劉思源，何辰慶，陳軍軍，葉幼榮，張 健，商 鵬*，強巴央宗

（1.西藏農(nóng)牧學院動物科學學院，西藏林芝 860000；2.西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏林芝 860000）

生豬養(yǎng)殖在我國養(yǎng)殖行業(yè)中長久以來都占據(jù)著重要位置。而生長性狀是生豬養(yǎng)殖行業(yè)中最重要的經(jīng)濟性狀，由多種因素共同調(diào)控。隨著現(xiàn)代化養(yǎng)殖的發(fā)展和我國科研水平的提升，將遺傳性狀的分子調(diào)控機制研究與現(xiàn)代育種相結(jié)合，已成為種業(yè)提升大背景下的重要技術(shù)手段[1-2]。藏豬長期生活于我國青藏高原地區(qū)，是典型的高原小型豬種，常被作為試驗材料應用于豬生長性狀的研究中[3]。由于藏豬抗逆性強、沉脂力高、生長緩慢、出欄周期較長，無法滿足商業(yè)需求。所以，通過分子技術(shù)手段，對影響基因轉(zhuǎn)錄進程的起始密碼子上游3 kb 區(qū)域（含基因啟動子區(qū)和5'UTR 區(qū)）進行挖掘，探究基因表達模式，有利于提高藏豬生長性能，能夠從一定程度上推進藏豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4-5]。

CXC 基序趨化因子配體10（CXCL10）屬于趨化因子CXC 家族，定位于豬第8 號染色體上，包含3 個內(nèi)含子、4 個外顯子，主要由成纖維細胞、肝實質(zhì)細胞等多種細胞產(chǎn)生[6-7]，被視作多功能的分泌因子。最新研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10基因是一種新的肌肉生長因子，能夠參與多種生物學進程，如控制胰島素分泌，抑制肌細胞增長和肌內(nèi)血管生成，是肌肉代謝相關(guān)網(wǎng)絡中的重要節(jié)點和樞紐基因，與動物的生長發(fā)育密切相關(guān)[8-10]。本團隊前期對藏豬、大約克夏豬背最長肌組織RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10基因富集于肌肉生長調(diào)控機制相關(guān)通路上，是參與肌肉生長發(fā)育的關(guān)鍵功能候選基因[11]。

本研究將地方重要品種資源藏豬和引進豬種大約克夏豬作為實驗動物，利用一代測序Sanger 法對CXCL10起始密碼子上游3 kb 區(qū)域進行SNP 篩選，通過RT-qPCR 技術(shù)對2 個豬種的不同組織（背最長肌、腿肌、肝臟）進行mRNA 水平檢測，從而探究CXCL10基因在豬生長發(fā)育性狀中發(fā)揮的作用，為藏豬這一地方品種的種質(zhì)資源保護及品種改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究選取藏豬（TP）和大約克夏豬（YY）為研究對象，藏豬來自西藏農(nóng)牧學院實習牧場，大約克夏豬來自林芝市宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。采集藏豬（TP，n=46）和大約克夏豬（YY，n=57）的耳組織用于提取DNA。隨機選取飼養(yǎng)模式相同的健康去勢公豬藏豬和大約克夏豬各10 頭，飼養(yǎng)至180 日齡進行屠宰，采集背最長肌、腿肌和肝臟組織，置于液氮中冷凍保存，用于RNA 提取。

1.2 DNA、RNA 的提取及cDNA 制備 使用苯酚-氯仿法從豬耳組織中提取基因組DNA，-20℃凍存[12]。根據(jù)北京天根生化科技有限公司總RNA 提取試劑盒說明書（DP171221），北京天根快速反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒說明書（KR180123），提取總RNA 并合成cDNA，置-20℃保存。

1.3 SNPs 篩選及基因分型引物設計 登錄GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下載豬CXCL10基因DNA 序列（登錄號：NC_010446.5），采用Primer Premier 5.0 軟件進行引物設計，擴增起始密碼子上游3 kb 區(qū)域，特異性檢驗后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RNase-Free ddH2O 溶解，4℃保存。引物信息見表1。

表1 CXCL10 基因5'UTR 引物信息

1.4 轉(zhuǎn)錄因子預測 從Gene Bank 下載CXCL10基因組序列，使用在線網(wǎng)站CONSITE（http://jaspar.binf.ku.dk/）預測SNP 位點突變前后轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的變化。

1.5 實時熒光定量PCR 引物設計 NCBI 官網(wǎng)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載基因的mRNA 序列，選取CXCL10（登錄號：NM_001008691）為目的基因，選取GAPDH（登陸號：NM_001206359.1）作為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0 軟件進行引物設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成，合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4℃保存。引物信息見表2。

表2 CXCL10 基因和GAPDH 基因定量引物信息

1.6 實時熒光定量PCR 以cDNA 為模板，選用GAPDH為內(nèi)參基因，藏豬和大約克夏豬待測樣品每個樣品設置3 個重復，實時熒光定量PCR 擴增體系（總體積為20 μL）：上下游引物各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，cDNA模板0.8 μL，RNase-free ddH2O 8.2 μL。利 用實時熒光定量PCR 儀（羅氏，Light Cycler96）進行擴增。實時熒光定量PCR 擴增程序為三步法：95℃預變性900 s；95℃變性30 s，57℃退火20 s，72℃延伸30 s，65℃再延伸60 s。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用DNAMAN 6.0 和Chromas Pro 2.1.3 軟件分析個體測序結(jié)果，對SNP 位點進行篩選。利用SPSS 18.0 軟件χ2檢驗分析各突變位點的基因頻率和基因型頻率差異，對CXCL10基因表達量進行單因素方差分析。對RT-qPCR 結(jié)果，采用2-ΔΔCt方法計算CXCL10基因的mRNA 相對表達量。使用Excel 進行整理，并使用Sigma Plot 10.0 制圖。數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

樣品目的基因表達量采用2-ΔΔCt法計算：

ΔCt（樣品）=Ct（樣品目的基因）-Ct（樣品內(nèi)參基因）

ΔCt（標準樣）=Ct（標準樣目的基因）-Ct（標準樣內(nèi)參基因）

ΔΔCt=ΔCt（樣品）-ΔCt（標準樣）

目的基因表達量=2-ΔΔCt

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳檢測CXCL10基因以DNA 為模板的普通PCR 產(chǎn)物可見清晰的1 095 bp 條帶（圖1），擴增產(chǎn)物特異性較好，滿足下一步實驗需求。

圖1 CXCL10 基因普通PCR 產(chǎn)物

2.2 SNPs 篩選與功能預測 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CXCL10基因起始密碼子上游3 kb 存在3 個SNP 位點，分別記為：T-832G、A-808G、T-694C。測序峰圖如圖2 所示。運用Excel 10.0 計算各個突變位點的基因頻率和基因型頻率，經(jīng)卡方檢驗顯示這3 個突變位點均符合哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律，藏豬與大約克夏豬基因頻率存在極顯著差異。基因型頻率和基因頻率見表3。

表3 CXCL10 基因多態(tài)性位點基因型頻率和等位基因頻率

圖2 CXCL10 基因突變位點測序峰圖

通過轉(zhuǎn)錄因子預測，發(fā)現(xiàn)SNP 位點堿基突變前后CXCL10基因起始密碼子上游3 kb 2 個SNP 位點（T-832G、A-808G）突變后轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點消失，T-832G 處突變導致ARGFX、ARID3B 結(jié)合位點消失，A-808G 突變導致ARID3A 結(jié)合位點消失。

2.3 總RNA 提取 藏豬和大約克夏豬各組織RNA 提取結(jié)果見圖3。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示18S 和28S 條帶清晰，無DNA 污染和降解現(xiàn)象。使用Nano Drop 2000檢測RNA 質(zhì)量，260/280 和260/230 值均在2.0 左右，可滿足后續(xù)實驗要求。

圖3 RNA 提取結(jié)果

2.4CXCL10基因mRNA 表達 利用RT-qPCR 技術(shù)對CXCL10基因在藏豬和大約克夏豬背最長肌、腿肌、肝臟組織中的表達水平進行檢測，結(jié)果如圖4 所示，背最長肌、腿肌、肝臟這3 個組織中CXCL10基因表達量均為藏豬極顯著高于大約克夏豬。

圖4 CXCL10 基因在TP、YY 2 個品種豬背最長肌、腿肌和肝臟中mRNA 的相對表達量

3 討 論

據(jù)Pan 等[13]研究，CXCL10基因是肌肉發(fā)育調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中的樞紐，而存在基因點突變可能會通過轉(zhuǎn)錄因子的改變影響基因功能和轉(zhuǎn)錄效率。本研究在CXCL10基因起始密碼子上游3 kb 區(qū)域發(fā)現(xiàn)了3 個SNP 位點（T-832G、A-808G 和T-694C），且經(jīng)卡方檢驗顯示藏豬和大約克夏豬基因頻率間存在極顯著差異（P＜0.01）。其中T-832G、A-808G 位點與地方豬種民豬中的發(fā)現(xiàn)一致，暗示該位點可能導致豬瘦肉率低、生長速度慢等[14]。經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子預測，T-832G 和A-808G 位點堿基突變前后ARID3A、ARID3B、ARGFX 3 個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點消失，其中結(jié)合位點ARGFX 是同源框超家族的中心成員，控制細胞分化和胚胎致密化，主要參與細胞周期的調(diào)控[15-16]；ARID3A/B 屬于ARID（富含AT 的相互作用域）轉(zhuǎn)錄因子的亞家族成員，同樣參與細胞的增殖、分化和發(fā)育，且通過REKLES 域結(jié)合，共同促進細胞增殖并顯著提高細胞存活水平[17-19]。由此推測，隨著ARID3A、ARID3B、ARGFX 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的消失，可能導致CXCL10基因功能轉(zhuǎn)變，從而影響肌肉細胞的增殖分化。

根 據(jù)Guiraud[21]、Hathout[21]、Alayi 等[22]研究，CXCL10基因通過與G 蛋白偶聯(lián)受體和整合素相互作用來發(fā)揮其生物活性，并在高濃度血糖、脂肪酸水平下增強表達，抗細胞增殖，被認為是肌萎縮蛋白表達的相關(guān)生物標志物。本研究發(fā)現(xiàn)CXCL10基因在藏豬背最長肌、腿肌和肝臟組織中的表達均極顯著高于大約克夏豬，結(jié)合脂肪型豬種藏豬相對于國外豬種體型較小、肌肉生長速度較慢的特點，推測當動物機體內(nèi)血糖濃度過高時，刺激CXCL10基因高表達，繼而促進血糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹竞偷鞍踪|(zhì)，反之，當CXCL10基因低表達時，抑制血糖向脂肪和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變，使之作用于機體的能量消耗。這與Michal 等[23]發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)不良群體存在肌纖維萎縮、脂肪填充增多現(xiàn)象呈一致性。諸多證據(jù)表明，CXCL10基因在肌肉生長發(fā)育中呈負調(diào)控作用，聯(lián)合一代測序結(jié)果及RT-qPCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在藏豬和大約克夏豬中，CXCL10基因的SNP 差異情況與熒光定量結(jié)果的差異性趨于一致[24-25]。綜上所述，推測CXCL10基因中所存在的T-832G、A-808G 和T-694C 這3 個突變位點可能是影響豬肌肉生長發(fā)育的關(guān)鍵功能位點。

4 結(jié) 論

綜上所述，通過對藏豬和大約克夏豬CXCL10基因起始密碼子上游3 kb DNA 序列多態(tài)性分析和背最長肌、腿肌、肝臟組織中CXCL10基因的mRNA 表達量檢測發(fā)現(xiàn)，在2 個豬種中，該基因存在3 個SNP 位點（T-832G、A-808G 和T-694C），mRNA 水平表達量表現(xiàn)為背最長肌、腿肌中藏豬表達量極顯著高于大約克夏豬，其差異性與SNP 差異性趨于一致，認為可能是這3 個SNP 位點的突變影響豬肌肉生長發(fā)育，推測CXCL10基因在肌肉組織生成中起到負向調(diào)控作用。研究結(jié)果為進一步探究豬肌肉生長發(fā)育機理提供材料基礎。