李昕璽 劉長(zhǎng)梅 祝慧 翟淼浡 商雪 趙嘉昊 徐會(huì)圃

1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，濱州 256600；2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，濱州 256600

目前，急性心肌梗死的發(fā)病率不斷增加，已成為全世界范圍內(nèi)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。而在急性心肌梗死患者的治療中，溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）以及冠狀動(dòng)脈旁路移植（CABG）等心肌再灌注治療是減少梗死面積、挽救瀕死細(xì)胞的有效治療策略。然而，再灌注治療在挽救心肌的同時(shí)也可誘發(fā)心肌頓抑、再灌注心律失常和無(wú)復(fù)流現(xiàn)象等一系列心臟不良事件，引起心肌缺血再灌注損傷（MIRI）［1］，影響患者預(yù)后。目前針對(duì)MIRI尚缺乏有效的治療策略，因此，探索改善缺血再灌注損傷的機(jī)制、預(yù)防或減輕缺血再灌注損傷，將有助于改善急性心肌梗死患者的預(yù)后。

外泌體是由細(xì)胞主動(dòng)分泌的具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的小囊泡［2］，能夠通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)物質(zhì)（包括酶、細(xì)胞因子、DNA和非編碼RNA等）參與細(xì)胞間通訊［3］。其最早是在二十世紀(jì)80年代由Johnstone等［4］在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞體外培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)并命名的。隨著對(duì)外泌體研究的日益深入，研究者們發(fā)現(xiàn)外泌體在體內(nèi)眾多生物過(guò)程中均起著重要作用，如細(xì)胞分化、炎性反應(yīng)、抗原提呈、免疫應(yīng)答以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等。幾乎所有的細(xì)胞類型均可分泌外泌體，其表面標(biāo)志物主要有CD63、CD81、CD9、ALG-2互作蛋白X（Alix）、腫瘤易感基因101（TSG101）、熱休克蛋白27（HSP27）等［5］。2007年，Gupta和Knowlton［6］首次報(bào)道缺氧復(fù)氧條件下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞能夠釋放外泌體。外泌體在心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間可以充當(dāng)細(xì)胞間通訊信使，并參與心血管疾病中細(xì)胞再生、心室重塑和血管生成等過(guò)程的調(diào)節(jié)［7］。在過(guò)去十年中，隨研究的不斷深入，外泌體已成為心血管疾病重要的治療手段或生物標(biāo)志物之一，本文將對(duì)外泌體、MIRI以及外泌體對(duì)MIRI作用機(jī)制進(jìn)行探討。

MIRI的機(jī)制

MIRI與分子、細(xì)胞以及組織改變?nèi)缪趸瘧?yīng)激、炎癥、中性粒細(xì)胞活化以及細(xì)胞死亡等過(guò)程均有關(guān)。而再灌注損傷的主要介質(zhì)是氧自由基、鈣負(fù)荷和中性粒細(xì)胞等［8］。

1、氧自由基損傷

氧自由基性質(zhì)極其活潑，能夠誘導(dǎo)體內(nèi)其他物質(zhì)的氧化修飾，其產(chǎn)生在冠狀動(dòng)脈閉塞再灌注后的前幾分鐘達(dá)到高峰［9］，能夠?qū)е掳さ牟伙柡椭|(zhì)或蛋白質(zhì)過(guò)氧化，線粒體是氧自由基攻擊的主要目標(biāo)。雖然氧自由基可以被體內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）催化為過(guò)氧化氫，但在急性缺血損傷后細(xì)胞水平的SOD急劇減少，打破了這種平衡，并為隨后再灌注后氧自由基的激活提供了基礎(chǔ)［10］。有研究建立了MIRI犬模型，在再灌注期間給予SOD和過(guò)氧化氫酶（CAT）清除氧自由基后，雖然梗死面積沒(méi)有顯著減少，卻顯著改善再灌注期間的局部心肌血流量并保存了嚴(yán)重受損心肌細(xì)胞區(qū)域微血管的超微結(jié)構(gòu)［11-12］。因此再灌注過(guò)程中氧自由基還可以通過(guò)損傷微血管導(dǎo)致心肌組織損害。

2、炎性反應(yīng)

當(dāng)機(jī)體受到侵犯時(shí)，特殊分化細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞等）會(huì)識(shí)別并啟動(dòng)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而中性粒細(xì)胞會(huì)快速識(shí)別這種反應(yīng)，移動(dòng)到啟動(dòng)并釋放促炎介質(zhì)的地方來(lái)發(fā)揮作用。而生理狀態(tài)發(fā)生改變時(shí)，中性粒細(xì)胞這一反應(yīng)可致組織損傷。在MIRI的過(guò)程中，損傷的心肌細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)出炎癥信號(hào)［13-14］，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞移動(dòng)并激活，釋放能夠損傷再灌注區(qū)域內(nèi)鄰近內(nèi)皮和心肌細(xì)胞的毒性產(chǎn)物，包括蛋白水解酶、血小板活化因子和氧自由基等，引起自身組織的破壞。同時(shí)，該過(guò)程常伴隨著促炎細(xì)胞因子的釋放，如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1和IL-6［14］。這些細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮、中性粒細(xì)胞和心肌細(xì)胞表面黏附分子暴露，并刺激IL-8的釋放，能夠顯著促進(jìn)炎癥以及中性粒細(xì)胞的激活。有研究表明，MIRI時(shí)心肌釋放的細(xì)胞外熱休克同源蛋白［15］，可以通過(guò)Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)在缺血后的炎性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［16］。

3、線粒體功能障礙

在再灌注過(guò)程中，氧重新進(jìn)入心肌細(xì)胞會(huì)對(duì)線粒體信息傳遞鏈造成損傷，增加氧自由基的產(chǎn)生。而線粒體Ca2+超載和氧自由基產(chǎn)生增加都促進(jìn)線粒體膜上的非選擇性通道線粒體膜通透性轉(zhuǎn)化孔（PTP）的開(kāi)放，使細(xì)胞能量紊亂，導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞壞死和凋亡［17］。PTP的開(kāi)放成為致死性再灌注損傷的關(guān)鍵決定因素。在心肌缺血期間，線粒體PTP保持關(guān)閉狀態(tài)，僅在心肌再灌注后的前幾分鐘內(nèi)開(kāi)放，以應(yīng)對(duì)線粒體Ca2+超載、氧化應(yīng)激、H+濃度升高以及三磷酸腺苷（ATP）的消耗。而缺氧時(shí)間較長(zhǎng)導(dǎo)致缺氧嚴(yán)重時(shí)，PTP開(kāi)放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使線粒體膜電位嚴(yán)重失衡導(dǎo)致氧化磷酸化解偶聯(lián)，最終出現(xiàn)ATP耗竭以及細(xì)胞死亡。

另外，隨著心肌細(xì)胞的缺血缺氧，細(xì)胞以及胞膜功能障礙，各種代謝以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，Ca2+順膜內(nèi)外離子濃度差進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；同時(shí)，H+作為無(wú)氧糖酵解的結(jié)果在細(xì)胞內(nèi)積累。灌注恢復(fù)后，為了使細(xì)胞內(nèi)pH值正?；琀+被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外來(lái)交換Na+。細(xì)胞內(nèi)Na+的增加激活2Na+/Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+與細(xì)胞外Ca2+的交換。高比率的Na+/Ca2+交換會(huì)導(dǎo)致Ca2+超載和細(xì)胞死亡［18］。另有其他研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注時(shí)還可以通過(guò)Rap1等途徑促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，引起相應(yīng)的心肌損害。

外泌體對(duì)MIRI的作用

外泌體是細(xì)胞主動(dòng)分泌的胞外小囊泡。既往的研究表明，多種細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子以及趨化因子等。生理狀態(tài)下，細(xì)胞可以釋放少量的外泌體，而在一定的內(nèi)、外刺激（如信號(hào)通路激活、應(yīng)激等）情況下，可以誘發(fā)細(xì)胞分泌大量的外泌體。缺血缺氧對(duì)組織器官來(lái)說(shuō)是巨大的刺激，多種細(xì)胞分泌的外泌體均發(fā)生變化，這些外泌體首先進(jìn)入周邊細(xì)胞外液，并最終匯聚于血液循環(huán)中到達(dá)靶細(xì)胞、靶組織而發(fā)揮相應(yīng)作用。外泌體是有著雙層膜結(jié)構(gòu)的帶負(fù)電荷（-26 mV）的微粒，并表達(dá)CD63、CD81等表面分子，這些特性使得它易于被MIRI心肌細(xì)胞攝取吸收，并遞送其攜帶的生物活性分子。有研究表明外泌體是新生血管形成、細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子［19］，能夠通過(guò)多種機(jī)制改善缺血再灌注后損傷的心肌以及心功能。

1、抑制炎性反應(yīng)

炎性反應(yīng)是導(dǎo)致MIRI的一個(gè)重要機(jī)制。在MIRI小鼠模型中，再灌注后給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體的小鼠與對(duì)照組小鼠相比，心肌梗死面積減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；同時(shí)，外泌體處理后的小鼠心臟組織中促炎因子IL-6減低更顯著，而抗炎因子IL-10的濃度則顯著增加［20］。而大鼠M2型巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以通過(guò)攜帶miR-148a來(lái)下調(diào)硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的表達(dá)并使TLR4/NF-κB/NLRP3炎性體信號(hào)通路失活以減輕MIRI［21］。另外，SIRT7可以參與心肌細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，且其表達(dá)隨著急性心血管損傷的加重而增加，在缺血再灌注心肌組織和細(xì)胞中SIRT7表達(dá)上調(diào)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA-125b來(lái)負(fù)性調(diào)節(jié)SIRT7從而抑制心肌細(xì)胞炎癥應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡，減輕缺血再灌注損傷［22］。

2、抗氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的重要原因之一。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在再灌注后30 min內(nèi)，外泌體處理后動(dòng)物的ATP/ADP和NADH/NAD+比率顯著增加［23］。同時(shí)，作為心肌缺血/再灌注損傷的標(biāo)志特征，氧化應(yīng)激的程度在再灌注的第1小時(shí)內(nèi)也有一定程度的降低。這表明，外泌體治療在引發(fā)快速生化反應(yīng)以恢復(fù)ATP和NADH水平以及減少氧化應(yīng)激方面效果較為顯著。另外，陳琮［24］對(duì)MIRI的小鼠分別予以等量的外泌體以及生理鹽水治療，與生理鹽水治療的對(duì)照組相比，外泌體治療組小鼠心肌中ATP和NADH的水平明顯增加，同時(shí)，增加了磷酸化的Akt和磷酸化的GSK-3β，并減少了磷酸化的c-JNK，而經(jīng)過(guò)外泌體治療的小鼠，減低了氧化應(yīng)激，心功能得到明顯改善。外泌體的抗氧化應(yīng)激的功能一定程度上可以改善MIRI的預(yù)后。

3、誘導(dǎo)自噬減輕細(xì)胞凋亡

細(xì)胞缺血或缺氧損傷后的自噬增強(qiáng)具有一定的心肌保護(hù)作用，而缺血再灌注后過(guò)量氧自由基的產(chǎn)生可以導(dǎo)致細(xì)胞自噬功能的降低。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌缺血再灌注模型中，自噬蛋白LC3B-Ⅱ水平降低，同時(shí)，作為自噬退化的標(biāo)志，P62在暴露于H2O2的H9C2心肌細(xì)胞中相對(duì)于對(duì)照組顯著降低；為進(jìn)一步觀察外泌體對(duì)細(xì)胞自噬的影響，用Baf-A1抑制細(xì)胞自噬后，與僅H2O2組相比，在H2O2+外泌體組中，自噬基因Beclin-1和LC3B-Ⅱ的表達(dá)顯著增強(qiáng)，P62的表達(dá)顯著降低，且與H2O2暴露組相比，外泌體處理組的自噬體和自噬溶酶體均顯著增加［25］。同時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可以通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/mTOR途徑增強(qiáng)心肌細(xì)胞自噬。另外，缺血再灌注期間心肌細(xì)胞外泌體的釋放能夠減少體外缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡［26］。

4、促進(jìn)血管新生

心肌缺血后血管再生保證血液以及氧供是減輕損傷的關(guān)鍵措施。有研究表明，來(lái)源于遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理大鼠血漿中的外泌體可以通過(guò)促進(jìn)HSP70的表達(dá)顯著提高細(xì)胞活力，增加內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞分裂G1期的細(xì)胞百分比、細(xì)胞遷移、增殖、血管形成并抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以通過(guò)引起的iNOS、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、Ang-I和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的顯著表達(dá)增加來(lái)促進(jìn)血管再生，從而減輕缺血再灌注損傷［27］。Ma等［28］研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠缺血心臟移植表達(dá)miR-132的外泌體后明顯增強(qiáng)了梗死周邊區(qū)的新生血管形成，保護(hù)了心臟功能。

5、減少梗死面積，減輕心肌重塑

心室重塑是導(dǎo)致患者發(fā)生心力衰竭，影響急性心肌梗死患者遠(yuǎn)期預(yù)后的主要原因。Yu等［29］發(fā)現(xiàn)，在人間充質(zhì)干細(xì)胞中存在過(guò)表達(dá)鋅指轉(zhuǎn)錄因子-4（GATA1 binding factor-4，GATA-4），將急性心肌梗死兔模型給予間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體處理后，發(fā)現(xiàn)心肌梗死面積明顯減小。同時(shí)，有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體能夠通過(guò)PI3K/Akt途徑減輕心肌細(xì)胞重塑，而該途徑還是一種常見(jiàn)的細(xì)胞自噬途徑，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以通過(guò)該途徑抑制心肌重塑，促進(jìn)細(xì)胞自噬，從而減輕MIRI［23］。

展望

外泌體通過(guò)在細(xì)胞間傳遞功能蛋白等物質(zhì)，可以對(duì)損傷的修復(fù)和恢復(fù)產(chǎn)生即時(shí)的生理反應(yīng)，是一種體內(nèi)理想的載體。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以分泌細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子等，這些因子可以主要通過(guò)促進(jìn)心肌和血管組織的生長(zhǎng)和再生來(lái)修復(fù)受損的心臟組織，從而減輕MIRI。外泌體這些作用為我們研究組織損傷和修復(fù)的細(xì)胞間調(diào)節(jié)提供了新的視角，并為組織修復(fù)生物制劑的開(kāi)發(fā)提供了新的途徑，同時(shí)也為我們探究外泌體新的功能提供了思路。如果外泌體可以激活心臟保護(hù)途徑，那么我們可以通過(guò)操縱它在血液中的濃度來(lái)進(jìn)一步影響心臟保護(hù)機(jī)制。目前尚未開(kāi)發(fā)出用于體內(nèi)改變外泌體產(chǎn)生的特定藥物制劑。最近有許多研究提出采用肢體遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理可以增加血液中外泌體的數(shù)量并改變轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)來(lái)發(fā)揮相應(yīng)的心臟保護(hù)作用。同時(shí)，我們猜想外泌體參與心臟保護(hù)可能代表了外泌體在參與組織修復(fù)中的一般功能。不同的細(xì)胞類型可能會(huì)產(chǎn)生針對(duì)特定類型細(xì)胞或損傷的外泌體，這些外泌體極有可能成為診斷疾病以及判斷預(yù)后的有效生物學(xué)標(biāo)志。