趙夢(mèng)琦 崔夢(mèng)妍 江巧麗 陸穎影

急性胰腺炎（AP）是臨床常見(jiàn)急腹癥，是一種可由輕度自限性病程發(fā)展為重度的合并多器官功能衰竭的系統(tǒng)性疾病[1]。AP的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為其與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、微循環(huán)障礙、腸道菌群移位等相關(guān)。隨著研究的不斷深入，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞程序性死亡模式——細(xì)胞焦亡，與細(xì)胞凋亡及細(xì)胞壞死一同被認(rèn)為對(duì)AP的發(fā)生及預(yù)后有重要影響。細(xì)胞焦亡是一種由天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）介導(dǎo)的具有促炎和溶解作用的細(xì)胞死亡模式，其有特殊的形態(tài)學(xué)和作用機(jī)制，主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)膜破裂，細(xì)胞內(nèi)促炎物質(zhì)釋放，此外還存在核凝聚、染色體DNA斷裂和降解等現(xiàn)象[2]。本研究主要觀察以3種方式制備的AP模型小鼠的細(xì)胞焦亡相關(guān)因子的表達(dá)，探討細(xì)胞焦亡在AP發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備和分組

選取20只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠（購(gòu)自上海雷根生物科技有限公司），體質(zhì)量為20～25 g，采用隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組、雨蛙肽組（CAE組）、CAE＋ 脂 多 糖（LPS） 組 和 L-精 氨 酸（L-Arg）組，每組5只，后3組分別制備AP模型。L-Arg組 給 予 腹 腔 注 射 8% L-Arg（4 g/kg，pH＝7.0）2次，2次中間間隔1 h，注射完成后72 h麻醉小鼠取血，處死小鼠取胰腺組織；CAE組給予腹腔注射雨蛙肽（50 μg/kg，1次/h），注射10次后間隔1 h麻醉小鼠取血，處死小鼠取胰腺組織；CAE＋LPS組給予腹腔注射雨蛙肽（50 μg/kg，1次/h），注射10次后，間隔1 h再注射1次LPS（5 mg/kg），間隔1 h麻醉小鼠取血，處死小鼠取胰腺組織；對(duì)照組給予腹腔注射PBS（50 μg/kg，1次 /h），注射 10次后，間隔1 h 麻醉小鼠取血，處死小鼠取胰腺組織。分離血漿，置于-80 ℃冰箱保存；取胰腺組織，一部分立即放入凍存管后置于液氮中保存，其余以4%多聚甲醛固定備用。

1.2 胰腺組織病理學(xué)檢查

胰腺組織以4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后行H-E染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。胰腺組織病理學(xué)評(píng)分參考Schmidt標(biāo)準(zhǔn)[3]，從水腫、出血、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分。

1.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

3個(gè)AP模型組和對(duì)照組小鼠麻醉后均于眼球取血，分離血清，采用1500-056型全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀（德國(guó)Thermo公司）檢測(cè)血清淀粉酶和脂肪酶，采用ELISA法檢測(cè)血清炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-18）水平（試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)科生物科技有限公司），按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞焦亡相關(guān)分子的mRNA表達(dá)水平

應(yīng)用TRIzol試劑（購(gòu)自上海新貝生物科技有限公司）提取胰腺組織總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Caspase-1、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、Gasdermin D（GSDMD）、IL-1β的mRNA表達(dá)水平（RT試劑盒和SYBGreen熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自上海新貝生物科技有限公司）。引物由上海新貝生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，以Rplpo為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平

應(yīng)用RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司）提取胰腺組織總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）測(cè)定蛋白濃度。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰腺組織中NLRP3、Caspase-1前體（Pro-Caspase-1）、活化的 Caspase-1（Cleaved-Caspase-1）、IL-1β前體（Pro-IL-1β）、IL-1β蛋白表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)Thermo公司）進(jìn)行顯影。兔抗小鼠NLRP3、Cleaved-caspase1、Pro-IL-1β、IL-1β抗體（美國(guó)CST公司）和兔抗小鼠Pro-Caspase-1抗體（英國(guó)Abcam公司）的工作濃度均為1∶1 000；羊抗兔IgG-HRP二抗（美國(guó)CST公司）的工作濃度為1∶5 000。應(yīng)用Amersham Imager 600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.6 免疫熒光染色法檢測(cè)胰腺組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)水平

采用免疫熒光染色法檢測(cè)胰腺組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)水平。胰腺組織石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，PBS沖洗5 min×3次；置于濕盒，始終保持濕潤(rùn)，組織化學(xué)筆封閉后滴加封閉劑，室溫下封閉1 h；PBS沖洗5 min×3次，分別孵育NLRP3、Caspase-1和IL-1β一抗（1∶100）后4 ℃過(guò)夜。次日早晨室溫下復(fù)溫30 min后，PBS沖洗5 min×3次，孵育相對(duì)應(yīng)的熒光二抗（1∶200），避光放置1 h；PBS沖洗5 min×3次，滴加DAPI，避光孵育＜8 min，再次PBS沖洗5 min×3次，滴加防熒光淬滅劑，封片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不重疊的視野圖像，熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPadPrism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，3組及以上的比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的胰腺組織病理學(xué)變化

對(duì)照組胰腺組織病理無(wú)明顯變化，CAE組、CAE＋LPS組和L-Arg組小鼠的胰腺組織均出現(xiàn)不同程度的水腫（葉內(nèi)、小葉內(nèi)、腺泡間、細(xì)胞間隔增大）、出血、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，4組的病理評(píng)分分別為0.6±0.1、3.4±0.4、10.1±0.8和9.3±0.8，3組AP模型小鼠的胰腺組織病理評(píng)分均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），胰腺組織病理改變以CAE＋LPS組和L-Arg組較為嚴(yán)重。見(jiàn)圖1。

圖1 4組小鼠的胰腺組織病理圖像 H-E染色 ×200 A 對(duì)照組 B CAE組 C CAE＋LPS組 D L-Arg組

2.2 各組的血清淀粉酶、脂肪酶水平比較

對(duì) 照 組、CAE組、CAE＋LPS組 和L-Arg組的血清淀粉酶水平分別為（574.6±67.3）U/L、（1 388.0±264.5）U/L、（1 196.0±142.4）U/L 和（1 755.0±233.4）U/L；血清脂肪酶水平分別為（253.0±29.5）U/L、（775.7±14.2）U/L、（586.8±26.5）U/L和（629.9±15.6）U/L。與對(duì)照組相比，3組AP模型小鼠的血清淀粉酶、脂肪酶水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 4組小鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平比較 A 血清淀粉酶 B 血清脂肪酶

2.3 各組的血清中炎性因子水平比較

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、CAE組、CAE＋LPS組、L-Arg組的血清TNF-α水平分別為（24.7±4.5）pg/mL、（29.3±6.0）pg/mL、（96.0±16.5）pg/mL和（103.8±31.2）pg/mL；血 清 IL-1β水平分別為（1.5±0.4）pg/mL、（3.0±0.4）pg/mL、（18.5±2.4）pg/mL和（3.9±0.4）pg/mL；血清IL-18水平分別為（88.9±4.7）pg/mL、（178.7±37.2）pg/mL、（173.7±33.8）pg/mL 和（250.0±67.0）pg/mL。3組AP模型小鼠的血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均較對(duì)照組升高，除CAE組的血清TNF-α和IL-18水平與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，各組間其余指標(biāo)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 4組小鼠的血清中炎性因子水平比較 A TNF- B IL-1 C IL-18

2.4 各組的胰腺組織中細(xì)胞焦亡相關(guān)分子的mRNA表達(dá)水平比較

3組AP模型小鼠的胰腺組織中細(xì)胞焦亡相關(guān)分 子ASC、Caspase-1、GSDMD及IL-1β的 mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組升高，除CAE組ASC和GSDMD的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，各組間其余指標(biāo)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 4組小鼠的胰腺組織中細(xì)胞焦亡相關(guān)分子的mRNA表達(dá)水平 A ASC mRNA B Caspase-1 mRNA C GSDMD mRNA D IL-1β mRNA

2.5 各組的胰腺組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)水平比較

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組胰腺組織 中 NLRP3、Cleaved-Caspase-1、IL-1β蛋 白 呈 低表達(dá)， Pro-Caspase-1和Pro-IL-1β蛋白呈高表達(dá)。3組AP模型小鼠的胰腺組織中NLRP3、Cleaved-Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高，除L-Arg組與對(duì)照組的NLRP3表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05)；而3組AP模型小鼠的胰腺組織中Pro-Caspase-1和Pro-IL-1β表達(dá)水平則較對(duì)照組降低，其中Pro-Caspase-1與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05)。這說(shuō)明AP造模后前體蛋白轉(zhuǎn)為活性狀態(tài)，AP時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生焦亡。見(jiàn)圖5。

圖5 4組小鼠的胰腺組織中NLRP3、Pro-Caspase1、Cleaved-Caspase-1、Pro-IL-1 、IL-1 的蛋白表達(dá)水平比較 A 蛋白電泳圖 B 柱形圖

免疫熒光染色結(jié)果顯示，NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白在胰腺腺泡細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，且與對(duì)照組相比，3組AP模型小鼠胰腺組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)水平均明顯升高。與CAE組相比，CAE＋LPS組和L-Arg組的NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高，而3組AP模型小鼠胰腺組織中Caspase-1蛋白的表達(dá)水平相似。見(jiàn)圖6。

圖6 4組小鼠胰腺組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1 的蛋白表達(dá)水平比較 免疫熒光染色法 ×200 A Caspase-1蛋白 B IL-1 蛋白 C NLRP3蛋白

3 討論

AP是一種復(fù)雜的胰腺炎性反應(yīng)，大多數(shù)患者病情為輕度且具有自限性，但根據(jù)2012年修訂版AP亞特蘭大分類標(biāo)準(zhǔn)，約有30%的AP患者被歸為中度AP，約有10%患者被歸為重度AP[4]，重度AP患者多伴有多器官損傷。胰腺腺泡細(xì)胞死亡方式及途徑一直是研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)細(xì)胞焦亡已在免疫性疾病、感染性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、惡性腫瘤等多種疾病的研究中被報(bào)道，其在疾病中發(fā)揮的作用也越來(lái)越受到重視。細(xì)胞焦亡的特征是將Pro-Caspase-1激活為Cleaved-Caspase-1，后者可切割GSDMD形成具有打孔功能的N端，使細(xì)胞完整性喪失后發(fā)生滲透性溶解而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其也可切割Pro-IL-1β、Pro-IL-18形成成熟的促炎因子IL-1β和IL-18并促進(jìn)其釋放[5]，進(jìn)而募集炎性細(xì)胞，加重炎性反應(yīng)。

細(xì)胞焦亡相關(guān)分子包括炎性小體、效應(yīng)分子、“殺手蛋白”GSDMD等，其中炎性小體是一類大分子蛋白復(fù)合體，主要包括NLRP3、NLRP1、NLRC4、NLRP6、AIM2、pyrin等，其中被研究得較多的是NLRP3。有研究報(bào)道，抑制NLRP3激活，可通過(guò)抑制炎性反應(yīng)減輕AP癥狀，NLRP3活性增強(qiáng)也是誘導(dǎo)急性肺損傷（ALI）的原因之一[6-7]。這些研究結(jié)果均表明抑制NLRP3活性對(duì)于AP及其誘導(dǎo)的ALI具有治療潛力。炎性Caspase可特異性作用于GSDMD蛋白，即使被不同類型的Caspase作用，也都可導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡過(guò)程的關(guān)鍵蛋白[2,8]。有研究表明，下調(diào)GSDMD蛋白的表達(dá)可抑制與炎性反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞焦亡[9]。細(xì)胞焦亡過(guò)程中的效應(yīng)分子包括IL-1β、IL-18和高遷移率組蛋白1（HMGB1）等，它們是誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子釋放、促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與AP病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[10]。HMGB1可導(dǎo)致多器官損傷，是在AP病程中介導(dǎo)腸道細(xì)菌移位的重要因素之一[11]。根據(jù)既往研究結(jié)果推測(cè)，HMGB1可能通過(guò)抑制NF- B通路和NLRP3激活，阻遏腸道細(xì)胞焦亡進(jìn)程，進(jìn)而抑制腸道炎性反應(yīng)，維持腸道穩(wěn)態(tài)，從而減輕胰腺的炎性反應(yīng)[12-13]，但胰腺與腸道細(xì)胞焦亡之間的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，以3種方式制備的AP模型小鼠的胰腺組織病理?yè)p傷明顯，血清淀粉酶、脂肪酶及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18水平升高，胰腺組織中細(xì)胞焦亡相關(guān)分子（Caspase-1、ASC、GSDMD 和 IL-1β） 的 表 達(dá)水平升高，提示在AP小鼠中存在細(xì)胞焦亡，且可加重炎性反應(yīng)。本文探究了以不同造模方式制備的AP小鼠胰腺中細(xì)胞發(fā)生焦亡的情況，但僅觀察了AP中Caspase-1介導(dǎo)的需炎性小體參與的經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡相關(guān)分子表達(dá)情況，而未對(duì)Caspase-4/5/11介導(dǎo)的不需炎性小體參與的非經(jīng)典途徑進(jìn)行研究，并且尚未探索在AP進(jìn)程中哪種胰腺的細(xì)胞發(fā)生焦亡而發(fā)揮了作用。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡的發(fā)生、發(fā)展對(duì)于AP病情嚴(yán)重程度及預(yù)后具有重要意義，但細(xì)胞焦亡在AP病程中的具體作用機(jī)制還有待深入研究，其在AP治療及預(yù)后方面的應(yīng)用潛力也需進(jìn)一步探索。