-1 陽性和陰性患者的無進(jìn)展生存情況

圖3 FoxM1陽性和陰性患者的無進(jìn)展生存情況

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，嚴(yán)重威脅人們的生命安全[6]。目前結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與生活環(huán)境、遺傳、腸道微生態(tài)、生活習(xí)慣等多種因素相關(guān)[7]。結(jié)腸癌的發(fā)病通常需經(jīng)歷腸化生、不典型增生、腺癌、原癌、進(jìn)展期癌等階段，且不同階段特異性分子事件的發(fā)生情況不同。因此，深入分析結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制有助于該疾病的預(yù)防和診治。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的陽性表達(dá)率均高于癌旁組織，這提示HIF-1α和FoxM1在結(jié)腸癌發(fā)生過程中起促癌作用。研究表明，在正常氧濃度下，HIF-1α快速降解，而在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α水平快速升高，HIF-1α過表達(dá)會促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、促紅細(xì)胞生成素、血管生長因子、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等大量低氧反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合，并有助于這些蛋白和基團(tuán)的轉(zhuǎn)錄，促使腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下迅速增殖，并促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移及新生血管的生成[8-9]。另有報道指出，HIF-1α可通過激活人鞘氨醇激酶-1/1-磷酸鞘氨醇（SphK1/S1P）信號通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路介導(dǎo)瘤體內(nèi)生成新生血管，并可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的活性，從而導(dǎo)致腫瘤惡變[10]。FoxM1是一種細(xì)胞增殖特異性的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1、25A/25B等，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖、分化等多種生理過程，已成為治療惡性腫瘤的新靶點(diǎn)[11]。研究表明，F(xiàn)oxM1表達(dá)上調(diào)可引起腫瘤細(xì)胞中紡錘體缺陷，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[12]。另有報道指出，F(xiàn)oxM1在卵巢癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成顯著相關(guān)[13-16]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、有無脈管癌栓無關(guān)，而與TNM分期、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無神經(jīng)侵襲及浸潤深度密切相關(guān)，這提示HIF-1α和FoxM1可能參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。有研究表明，結(jié)腸癌組織中HIF-1α的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期等病理特征密切相關(guān)[17]。另有研究表明，結(jié)腸癌組織中FoxM1的表達(dá)水平與臨床分期、腫瘤直徑及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且FoxM1的陽性表達(dá)率高可能提示預(yù)后不良的風(fēng)險較高[18]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中HIF-1α與FoxM1的表達(dá)水平呈正相關(guān)；此外，HIF-1α陽性患者的中位無進(jìn)展生存期低于HIF-1α陰性患者，且FoxM1陽性患者的中位無進(jìn)展生存期低于FoxM1陰性患者，這提示HIF-1α陰性和FoxM1陰性患者的預(yù)后較好。

綜上所述，結(jié)腸癌患者組織中HIF-1α和FoxM1的陽性表達(dá)率與TNM分期、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無神經(jīng)侵襲及浸潤深度密切相關(guān)，且與患者的預(yù)后有關(guān)。本研究納入的樣本量偏小，可能使研究結(jié)果存在偏倚，今后需擴(kuò)大樣本量并深入進(jìn)行基礎(chǔ)研究，分析HIF-1α和FoxM1的表達(dá)水平影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的具體作用機(jī)制。