吳小雷

皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，蕪湖 241000

近年來隨著冠狀動(dòng)脈微血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，現(xiàn)已逐漸受到多數(shù)醫(yī)學(xué)工作者們的關(guān)注。2017年我國有關(guān)共識(shí)將冠狀動(dòng)脈微血管疾病定義為受多種相關(guān)致病因素的影響下，機(jī)體冠狀小動(dòng)脈以及小動(dòng)脈功能或結(jié)構(gòu)異常而導(dǎo)致的心肌缺血或心絞痛等具有客觀證據(jù)的綜合征［1］。近年來亦有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，臨床癥狀表現(xiàn)為胸痛，但通過冠脈造影結(jié)果顯示為正常的健康體檢者中，冠狀動(dòng)脈微血管疾病患者的發(fā)病率高達(dá)60%左右，且在該類患者中心肌梗死、心肌缺血以及心絞痛等相關(guān)心血事件的發(fā)生率明顯升高，推測冠狀動(dòng)脈微血管疾病的發(fā)生可能是導(dǎo)致該類患者預(yù)后不良的重要因素［2］。此外，冠狀動(dòng)脈微血管疾病的致病因素較為復(fù)雜，且波及的人群較為廣泛，臨床亦缺乏規(guī)范且科學(xué)的檢測手段，進(jìn)而給冠心病的系統(tǒng)管理及防治工作帶來了巨大挑戰(zhàn)［3］。因此，進(jìn)一步加深對該病的認(rèn)知就顯得尤為重要。此外，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈微血管疾病發(fā)生的相關(guān)危險(xiǎn)因素與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相似，包括高游離脂肪酸、高血壓、衰老以及糖尿病等，而這些因素均以損害機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞功能為病理特征。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈微血管細(xì)胞約占心臟內(nèi)細(xì)胞總量的1/3，同時(shí)在維持冠狀動(dòng)脈微血管正常運(yùn)轉(zhuǎn)期間發(fā)揮重要作用，且冠狀動(dòng)脈微血管細(xì)胞功能發(fā)生異常時(shí)，其正常情況下均先損傷心?。?］。冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMEC）功能障礙主要是指在相關(guān)病理作用下，CMEC的增殖、遷移、粘附、凋亡以及分泌等功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致CMEC功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈微血管收縮，心肌供血異常等，同時(shí)亦是CMEC功能異常的早期表現(xiàn)，現(xiàn)階段關(guān)于CMEC功能障礙的相關(guān)機(jī)制雖然尚未闡明，本研究現(xiàn)就CMEC功能障礙的分子機(jī)制展開綜述。

線粒體活性氧自由基（ROS）的積累

細(xì)胞在機(jī)體中的正常生長以及代謝期間均可產(chǎn)生ROS，但通過在多種相關(guān)機(jī)制的作用下亦可使氧化還原狀態(tài)持續(xù)保持平衡［5］。在高血壓或糖尿病患者中，由于機(jī)體中的高血壓、高胰島素、高血糖對血管內(nèi)皮刺激，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞的應(yīng)激水平上升，因此，高血壓、高胰島素、高血糖亦被認(rèn)為是導(dǎo)致該類患者CMEC功能發(fā)生障礙的主要因素。當(dāng)機(jī)體血壓升高期間亦可導(dǎo)致血管緊張素表達(dá)水平上升，激活蛋白激酶C（PKC）所依賴的煙酰胺脫氫酶，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體超氧陰離子表達(dá)水平上升。此外，在炎癥因子、高血脂以及高血糖等因素影響下，機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞促氧化酶活性增強(qiáng)，促使ROS表達(dá)水平提高。同時(shí)ROS大量累積亦會(huì)導(dǎo)致一氧化氮信號通路受到影響，降低一氧化氮信號通路生物利用度，進(jìn)而促使微血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙。除上述直接參與的氧化還原相關(guān)蛋白外，亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)還存在其他相關(guān)蛋白參與了ROS相關(guān)的信號通路，進(jìn)而引起CMEC積累，激活叉頭框蛋白1（FoxO3A），F(xiàn)oxO3A激活后不僅能夠降低ROS表達(dá)水平，同時(shí)亦能有效抑制B細(xì)胞淋巴瘤因子2xL（Bcl2-xL），最后一刻觸發(fā)CMEC凋亡［6］。Bax抑制劑1通過抑制黃瞟吟氧化酶/F-肌動(dòng)蛋白信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體融合，減輕機(jī)體因缺血在灌注而導(dǎo)致的CMEC損傷。此外，在復(fù)氧/缺氧的模型中，CMEC/ROS信號通路激活早期生長反應(yīng)因子1（Egr-1）轉(zhuǎn)至下游基因，進(jìn)而導(dǎo)致CMEC損傷。綜上，ROS在CMEC損傷的機(jī)制不僅復(fù)雜且涉及多個(gè)層次，原因可能與機(jī)體細(xì)胞所處的環(huán)境、ROS表達(dá)水平等相關(guān)。當(dāng)ROS水平處于相對較低的情況下，線粒體內(nèi)參與氧化還原平衡的抗氧化相關(guān)蛋白，當(dāng)ROS表達(dá)水平上升至一定程度后促使氧化還原失衡，ROS可能更多作為信號傳導(dǎo)分子用以去激活信號通路以及蛋白進(jìn)而引起生物學(xué)反應(yīng)?，F(xiàn)階段有關(guān)下游通路雖然較為復(fù)雜，但能夠確定是機(jī)體細(xì)胞所處的應(yīng)激背景（高糖、脂肪酸炎癥以及缺氧等）對ROS細(xì)胞及其介導(dǎo)的信號有一定影響。

一氧化氮合酶（NOS）信號通路失調(diào)

NO是機(jī)體血管功能重要的穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子，其主要是由L-精氨酸化合物在NOS的催化下進(jìn)行形成［7］?，F(xiàn)階段，已知在人體血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在2種NOS，包括損傷后出現(xiàn)的損傷后誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）以及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）。eNOS屬于鈣離子（Ca2+）依賴的一種酶，而iNOS是非Ca2+依賴并受內(nèi)毒素以及細(xì)胞因子調(diào)控，且eNOS在催化水平較低的NO（nmol級）時(shí)，對血管穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，而iNOS在催化水較高的NO（μmol級）時(shí)其參與了機(jī)體多種病理的發(fā)展過程。內(nèi)皮細(xì)胞受氧化應(yīng)激刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞中Ca2+釋放，Ca2+與鈣調(diào)素相結(jié)合進(jìn)而形成的復(fù)合物進(jìn)而激活eNOS，eNOS在血紅素、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）以及黃素單核苷酸（FMN）等輔助因子的調(diào)控下，進(jìn)而導(dǎo)致NO半衰期縮短，使其加快釋放同時(shí)進(jìn)入血液并與血紅素結(jié)合，從而激活鳥苷酸環(huán)化酶（cGMP），使其水平增高，受蛋白激活酶的激活后亦可維持血管穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)血管舒張。此外，亦有研究發(fā)現(xiàn)eNOS活性以及eNOS信號受阻是多種血管疾病發(fā)生的核心特征，現(xiàn)階段尼可地爾是首選治療因CMEC功能障礙誘發(fā)心絞痛的藥物，通過活化靜脈血管平滑肌促使cGMP上升，進(jìn)而發(fā)揮血管擴(kuò)張，改善血管供血作用［8］。影響NOS輔助因子活性以及相關(guān)底物亦可干擾NOS的信號通路，在一項(xiàng)動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，CMECBH4表達(dá)水平上升可有效抑制或是緩解因糖尿病所致的NO依賴血管舒張損傷［9］。此外，ROS作為CMEC損傷的病例因子，其表達(dá)水平上升可使NO降解加速，采用活性氧清除劑干預(yù)CMEC亦可明顯增加NO生物的利用度，改善機(jī)體血管功能，提示ROS在NOS信號通路中有負(fù)調(diào)控的作用。此外，亦有其他相關(guān)的信號通路同樣參與了NOS的活性調(diào)節(jié)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路可激活人源eNOS，促使CMEC加速釋放NO，進(jìn)而可緩解因缺血再灌注所誘發(fā)的受損血管功能［10］。上述可知，在CMEC中，NOS受多種輔助因子、底物以及酶的調(diào)控，且PI3K信號通路在eNOS酶活性的調(diào)控中可能發(fā)揮著重要作用。

細(xì)胞代謝通路紊亂

細(xì)胞的代謝功能在機(jī)體細(xì)胞分化期間和生物功能極為重要，機(jī)體如果出現(xiàn)如高游離脂肪酸、高血糖等代謝紊亂情況，亦可導(dǎo)致患者心血管事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加。有關(guān)研究表明糖尿病患者血管細(xì)胞代謝及心肌出現(xiàn)異常情況可能是促使其發(fā)生相關(guān)心血管事件的主要原因［11］。此外，患者冠狀動(dòng)脈功能障礙亦可促使心肌供血異常，進(jìn)而引發(fā)糖尿病性心肌疾病。在高糖引起的細(xì)胞代謝異常期間，ROS的大量累積和細(xì)胞凋亡信號通路是導(dǎo)致CMEC受損的重要分子事件。CMEC在高糖的環(huán)境下其葡萄糖代謝表達(dá)水平更高，而在這種情況下ROS表達(dá)水平亦會(huì)隨之升高，現(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)競爭性糖酵解抑制劑2-DC可有效降抑制因高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的超氧化物生成，由此可知，由高糖所誘發(fā)的高水平糖酵解是血管內(nèi)皮細(xì)胞中的超氧化物持續(xù)生成的主要因素。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體高糖狀態(tài)未改eNOS以及iNOS表達(dá)水平產(chǎn)生影響，但其降低了機(jī)體細(xì)胞中的谷胱甘肽（GSH）表達(dá)水平，提高了NAD（P）H氧化酶膜結(jié)合組分p22-phox的水平表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CMEC內(nèi)氧自由基主要來源于NAD（P）H，由此認(rèn)為，高糖所致CMEC氧化應(yīng)激異常的原因可能與抗氧化蛋白表達(dá)水平降低促氧化酶活性提高相關(guān)［12］。現(xiàn)階段關(guān)于高糖對GSH的調(diào)控機(jī)制未完全闡明，關(guān)于血管平滑肌的相關(guān)研究結(jié)果僅表明，高糖所誘發(fā)的抗氧化蛋白表達(dá)水平異?？赡芘cGSH合成限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）水平及活性相關(guān)［13］。但對于能否可類推至CMEC尚未確定。另外，高糖所致的代謝異常亦可激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，隨后抑制了細(xì)胞自噬過程，進(jìn)而促進(jìn)CMEC凋亡。近年來亦有相關(guān)研究證實(shí)，臨床用于治療CMEC的尼可地爾可通過促進(jìn)細(xì)胞自噬用以保護(hù)晚期糖基化終末產(chǎn)物所致的CMEC損傷，故細(xì)胞自噬亦可能是高糖狀態(tài)誘發(fā)CMEC損傷的干預(yù)靶點(diǎn)之一［14］。由上述認(rèn)為，高糖狀態(tài)所誘發(fā)的CMEC損傷機(jī)制可能是多方面的。除高糖損傷血管外，高脂肪酸血癥也會(huì)導(dǎo)致心臟微血管損傷，同時(shí)機(jī)體游離脂肪酸異常也會(huì)導(dǎo)致CMEC發(fā)生損傷，圍脂滴蛋白5屬于重要的脂肪酸代謝蛋白，圍脂滴蛋白5異常降低亦可導(dǎo)致脂滴減少，游離脂肪酸濃度增加進(jìn)而促使ROS大量生成，導(dǎo)致eNOS活性及表達(dá)水平顯著降低，最終CMECNO促使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。正常情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞均通過代謝的方式進(jìn)行糖酵解，而受脂肪酸水平上升的刺激下亦會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)向給予依賴氧化脂肪酸提供能量，在此期間會(huì)使ROS大量產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生障礙，因此，在臨床治療中，關(guān)于脂肪酸代謝異常的情況亦不可忽視。

細(xì)胞衰老信號通路活化

衰老屬于影響心血管疾病公認(rèn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在一項(xiàng)動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備（CFR）功能及內(nèi)皮依賴性血管舒張隨著年齡不斷上升而持續(xù)減少［15］。其相關(guān)機(jī)制可能與機(jī)體舒張因子分泌量降低、細(xì)胞失活以及收縮因子釋放相關(guān)。血管內(nèi)皮功能受到損傷后，舒張因子所發(fā)揮的抑制作用相對降低，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體血小板和免疫細(xì)胞大量聚集，直接影響機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞功能。近年來有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，與機(jī)體衰老相關(guān)的Sirtuins家族蛋白直接參與了CMEC功能障礙［16］。在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）以及衰老中，微血管內(nèi)皮細(xì)胞miRNA 217的水平上升，進(jìn)而抑制身為Sirtuins家族一員的沉默信息調(diào)節(jié)因子1，促使細(xì)胞內(nèi)皮信號發(fā)生改變同時(shí)eNOS活性下降，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生障礙。此外，Sirtuins家族中的另一個(gè)成員沉默信息調(diào)節(jié)因子3可隨著機(jī)體衰老而持續(xù)降低，其主要位于線粒體，對細(xì)胞代謝以及線粒體具有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)亦可幫助機(jī)體心肌細(xì)胞抵抗衰老和應(yīng)激損傷。Sirtuins家族在衰老過程中對機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞功能所發(fā)揮的作用可能與Sirtuins家族蛋白去乙酰化酶調(diào)控線粒體應(yīng)激反應(yīng)及調(diào)控線粒體的代謝相關(guān)。此外，ROS同樣參與了CMEC的衰老過程，相關(guān)文獻(xiàn)表明，ROS表達(dá)水平上升可導(dǎo)致CMEC的細(xì)胞周期發(fā)生增殖抑制、停滯等，使其出現(xiàn)衰老表型，而FOXO3作為與人類長壽相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，其通過抑制ROS信號通路后可有效延緩CMEC衰老，此外，衰老會(huì)提高如腫瘤壞死因子-a（TNF-α）等脂肪來源的細(xì)胞因子表達(dá)水平，這亦是促使CMEC功能發(fā)生障礙的重要因素［17］。

炎癥信號激活

炎癥信號在CMEC功能障礙的發(fā)生以及發(fā)展中發(fā)揮了極為重要的作用，炎癥因子可導(dǎo)致內(nèi)膜增厚、血管內(nèi)皮損傷，亦會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞NO和前列環(huán)素合成及其類似物合成減少，同時(shí)亦可激活機(jī)體免疫細(xì)胞進(jìn)一步釋放免疫激活物，進(jìn)而促使內(nèi)皮功能發(fā)生異常［18］。在炎癥信號被激活的狀態(tài)下，機(jī)體血管細(xì)胞黏附分子-1以及黏附分子的表達(dá)水平亦會(huì)增加，同時(shí)整合素受體親和力上升后，其在血管內(nèi)壁中的滾動(dòng)將會(huì)受到一定抑制，在細(xì)胞趨化因子作用下進(jìn)行遷移浸潤，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷。正常組織中的NOD樣受體蛋白同樣參與了CMEC損傷過程，受缺血再灌注影響，CMEC的NOD樣受體蛋白水平增高，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的活性上升，白細(xì)胞介素-1（IL-1）及IL-18表達(dá)水平明顯提高，誘發(fā)局部出現(xiàn)炎性反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能受損。原因可能與缺血再灌注期間的激活NOD樣受體蛋白相關(guān)。此外，在相同的體系中放入ROS清除劑之后，NOD樣受體蛋白與NLRP3炎癥小體之間的相互作用解除，且下游信號亦會(huì)明顯受到抑制，提示，ROS亦可能是激活NLRP3炎癥小體上游信號。此外，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞中很少出現(xiàn)NLRP3蛋白表達(dá)，但其在CMEC中存在表達(dá)，這亦進(jìn)一步說明，NLRP3炎癥小體在CMEC病理的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［19］。

CMEC的提取和鑒定

現(xiàn)階段有關(guān)CMEC的相關(guān)研究多選擇大鼠原代CMEC作為研究對象，但原代CMEC的培養(yǎng)、純化以及分離等相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟的難度相對較大，且分離期間常會(huì)引入平滑肌細(xì)胞、纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞，同時(shí)在傳代期間亦會(huì)喪失細(xì)胞的部分特性，導(dǎo)致細(xì)胞活性及純度下降，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)于CMEC的研究難度受到極大限制［20］。而隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，關(guān)于CMEC分離純化的研究取得了巨大進(jìn)步，現(xiàn)階段已有包括磁珠、組織塊貼壁以及雙酶消化法3種分離法。而關(guān)于CMEC的鑒定主要包括標(biāo)志物鑒定以及形態(tài)鑒定。

總結(jié)與展望

隨著對CMEC的持續(xù)研究，關(guān)于CMEC相關(guān)的病理分子機(jī)制已逐漸得以揭示，本研究綜述了關(guān)于CMEC功能障礙的相關(guān)研究進(jìn)展，其中包括衰老、代謝、ROS、NOS以及炎癥等信號傳導(dǎo)，其涉及的相關(guān)分子機(jī)制較為復(fù)雜，但就目前相關(guān)研究可知ROS處于CMEC損傷的核心區(qū)域，在高糖、缺血、高血壓以及高游離脂肪酸所誘發(fā)的細(xì)胞損傷中，雖然觸發(fā)多種信號通路，促使細(xì)胞凋亡、NOS的活性降低、代謝異常等細(xì)胞表現(xiàn)，但究其根本均ROS的大量積累發(fā)揮了極為重要的作用。目前已闡明部分有關(guān)ROS與CMEC損傷的信號通路，但具體機(jī)制及因果關(guān)系還需對其進(jìn)一步研究，但ROS在CMEC中發(fā)揮的功能是可以確定的。此外，雖然已有部分保護(hù)CMEC功能的相關(guān)藥物研究，但針對CMEC干涉藥物直接轉(zhuǎn)化至臨床應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道較少，有關(guān)上述診斷及相關(guān)治療的問題仍是今后需要研究的重點(diǎn)。冠狀動(dòng)脈微血管疾病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其涉及眾多組織及細(xì)胞，除CMEC外，心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及免疫細(xì)胞等均參與了冠狀動(dòng)脈微血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。本研究僅綜述了部分CMEC損傷的相關(guān)分子機(jī)制，而了解冠狀動(dòng)脈微血管疾病還需今后更為全面進(jìn)行解析各種細(xì)胞信號傳導(dǎo)以及組織之間的交叉對話。隨著醫(yī)學(xué)水平的不斷發(fā)展及分子生物學(xué)技術(shù)持續(xù)進(jìn)步，相信關(guān)于冠狀動(dòng)脈微血管疾病的問題將會(huì)被逐漸揭示。