吳振興 夏青青

肝纖維化是一種可逆性損傷，是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段，也是原發(fā)性肝癌的一種前期預兆[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）在不同誘因下可在體內(nèi)外分化為神經(jīng)細胞、脂肪細胞、成骨細胞和肝樣細胞。動物實驗結(jié)果表明，BMSC移植在肝纖維化治療中具有一定效果，但其機制尚未明確[2]。Yang等[3]的研究指出，BMSC經(jīng)miR-214抑制物轉(zhuǎn)染后，其細胞培養(yǎng)上清可提高同種異體BMSC在急性肝衰竭大鼠中的治療潛力，這提示miR-214可能在一定程度上影響B(tài)MSC的治療效果。本研究通過構(gòu)建CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型，研究移植沉默miR-214的BMSC對其的治療作用，并探討相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞株

選取50只9月齡的SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量為390～410 g，均購自上海睿太莫斯生物科技有限公司。大鼠第3代BMSC細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 BMSC鑒定

選取第3代BMSC，在DMi8-M倒置熒光顯微鏡（購自德國Leica公司）下觀察細胞形態(tài)。經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化、離心后，制成細胞密度為1×106個/mL的單細胞懸液。取100 μL單細胞懸液，加入無菌EP管，根據(jù)流式多因子檢測試劑盒操作要求加入抗大鼠CD29、CD34、CD44、CD45單克隆抗體（各2 μL，均購自美國Gibco公司），充分振蕩，4 ℃孵育20 min，使用流式細胞儀鑒定BMSC表面特異性標志物。

1.3 BMSC轉(zhuǎn)染

選取第3代BMSC，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化、離心后，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，重新接種至6孔板，待細胞再次融合至70%時，參照LipofactamineTM3000試劑盒（購自上海吉瑪制藥技術有限公司）說明書進行細胞轉(zhuǎn)染。構(gòu)建miR-214沉默RNA重組真核載體pcDNA3.1-miR-214 inhibitor和陰性對照載體pcDNA3.1-NC，并轉(zhuǎn)染至BMSC，分別設為沉默組、陰性對照組，另取不作處理的BMSC設為空白對照組。3組均設5個復孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)6 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.4 BMSC中miR-214表達水平的檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測各組BMSC中miR-214的相對表達量。取沉默組、陰性對照組、空白對照組細胞，經(jīng)PBS洗滌，采用TRIzal法提取細胞總RNA，測定總RNA的濃度和純度后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到對應的cRNA。使用StepOneTMPuls熒光定量PCR儀（購自美國ABI公司），反應條件為：95 ℃預變性6 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共計40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法分析miR-214的相對表達量。實驗所用引物見表1。

表1 引物序列

1.5 構(gòu)建肝纖維化大鼠模型

50只大鼠飼養(yǎng)1周后，在大鼠背部皮下注射體積分數(shù)為30%的CCl4花生油溶液（劑量為3 mL/kg），每周注射2次，連續(xù)8周，每周稱重后調(diào)節(jié)注射劑量。注射8周后將50只大鼠隨機分為PBS組（12只）、BMSC組（12只）、miR-214 NC組（13只）和miR-214 inhibitor組（13只），處死后觀察大鼠肝纖維化情況，實驗結(jié)束剔除建模失敗及移植BMSC后死亡大鼠的數(shù)據(jù)。最終各組均納入10只大鼠。

1.6 干預方式

選取第3代BMSC，在注射前48 h，摻入BrdU并使其終濃度為10 μmol/L。PBS組經(jīng)門靜脈注射0.5 mL PBS，BMSC組經(jīng)門靜脈注射0.5 mL含有2×106個BMSC的PBS，miR-214 NC組經(jīng)門靜脈注射0.5 mL含有2×106個轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC的BMSC的PBS，miR-214 inhibitor組經(jīng)門靜脈注射0.5 mL含 有2×106個 轉(zhuǎn) 染pcDNA3.1-miR-214 inhibitor的BMSC的PBS。使用無菌棉簽壓迫止血5 min，均為一次性注射。

1.7 組織取材

移植3周后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取腹主動脈血5 mL，離心后冷凍保存；血液采集完畢后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，迅速解剖，分離肝臟，切取4 mm左右厚度的肝組織，使用4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學染色及Masson染色，其余組織迅速保存于液氮中待測。

1.8 大鼠肝功能指標檢測

取1.7小節(jié)中冷凍保存的血清，使用Mindray BS-180全自動生物化學分析儀（購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）檢測ALT和AST的表達水平，嚴格按照ALT、AST檢測試劑盒（均購自上海瑞番生物科技有限公司）說明書操作。

1.9 BMSC定植情況檢測

采用免疫組織化學染色法檢測BMSC的定植情況。取經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h的肝臟組織，用冷凍切片機切片（厚度約10 μm），滅活內(nèi)源性過氧化物酶后經(jīng)HCl處理使DNA變性；脫除HCl，加入硼酸緩沖液在室溫條件下中和反應10 min，PBS充分沖洗，5% BSA封閉液封閉20 min，滴加鼠抗BrdU多克隆抗體（1∶100），4 ℃過夜，PBS充分沖洗，滴加山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，PBS充分沖洗，DAB顯色試劑盒顯色15 min，蘇木精復染，經(jīng)二甲苯透明后封片。熒光顯微鏡下觀察細胞，細胞核呈棕黃色為陽性細胞。

1.10 BMSC分化情況檢測

采用免疫組織化學雙重染色法檢測BMSC的分化情況。肝臟組織切片后滴加鼠抗BrdU多克隆抗體（1∶100），4 ℃過夜，PBS充分沖洗，一抗為兔抗大鼠BrdU抗體、山羊抗兔Alb抗體，二抗為山羊抗兔FITC標記抗體及兔抗羊RITC標記抗體。按照說明書設計檢測步驟，熒光顯微鏡下觀察，在同一視野用2種熒光拍照后疊加圖片觀察BrdU、Alb共表達情況。

1.11 肝星狀細胞凋亡情況檢測

采用TUNEL和 -SMA免疫組織化學雙重染色法檢測肝星狀細胞的凋亡情況。肝組織切片后，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，經(jīng)HCl處理使DNA變性，蛋白酶K消化10 min；加入標記緩沖液與標記液，37 ℃標記2 h；加入生物素標記抗地高辛抗體，37 ℃反應30 min；加入SABC，37 ℃反應60 min；NBT/BCIP顯色20～60 min，血清封閉， -SMA染色，脫水，透明后封片，顯微鏡下觀察并計數(shù)。

1.12 各組肝纖維化程度檢測

采用Masson染色法觀察各組的肝纖維化程度。取1.7小節(jié)中的肝組織，經(jīng)石蠟包埋、切片、常規(guī)脫蠟，蘇木精染液染色10 min，蒸餾水漂洗；1%鹽酸分化液分化5 s，蒸餾水沖洗；Masson染色液染色10 min，蒸餾水漂洗；0.2%冰醋酸溶液浸洗2 min，1%磷鉬酸溶液浸洗4 min；苯胺藍染色液復染；置于0.2%冰醋酸溶液；無水乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片后，經(jīng)光學顯微鏡觀察肝纖維化程度。根據(jù)《肝纖維化診斷及治療共識（2019年）》判斷肝纖維化分期[4]：0期指無纖維化；Ⅰ期指匯管區(qū)擴大，局限竇周與小葉纖維化；Ⅱ期指匯管區(qū)纖維化，形成少量纖維間隔；Ⅲ期指形成大量纖維間隔，小葉結(jié)構(gòu)紊亂；Ⅳ期指早期肝硬化。

1.13 肝組織中TGF-β1、p38 MAPK和p-p38 MAPK的蛋白表達水平檢測

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測肝組織中轉(zhuǎn)化生長因子- 1（TGF- 1）、p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷酸化-p38 MAPK（p-p38 MAPK）蛋白的表達水平。取100 mg保存于液氮的肝組織，加入RIPA裂解液，研磨后勻漿，移至離心管，置于冰上，離心取上清液，采用BCA法測定蛋白含量。取50 μg蛋白樣本按1∶5比例與上樣緩沖液混合，置于沸水5 min，離心取上清液，經(jīng)TY-80型電泳儀（購自南京普陽科學儀器研究所）電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗大鼠TGF- 1、p38 MAPK、p-p38 MAPK一抗（1∶500，購自美國Abcam公司），4 ℃搖床孵育過夜，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000，購自美國Abcam公司），室溫搖床孵育2 h，TBST洗滌3次，置于暗室內(nèi)顯影，使用Gene GENIUS凝膠成像系統(tǒng)（購自英國Syngene公司）掃描后，分析灰度值，計算TGF- 1、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的相對表達量及p-p38 MAPK/p38 MAPK比值。

1.14 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，2組間比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的形態(tài)觀察及表面特異性標志物鑒定

經(jīng)倒置顯微鏡觀察，結(jié)果顯示第3代BMSC呈梭形、圓形或多角形，排列緊密，部分成團，折光性強；傳代后細胞生長與擴增能力旺盛，傳代過程中細胞貼壁生長，至第7天融合度＞80%，呈長梭形。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，BMSC表面CD29和CD44的表達率均＞95%，而CD34和CD45為陰性表達。

2.2 BMSC中miR-214的表達水平

轉(zhuǎn)染后，沉默組的miR-214相對表達量為0.41±0.02，低于空白對照組（1.12±0.08）和陰性對照組（1.07±0.07），差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。空白對照組與陰性對照組的miR-214相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組肝功能指標比較

與PBS組比較，BMSC組血清ALT、AST的表達水平較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；與BMSC組和miR-214-NC組比較，miR-214 inhibitor組血清ALT、AST的表達水平較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。BMSC組與miR-214 NC組血清ALT、AST的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組血清ALT、AST的表達水平比較

2.4 肝組織中BMSC的定植情況

在熒光顯微鏡下觀察肝組織切片，結(jié)果顯示在BMSC組、miR-214 inhibitor組和miR-214 NC組中均可見BrdU標記的陽性細胞，該細胞呈圓形，灶狀分布，細胞核呈棕黃色，這提示局部移植的BMSC可在肝組織定植。

2.5 肝組織中BMSC的分化情況

在熒光顯微鏡下觀察肝組織切片，結(jié)果顯示BrdU標記的陽性細胞呈灶狀分布，Alb標記的陽性細胞呈片狀彌漫性分布。將BrdU及Alb標記的圖片疊加后可觀察到部分共表達BrdU和Alb細胞，其中部分細胞呈圓形，與肝細胞形狀相似，這提示局部移植的BMSC可分化為有功能的肝細胞。

2.6 各組肝星狀細胞凋亡率比較

BMSC組肝星狀細胞的凋亡率為（1.73±0.57）%，高于PBS組 [（1.24±0.35）%]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。miR-214 inhibitor組肝星狀細胞的凋亡率為（2.59±0.57）%，高于BMSC組和 miR-214 NC組 [（1.75±0.62）%]，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。BMSC組與miR-214 NC組肝星狀細胞的凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.7 各組肝纖維化程度比較

Masson染色結(jié)果顯示，PBS組細胞排列紊亂，細胞間隙存在明顯脂肪變性，出現(xiàn)膠原纖維組織增生，肝小葉異常增生形成假小葉；BMSC組和miR-214 NC組細胞排列紊亂情況有所改善，細胞間隙存在少量脂肪變性，纖維組織增生及假小葉形成均有所減少；miR-214 inhibitor組細胞排列紊亂情況進一步改善，未發(fā)現(xiàn)脂肪填充，有少量纖維組織增生及假小葉形成。見表3、圖1。

表3 各組肝纖維化程度比較/例

圖1 各組肝纖維化病理圖 Masson染色 ×200 A PBS組 B BMSC組 C miR-214 NC組 D miR-214 inhibitor組

2.8 各組肝組織中TGF-β1蛋白表達水平及p-p38 MAPK/p38 MAPK比值比較

與PBS組比較，BMSC組肝組織中TGF- 1蛋白的表達水平及p38 MAPK/p-p38 MAPK比值較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與BMSC組和miR-214 NC組比較，miR-214 inhibitor組肝組織中TGF- 1蛋白的表達水平及p38 MAPK/p-p38 MAPK比值較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。BMSC組與miR-214 NC組肝組織中TGF- 1蛋白的表達水平及p38 MAPK/p-p38 MAPK比值的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4、圖2。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組肝組織中TGF- 1、p38 MAPK、p-p38 MAPK和p38 MAPK蛋白的表達水平

表4 各組肝組織中TGF- 1蛋白的相對表達量及p38 MAPK/p-p38 MAPK比值比較

3 討論

肝纖維化是由多種病因及慢性刺激導致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生[5]。目前認為其發(fā)病機制主要是肝臟中細胞外基質(zhì)合成與分解失衡，致其大量沉積于肝臟，形成纖維化[6]。尋找有效的藥物和治療手段遏制并逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程，對于臨床治療慢性肝病及預防肝硬化具有重要意義。BMSC是成體多功能干細胞，擁有多向分化和自我更新的能力，在修復組織損傷中發(fā)揮重要作用，可抑制肝星狀細胞激活并誘導其凋亡，分解膠原纖維，分泌損傷修復因子，促進肝細胞再生，從而抑制肝纖維化[7-8]。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼短序列RNA，具有調(diào)控基因的作用[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在BMSC增殖、分化、遷移及細胞因子旁分泌等病理、生理過程中起關鍵作用，并參與調(diào)控BMSC組織損傷修復過程[10]。Wang等[11]在研究BMSC對1型糖尿病成骨分化的作用時發(fā)現(xiàn)，miR-214-3p激動劑AgomiR-214-3p可抑制BMSC的成骨分化，而miR-214-3p抑制劑AntagomiR-214-3p則可增強BMSC的成骨分化作用，推測miR-214可作為BMSC成骨分化的關鍵調(diào)節(jié)劑。本研究結(jié)果顯示，與BMSC組和miR-214 NC組比較，miR-214 inhibitor組血清ALT、AST表達水平較低，且Masson染色結(jié)果顯示miR-214 inhibitor組肝細胞排列紊亂情況得到改善，纖維組織增生及假小葉形成減少，這提示移植沉默miR-214的BMSC可保護肝纖維化大鼠的肝功能，并減輕肝纖維化程度。由此推測，沉默miR-214可增強BMSC分化為肝細胞的能力，從而抑制肝纖維化的進展。

TGF- 1是一種多功能的生長因子[12]。在肝纖維化過程中，TGF- 1通過調(diào)控TGF- 1/p38 MAPK信號通路刺激肝星狀細胞活化，使p38 MAPK磷酸化，抑制蛋白水解酶合成，導致細胞外基質(zhì)累積，膠原蛋白合成增加，促進肝星狀細胞增殖和遷移，加重肝纖維化程度[13-14]。Ghafoory等[15]關于小鼠肝損傷的研究表明，TGF- 1缺乏可減輕小鼠肝纖維化程度。另有研究表明，抑制TGF- 1/Smads信號通路可有效防止肝細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，阻滯肝纖維化進展[16]。本研究結(jié)果顯示，與BMSC組和miR-214 NC組比較，miR-214 inhibitor組肝組織中TGF- 1蛋白的表達水平及p38 MAPK/p-p38 MAPK比值較低，這提示移植沉默miR-214的BMSC對大鼠肝纖維化的抑制作用可能與調(diào)控TGF- 1/p38 MAPK信號通路有關。

綜上所述，移植沉默miR-214的BMSC可抑制大鼠肝纖維化，這可能與調(diào)控TGF- 1/p38 MAPK信號通路有關。本研究僅檢測了TGF- 1、p-p38 MAPK和p38 MAPK的蛋白表達水平，未能完全闡明移植沉默miR-214的 BMSC后對肝纖維化的具體作用機制，在今后的研究中需進一步探索。