彭飛，周彥鋒，*，王晨赫，張希昭，羅宇婷，唐雪梅，周依帆，王東偉

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214081)

淮河(31°55′～36°36′N，111°55′～120°25′E)是中國(guó)的七大河流之一，其下游主要流經(jīng)的地域?yàn)榘不帐『徒K省，為最典型的生態(tài)交錯(cuò)帶流域之一[1]。流域中還包含中國(guó)第四大淡水湖——洪澤湖，該湖屬平原水庫(kù)型湖泊，西納淮河，東入長(zhǎng)江和黃海，對(duì)維持流域生態(tài)穩(wěn)定作用顯著[2]。近年來(lái)，淮河及其流域環(huán)境污染嚴(yán)重[3-7]。目前，有關(guān)淮河流域的研究多集中于水體水質(zhì)的空間異質(zhì)性和水生生物的種類及分布特征等方面，包括淮河流域夏季降水年代際變化特征及相應(yīng)的大氣環(huán)流異常[8]、淮河(安徽段)沉積物中微量元素的空間分布規(guī)律[9]、污染特征及潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)、近30年來(lái)淮河流域和洪澤湖水質(zhì)的演變趨勢(shì)[1]、淮河干流沉積物中重金屬含量及分布特征[10]等。微生物是河流環(huán)境有機(jī)物分解的重要組成部分，對(duì)水體中的化學(xué)、物理和生態(tài)環(huán)境的變化非常敏感，其組成可以用于評(píng)估生態(tài)狀況和水質(zhì)。已有學(xué)者研究了長(zhǎng)江中上游[11-12]、長(zhǎng)江下游[13]和黃河[14-15]等中國(guó)主要河流流域中微生物的組成特征，而關(guān)于淮河微生物組成和分布特征的研究尚未見(jiàn)報(bào)道?；春友匕冻鞘蟹植驾^為密集，其水質(zhì)安全與人體健康、社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展等密切相關(guān)，尤其是微生物污染風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越受到學(xué)者重視[16]，對(duì)其微生物群落結(jié)構(gòu)組成和分布差異及其環(huán)境影響因素的研究，有利于全面地評(píng)估淮河中下游的水質(zhì)健康狀況。

本研究中，以淮河中下游流域安徽-江蘇段為研究對(duì)象，利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析水體中菌群的分布，探究不同生境菌群的空間差異及其環(huán)境影響因子，并評(píng)估水體污染的程度，以期為淮河流域內(nèi)不同水環(huán)境的水體狀況監(jiān)測(cè)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域及采樣站位

研究區(qū)域位于安徽-江蘇段淮河流域，于2019年3月5日—12日(枯水期)采集水樣。采樣點(diǎn)分4組：中游安徽段的3個(gè)斷面，其附近的支流匯入繁雜，劃為支流組(ZL)，洪澤湖斷面單獨(dú)列為洪澤湖組(HZ)，下游江蘇段4個(gè)斷面均位于主河道，劃為河道組(YH)，淮河入江口斷面劃為入江口組(HK)。9個(gè)采樣點(diǎn)由上游至下游依次為阜陽(yáng)南照(FY，32°36′32″N，116°00′31″E)，鳳臺(tái)(FT，32°41′12″N，116°41′34″E)，蚌埠閘(BB，32°57′34″N，119°09′10″E)，洪澤湖(HZ， 33°17′07″N，117°17′05″E)，高良澗閘前(GL，33°19′29″N，118°51′33″E)，淮安閘前(HA， 33°28′14″N，119°09′31″E)，淮安閘與邵伯閘之間(SB，33°08′33″N，119°22′51″E)，邵伯閘與施橋閘(SQ，32°28′13″N，119°29′26″E)，河道入江口(HK，32°16′53″N，119°28′39″E)(圖1)。

圖1 淮河流域中下游水體樣本采集位點(diǎn)Fig.1 Collection sites of water samples in the middle and lower reaches of the Huaihe River Basin

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和水體理化指標(biāo)測(cè)定 每個(gè)位點(diǎn)采集3個(gè)樣品，全部27個(gè)樣品均利用1 L無(wú)菌手持式柱狀玻璃采水器采集，取0.5 L表層水環(huán)境樣本，裝入無(wú)菌玻璃瓶中，現(xiàn)場(chǎng)將樣品過(guò)濾到孔徑為0.22 μm的聚酯纖維濾膜上，將濾膜放入無(wú)菌的凍存管中置于液氮中保存，回到實(shí)驗(yàn)室后立刻轉(zhuǎn)移至-20 ℃冰箱中保存，樣品采集完成后兩周內(nèi)完成DNA樣本的提取。

1.2.2 DNA的提取和高通量測(cè)序 將采集的濾膜剪碎，置于50 mL離心管中，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取。采用E.Z.N.A.?Water DNA Kit(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)提取基因組DNA，并用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量。選用細(xì)菌16S rRNA通用引物341F(5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3′)和806R(5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃下預(yù)變性2 min；95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，判斷擴(kuò)增后的DNA濃度是否達(dá)到了試驗(yàn)擴(kuò)增要求。在武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司的Illumina Hiseq2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 高通量測(cè)序結(jié)果初篩和數(shù)據(jù)分析 首先運(yùn)用QIIME 1.8.0軟件(quantitative insights into microbial ecology，http://qiime.org/)[19]識(shí)別疑問(wèn)序列，除要求序列長(zhǎng)度≥150 bp且不允許存在模糊堿基N之外，還將剔除5′端引物錯(cuò)配堿基數(shù)>1的序列和含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列。隨后調(diào)用Usearch 5.2.236程序(http://www.drive5. com/usearch/)檢查并剔除嵌合體序列。

所有數(shù)據(jù)均采用QIIME軟件和R 3.2.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)Greengenes(Release 13.8)[20]數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所得到的OTU進(jìn)行分類比對(duì)，采用QIIME軟件獲取各樣本在門、綱、目、科和屬5個(gè)分類水平上的組成和豐度分布，對(duì)OTU豐度矩陣中每個(gè)樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機(jī)抽樣，以每個(gè)深度下抽取到的序列數(shù)及其對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)繪制稀釋曲線，并對(duì)每個(gè)樣本計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao1、Ace、Simpson和Shannon指數(shù)。通過(guò)Galaxy在線分析平臺(tái)(http://huttenhower.sph. harvard.edu/galaxy/)，對(duì)菌群相對(duì)豐度矩陣進(jìn)行LEfSe分析，其中，LDA score=效應(yīng)系數(shù)×標(biāo)準(zhǔn)化后的特征向量，并對(duì)該值進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。

1.2.4 富營(yíng)養(yǎng)化評(píng)價(jià) 依據(jù)《湖泊(水庫(kù))富營(yíng)養(yǎng)化評(píng)價(jià)方法及分級(jí)技術(shù)規(guī)定》(中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，總站生字[2001]090號(hào))，采用綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)TLI(∑)評(píng)價(jià)各采樣點(diǎn)的富營(yíng)養(yǎng)化狀況。綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：TLI(∑)>50時(shí)為富營(yíng)養(yǎng)，50～60時(shí)為輕度富營(yíng)養(yǎng)，60～70時(shí)為中度富營(yíng)養(yǎng)，70～100時(shí)為重度富營(yíng)養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用IBM SPSS Statistics 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析，采用單因素(one-way ANOVA)和Tamhane’s T2法進(jìn)行方差分析及多重比較(α=0.05)。采樣圖使用ArcGIS 10.2軟件繪制，其他圖表采用Origin 2017和OmicShare Tools軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 淮河中下游水質(zhì)指標(biāo)的空間差異性

水質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，淮河中下游的水體污染源主要為氮污染。根據(jù)綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，可以看出，除入江口外的其余斷面水質(zhì)均有不同程度的富營(yíng)養(yǎng)化，其中，阜陽(yáng)達(dá)到了中度富營(yíng)養(yǎng)(表1)。

表1 各站位環(huán)境因子平均值Tab.1 Average values of environmental factors in all sites

2.2 淮河中下游水環(huán)境菌群的空間差異性

2.2.1 菌群的多樣性特征 經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢查和數(shù)據(jù)過(guò)濾后，從27個(gè)水環(huán)境樣本中共獲得945 846個(gè)序列，每個(gè)樣品平均35 031個(gè)讀數(shù)(每個(gè)樣品 31 057～38 934個(gè)讀數(shù))。9個(gè)采樣點(diǎn)的OTU數(shù)量和Alpha多樣性指數(shù)見(jiàn)表2，各分組的特有OTU數(shù)分別為支流(31)、入江口(87)、河道(39)和洪澤湖(7)，入江口的細(xì)菌群落豐富度高于其他3組，而多樣性最高的是淮安閘，最低的是阜陽(yáng)。

對(duì)淮河中下游微生物群落的多樣性與環(huán)境因子進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析之前，對(duì)本研究中選取的15個(gè)環(huán)境數(shù)據(jù)進(jìn)行共線性檢驗(yàn)，其中，VIF>10時(shí)表示共線性顯著，VIF為0～10時(shí)表示共線性不顯著。在SPSS分析中剔除共線性顯著的環(huán)境因子后，得到可以作為研究微生物多樣性的影響因子。

表2 水樣細(xì)菌群落的豐度和Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of abundance and alpha diversity of bacterial communities in water samples

表3 Alpha多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù) R)Tab.3 Pearson correlation analysis between diversity index and environmental factors

2.2.2 微生物群落組成 將所有水體樣本的OTU以97%的相似性閾值對(duì)其進(jìn)行聚類，共鑒定出31門86綱148目229科326屬細(xì)菌。各水體中微生物相對(duì)豐度排名前10的菌門如表4所示，其中，放線菌門Actinobacteria(各水體中相對(duì)豐度范圍為30.1%～48.47%)、變形菌門Proteobacteria(25.36%～35.86%)和擬桿菌門Bacteroidetes(15.73%～31.76%)為所有水體樣本中共同的優(yōu)勢(shì)類群，其余比例大于1%的門類細(xì)菌有2種，分別為疣微菌門Verrucomicrobia(2.05%～10.45%)和浮霉菌門Planctomycetes(0.59%～9.85%)。放線菌門主要由放線菌綱Actinobacteria(32.28%)組成，變形菌門主要由β-變形菌綱Betaproteobacteria(19.66%)、α-變形菌綱Alphaproteobacteria(4.90%)和γ-變形菌綱Gammaproteobacteria(3.53%)組成，擬桿菌門中黃桿菌綱Flavobacteriia和鞘脂桿菌綱Sphingobacteriia豐度最高。

每個(gè)分類單元在所有個(gè)體上的分布是不均勻的，門水平上，洪澤湖的浮霉菌門Planctomycetes豐度最高(P<0.05)，變形菌門在蚌埠和入江口水樣中相對(duì)豐度最高，分別為35.02%和32.68%，在其他站位的相對(duì)豐度范圍為26.41%～29.76%，擬桿菌門在洪澤湖進(jìn)入河道后豐度急劇增加，在淮安閘樣點(diǎn)豐度最高(30.75%)，至入江口時(shí)豐度又逐漸降低。入江口和支流樣本中放線菌綱的豐度較高(35.63%, 37.10%)，且入江口組的β-變形菌綱(25.75%)豐富度最高。浮霉菌綱Planctomycetia(8.5%)和Δ-變形菌綱Deltaproteobacteria(1.25%)在安徽段的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于下游江蘇段，并且在洪澤湖中豐度最高，越往下游豐度越低。

從圖2可見(jiàn)，在屬水平上，黃桿菌屬Flavobacterium、紅育菌屬Rhodoferax和Limnohabitans屬在各位點(diǎn)中豐度最高，其余平均豐度超過(guò)1%的菌屬有多核桿菌屬Polynucleobacter、Fluviicola、沉積物桿狀菌屬Sediminibacterium和甲基嬌養(yǎng)桿菌屬M(fèi)ethylotenera等。河道組擁有發(fā)酵單胞菌屬Zymomonas和甲基養(yǎng)菌屬M(fèi)ethylibium兩種特有的菌屬，而HTCC、弓形桿菌屬Arcobacter和突柄桿菌屬Prosthecobacter則為河道組外的其他位點(diǎn)所特有。此外，阜陽(yáng)的組線蟲(chóng)共生菌屬Candidatus_Xiphinematobacter和Luteolibacter占比顯著高于其他位點(diǎn)。圖2中菌屬對(duì)應(yīng)的顏色越接近藍(lán)色表示其豐度越低，顏色越接近紅色表示其豐度越高。

表4 水體微生物在門水平上的相對(duì)豐度組成(相對(duì)豐度排名前10的菌門)

圖2 各樣本屬水平菌群結(jié)構(gòu)組成熱圖Fig.2 Heat map of the the structure and composition of bacterial flora at each sampling site at genus level

使用線性判別分析(LDA)效應(yīng)量(LEfSe)算法比較了4組水體樣本的微生物組成(相對(duì)豐度)的差異(圖3)。根據(jù)多種假設(shè)檢驗(yàn)校正的Wilcoxon非參數(shù)t檢驗(yàn)，38個(gè)物種的OTU存在顯著性差異(P<0.05)，其中，支流和洪澤湖兩組差異性菌群與其他兩組相差較大。

圖3 基于LEfSe分析的分類譜系圖Fig.3 Taxonomic cladogram obtained from LEfSe analysis

2.3 環(huán)境因子與微生物群落的相關(guān)性分析

將各分組共有菌屬中豐度排名較高和各位點(diǎn)特有的菌屬與環(huán)境因子做Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4所示，其中綠色框中為環(huán)境因子與優(yōu)勢(shì)菌屬的相關(guān)關(guān)系。

圖4 屬水平優(yōu)勢(shì)菌屬與環(huán)境因子的Pearson相關(guān)性分析Fig.4 Pearson correlation analysis between dominant bacteria and environmental factors at genus level

3 討論

3.1 微生物群落的空間分布特征

自然水域中的微生物數(shù)量巨大，其對(duì)有機(jī)物降解及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)過(guò)程具有重要作用,是水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。全面了解水體微生物群落多樣性、分布特征及其在生態(tài)系統(tǒng)中的功能和作用，對(duì)于管理和維護(hù)淮河中下游水生態(tài)環(huán)境具有深遠(yuǎn)的意義[21]。本研究中，采用 16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)淮河流域中下游(安徽-江蘇段)水環(huán)境的細(xì)菌多樣性進(jìn)行探究，結(jié)果表明，放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和浮霉菌門在各點(diǎn)位均有相對(duì)較高的豐度分布，這一結(jié)果也與其他關(guān)于淡水環(huán)境菌群的研究結(jié)果較為相似[22-23]，這些類群與石油烴的降解和外來(lái)無(wú)機(jī)化合物的降解有較大關(guān)系[24]，但不同空間分布的水體樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異性。厚壁菌門在淡水中也是較為常見(jiàn)的類群，但在本研究中其豐度極低，有研究表明，厚壁菌門與徑流量呈正相關(guān)[25]，2002年蚌埠閘擴(kuò)建后淮河中下游河段流量的年平均極值降低，水流速度較為緩慢[1-2]，推斷可能是導(dǎo)致本研究中厚壁菌門豐度極低的主要原因。

OTU1，OTU3 and OTU8—ACK-M1； OTU4—Gemmataceae； OTU6—Polynucleobacter； OTU7—Acidimicrobiales,C111；OTU11—Flavobac- terium；OTU17—Rhodoferax；OTU26,OTU29—Methylotenera_mobilis.圖5 微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的CCA分析Fig.5 CCA analysis between microbial composition and environmental factors at the OTU level

安徽段支流中疣微菌門的相對(duì)豐度顯著高于其他位點(diǎn)，此菌門一般在水環(huán)境或土壤中被發(fā)現(xiàn)，其中，疣微菌科Verrucomicrobiaceae多被發(fā)現(xiàn)在人類糞便中，同樣氣單胞菌科Aeromonadaceae也是人體和魚類腸道中的病原菌，這可能與在淮河安徽段選取的3個(gè)位點(diǎn)沿岸受城市污水的影響較大有關(guān)。

洪澤湖中浮霉菌門的相對(duì)豐度較高，常發(fā)現(xiàn)該菌存在于污水處理系統(tǒng)中，另外，洪澤湖富含的黃桿菌屬，常發(fā)現(xiàn)于酸沼澤及污水處理廠中，這與各種水體和土壤污染相關(guān)[26]。

河道中的高良澗閘、淮安閘和邵伯閘均位于淮安市，與其他位點(diǎn)不同，淮安閘的次級(jí)優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門，且由阜陽(yáng)至淮安閘呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，淮安閘位點(diǎn)豐度最高，藍(lán)菌門的豐度趨勢(shì)與擬桿菌門相同，這兩種菌門均為淡水環(huán)境的常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌門[27]。有研究表明，擬桿菌門豐度受藍(lán)細(xì)菌影響較大[28-30]，擬桿菌門中的類群可進(jìn)一步沉降和分解有機(jī)物，還有研究表明，其中的黃桿菌科Flavobacteriaceae等異養(yǎng)細(xì)菌在聚合物的微生物降解中發(fā)揮著重要作用，這對(duì)于水生生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展具有非常重要的作用[28-30]，它們還可以通過(guò)降解來(lái)源于藍(lán)藻等藻類的有機(jī)質(zhì)來(lái)獲得自身生長(zhǎng)的能量來(lái)源[31]?；春又邢掠窝匕冻鞘形鬯欧旁谝欢ǔ潭壬蠈?dǎo)致藍(lán)藻等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增多，從而影響擬桿菌門在水環(huán)境中的豐度。河道豐度較高的鞘脂單胞菌目通常在受污染的土壤中分離，其中一些物種能夠利用多環(huán)芳烴(PAH)作為碳源，這種菌屬的發(fā)現(xiàn)，可能與受到了船舶污染有關(guān)。發(fā)酵單胞菌屬和甲基養(yǎng)菌屬為河道特有的兩種菌屬，發(fā)酵單胞菌屬具有MTBE(甲基叔丁基醚，Methyl tert-butyl ether)降解能力[32]，甲基養(yǎng)菌屬則是一種運(yùn)用于乙醇發(fā)酵的菌屬[33]，這兩種特有菌屬的發(fā)現(xiàn)可能與河道沿岸的工業(yè)發(fā)展有關(guān)。

入江口中變形菌門和酸桿菌門豐度較高，變形菌門中的較多菌群是重金屬污染土壤中的優(yōu)勢(shì)類群[34]，酸桿菌門一般被認(rèn)為是生活在重金屬污染區(qū)域等酸性較強(qiáng)的環(huán)境中[35]，這說(shuō)明入江口可能存在酸化現(xiàn)象。另外，入江口還富集β-變形菌綱，它對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)的選擇性，其中具有較多與反硝化相關(guān)的菌群，而伯克氏菌目Burkholderiales、從毛單胞菌科Comamonadaceae中的部分菌種均與重金屬及石油污染相關(guān)[36-40]。由于入江口所處的特殊地理位置，以及多種因子間的交互作用，導(dǎo)致入江口處微生物多樣性極其復(fù)雜，這種情況與渤海三灣有相似之處，均是受到了人類活動(dòng)和河口輸出的影響[41-42]。

3.2 微生物組成與環(huán)境因子間的關(guān)系

參照《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》可發(fā)現(xiàn)，本次采樣各位點(diǎn)中的氮含量相對(duì)較高，同時(shí)結(jié)合微生物組成的結(jié)果，黃桿菌屬為反硝化細(xì)菌[43]，紅育菌屬為異養(yǎng)脫氮菌[44]，Limnohabitans屬的作用是參與氮循環(huán)和分解藍(lán)藻[11]，這3種菌屬為各分組豐度排名前3的共有菌屬，其他占比超過(guò)1%的菌屬Fluviicola(利用硝態(tài)氮)、沉積物桿狀菌屬[45]和甲基嬌養(yǎng)桿菌屬(脫氮菌屬)，它們的功能均指向水體中的氮利用。微生物群落也是水體富營(yíng)養(yǎng)程度的重要生態(tài)指標(biāo)，放線菌門在各采位點(diǎn)中均占主導(dǎo)地位，這與本次調(diào)查中普遍存在的水體富營(yíng)養(yǎng)化密切相關(guān)[46]。

4 結(jié)論

1)淮河中下游水體普遍存在富營(yíng)養(yǎng)化情況，水質(zhì)指標(biāo)評(píng)價(jià)中總氮濃度普遍偏高，以及多種豐度較高的菌屬與氮的相關(guān)關(guān)系，反映了各采樣點(diǎn)的氮污染情況。

2)放線菌門、變形菌門和擬桿菌門是所有位點(diǎn)中共同的優(yōu)勢(shì)菌門，而安徽段疣微菌門相對(duì)豐度較高，洪澤湖中浮霉菌門的相對(duì)豐度較高，入江口中變形菌門和酸桿菌門相對(duì)豐度較高；黃桿菌屬、紅育菌屬和Limnohabitans屬在各位點(diǎn)中豐度最高，發(fā)酵單胞菌屬和甲基養(yǎng)菌屬是河道組特有的菌屬，而HTCC、弓形桿菌屬和突柄桿菌屬則是入江口、支流和洪澤湖3個(gè)生境組所特有。優(yōu)勢(shì)類群的差異與不同生境組的污染狀況及地理位置密切相關(guān)。