陳鋒，孟順龍，陳家長，裘麗萍，范立民，宋超，鄭堯，李丹丹，胡庚東

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081)

滅多威(methomyl)別名滅多蟲，是一種常用的高毒性殺蟲劑[1],其通過觸殺作用殺蟲，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)。然而，滅多威因生產(chǎn)上使用過于頻繁，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生極大的危害[2]。滅多威可通過地表徑流方式釋放到水體中，造成水環(huán)境污染[3]。由于滅多威在土壤中具有強(qiáng)流動(dòng)性、高水溶性等特性，容易污染周圍水體，特別是地下水，并威脅人類飲水安全[4]。對(duì)中國浙江省 2010年的調(diào)查顯示，超過10 個(gè)市級(jí)水源地被檢測(cè)出存在滅多威殘留，殘留濃度最高值可達(dá)0.172 μg/L[5]，甚至有研究發(fā)現(xiàn)，在田頭水渠檢測(cè)出高達(dá) 650 μg/L的滅多威[6]。在國外，滅多威殘留已在多個(gè)國家的地表水中被檢測(cè)出，20 世紀(jì)80年代，滅多威殘留在美國地表水中被檢出，殘留最大值達(dá) 2 μg/L[7]。1997年世界野生動(dòng)物基金會(huì)將滅多威列為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors，EDCs)[8]。EDCs會(huì)干擾生物的生殖功能，從而導(dǎo)致生殖障礙[9]。滅多威主要作用于乙酰膽堿酯酶，可抑制其活性，并導(dǎo)致神經(jīng)組織衰竭，從而殺死昆蟲，其具有迅速、作用力強(qiáng)等特點(diǎn)，長期接觸滅多威，可導(dǎo)致動(dòng)物的肝毒性、細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性[10-12]。

作為水生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)者的微藻，是監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)水環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)[13]。浮游動(dòng)物常以微藻為食，是水環(huán)境的初級(jí)消費(fèi)者。大型溞Daphniamagna作為浮游動(dòng)物中最常見的模式生物，是水環(huán)境食物鏈傳遞的樞紐[14]。魚類是生態(tài)環(huán)境中不可或缺的部分，而斑馬魚Daniorerio是一種最常見的并以浮游動(dòng)物為食的魚類，是水環(huán)境的次級(jí)消費(fèi)者[15]。目前，食物鏈富集研究已引起許多研究人員的關(guān)注， Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，通過食物攝入方式，C60可從大型溞轉(zhuǎn)移到斑馬魚體內(nèi)，并在斑馬魚的腸道產(chǎn)生富集。Rehman等[17]研究發(fā)現(xiàn)，砷可以通過食物鏈低營養(yǎng)級(jí)傳遞到人類體內(nèi)并產(chǎn)生富集，其富集量是通過水暴露攝入的幾倍，嚴(yán)重危害人類身體健康安全。此外，關(guān)于水中微塑料食物鏈傳遞研究發(fā)現(xiàn)，隨著食物鏈的轉(zhuǎn)移，處于食物鏈頂端的人類體內(nèi)的微塑料會(huì)發(fā)生生物累積[18]。然而，目前國內(nèi)外相關(guān)研究只是關(guān)注滅多威對(duì)水生生物的急性毒性、慢性毒性等危害，忽略了其在水生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈傳遞，而滅多威在食物鏈傳遞中是否有生物放大效應(yīng)，這對(duì)食物鏈頂端的人類生命具有借鑒意義。

本研究中，以普通小球藻Chlorellavulgaris、大型溞和斑馬魚為研究對(duì)象，通過食物鏈普通小球藻-大型溞-斑馬魚傳遞和水體暴露傳遞兩種途徑，測(cè)定滅多威在這些生物體內(nèi)的富集含量，探究滅多威從低營養(yǎng)級(jí)到高營養(yǎng)級(jí)水生生物的富集能力，以及食物鏈的生物放大效應(yīng)，以期評(píng)估滅多威沿食物鏈進(jìn)行的富集和傳遞能效，了解滅多威在食物鏈的傳遞規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用普通小球藻藻種由中國科學(xué)研究院水生生物所提供，保存于BG-11培養(yǎng)基中。大型溞由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)所提供。斑馬魚購自上海費(fèi)曦生物科技有限公司，體質(zhì)量為(0.26±0.05)g，體長為(2.8±0.3)cm，共1 000尾。滅多威為質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于97%的滅多威原藥(上海焦點(diǎn)生物技術(shù)有限公司)，本試驗(yàn)中所示質(zhì)量濃度均指藥物的有效成分含量。

超高效液相色譜/質(zhì)譜儀(Waters，美國馬薩諸塞州)，液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 column(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相乙腈與水的體積比為80∶20；進(jìn)樣體積為2 μL，進(jìn)樣速度為0.3 mL/min。質(zhì)譜條件:毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為30 V，離子源溫度為450 ℃；脫溶劑氣溫度為450 ℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流速為50 L/h。

1.2 方法

1.2.1 藻種的培養(yǎng) 將普通小球藻置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天搖瓶3次。培養(yǎng)溫度為 (25±1)℃，光照度為1 000 lx，光周期為12 h∶12 h。定期鏡檢，確保藻種純正、無污染。

1.2.2 大型溞的培養(yǎng) 大型溞采用稀釋水培養(yǎng)基培養(yǎng)[19]。每天定時(shí)投喂普通小球藻，培養(yǎng)溫度為(22±1)℃，光照度為1 000 lx，光周期為16 h∶8 h。

1.2.3 斑馬魚的培養(yǎng) 以活性炭過濾曝氣48 h以上的自來水作為斑馬魚培養(yǎng)用水，光照度為 1 000 lx，pH 7，溫度為25 ℃，光周期為16 h∶8 h。將購買的斑馬魚馴化2周后，選擇健康活潑的斑馬魚進(jìn)行試驗(yàn)。馴化期間每天8:00和17:00定時(shí)投喂大型溞2次(2次的總投餌量為魚體質(zhì)量的5%)。試驗(yàn)前1 d停止投喂。

1.2.4 普通小球藻對(duì)滅多威的生物富集試驗(yàn) 設(shè)置0 μg/L(對(duì)照組)、2 μg/L(低濃度)、10 μg/L(中濃度)、50 μg/L(高濃度)4個(gè)滅多威濃度組(均為質(zhì)量濃度，下同)，將指數(shù)生長期的普通小球藻分別接種在含不同滅多威濃度的培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度組使用9個(gè)盛有混合均勻的100 mL藻液的錐形瓶。藻細(xì)胞初始濃度均為1×105cells/mL，培養(yǎng)96 h后，將每個(gè)濃度處理組分成3個(gè)小組，一組用于測(cè)定藻液的滅多威富集量，其他兩組用于大型溞的攝食試驗(yàn)。分別于培養(yǎng)的1、24、48、72、96 h時(shí)取藻液，使用超高效液相色譜/質(zhì)譜儀測(cè)定小球藻培養(yǎng)液和藻細(xì)胞中的滅多威含量。

1.2.5 大型溞對(duì)滅多威的生物富集試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)滅多威直接暴露組、3個(gè)滅多威暴露藻液投喂組和1個(gè)對(duì)照組(不含滅多威)共7組，每組設(shè)置3個(gè)平行。選取出生24 h內(nèi)的大型溞放入500 mL的燒杯中培養(yǎng)，每個(gè)燒杯盛稀釋水300 mL和大型溞約1.5 g，共培養(yǎng)9 d。

滅多威暴露藻液投喂組：選用“1.2.4節(jié)”中經(jīng)2、10、50 μg/L滅多威暴露處理96 h的普通小球藻藻液作為3個(gè)處理組大型溞的餌料，取 20 mL 濃度為 2×105cells/mL 的小球藻液，以 8 000 r/min 離心 5 min后，取濃縮藻液投喂。

滅多威直接暴露組：3個(gè)處理組水體中分別加入質(zhì)量濃度為2、10、50 μg/L的滅多威，并定時(shí)給大型溞投喂不含滅多威的普通小球藻藻液，投喂密度與滅多威暴露藻液投喂組保持一致。

對(duì)照組：投喂不含滅多威的普通小球藻藻液給大型溞。

在試驗(yàn)進(jìn)行的第3、6、9天時(shí)，用篩網(wǎng)從每個(gè)平行撈取30只大型溞，使用超高效液相色譜/質(zhì)譜儀測(cè)定大型溞體內(nèi)的滅多威富集量。

大型溞對(duì)滅多威暴露藻液的攝食率試驗(yàn)：試驗(yàn)設(shè)4組，分別投喂經(jīng)0、2、10、50 μg/L滅多威暴露處理96 h的普通小球藻藻液，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行10只大型溞，培養(yǎng)于30 mL的稀釋水中，試驗(yàn)期間每天更換培養(yǎng)液，并再次投喂相同量的用2、10、50 μg/L滅多威處理96 h后的普通小球藻藻液，投喂?jié)舛葹?×105cells/mL，并設(shè)置空白對(duì)照，投喂不含滅多威的普通小球藻。在試驗(yàn)的第2、4、6、8天換水前，測(cè)定大型溞對(duì)滅多威暴露普通小球藻的攝食率。

1.2.6 斑馬魚對(duì)滅多威的生物富集試驗(yàn) 參照GB/T 31270.7—2014，采用半靜態(tài)法，即試驗(yàn)過程中斑馬魚所在水體每24 h更換一次，水溫為(20±1)℃，溶解氧為6.5～7.0 mg/L，pH為7.0～7.5。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)滅多威暴露投喂組、3個(gè)滅多威直接暴露組和1個(gè)空白對(duì)照組共7組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放10尾健康的斑馬魚。

滅多威暴露投喂組：3個(gè)處理組分別用“1.2.5節(jié)”中經(jīng)2、10、50 μg/L滅多威暴露藻液投喂處理9 d的大型溞作為斑馬魚的餌料，每天 8:00和17:00投喂，2次的總投餌量按斑馬魚體質(zhì)量的4%計(jì)算。

滅多威直接暴露組:3個(gè)處理組養(yǎng)殖水體中分別加入質(zhì)量濃度為2、10、50 μg/L的滅多威，并定時(shí)給斑馬魚投喂不含滅多威的大型溞，投喂方法同投喂組。

對(duì)照組:斑馬魚養(yǎng)殖水體和餌料(大型溞)中均不含滅多威。

在試驗(yàn)進(jìn)行的第4天時(shí)取出斑馬魚，使用超高效液相色譜/質(zhì)譜儀測(cè)定斑馬魚體內(nèi)的滅多威富集量。

1.2.7 指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算

1)培養(yǎng)液中的滅多威含量。普通小球藻培養(yǎng)液、藻細(xì)胞表面和藻細(xì)胞內(nèi)部滅多威含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]中的方法。

先取經(jīng)滅多威暴露處理的小球藻藻液2 mL，以7 000 r/min 離心10 min，收集上清液1 mL，加入3 mL二氯甲烷；然后以2 000 r/min渦旋振蕩 30 s，靜置10 min，提取分離下層液體后置入棕色玻璃瓶，重復(fù)提取3次，合并提取液；最后用氮?dú)獯蹈珊蠹尤肓鲃?dòng)相定容至1 mL。

2)藻細(xì)胞表面吸附的滅多威量。先取小球藻藻液2 mL，以7 000 r/min 離心10 min后收集普通小球藻，加入1.5 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇溶液，以2 000 r/min渦旋振蕩30 s，洗脫藻體表面的滅多威；然后離心5 min，吸取1 mL上清液至進(jìn)樣瓶中；最后用氮?dú)獯蹈珊蠹尤肓鲃?dòng)相定容至1 mL。

3)藻細(xì)胞內(nèi)部滅多威含量。取普通小球藻2 mL，用甲醇洗滌3次，去除藻細(xì)胞表面吸附的滅多威，-20 ℃下反復(fù)凍融3次，加入2 mL二氯甲烷和甲醇的混合液(二者體積比為1∶2)，以 2 000 r/min渦旋振蕩30 s后，提取藻細(xì)胞內(nèi)的滅多威；然后以7 000 r/min 離心10 min，收集上清液至棕色玻璃瓶中，重復(fù)提取3次，合并提取液；最后用氮?dú)獯蹈?，加入流?dòng)相定容至1 mL。

4)藻類對(duì)滅多威的生物富集系數(shù)(bioconcentration factor，BCF)。計(jì)算公式為

BCF=1 020×Cm/Ci。

(1)

其中:Cm為藻細(xì)胞內(nèi)滅多威含量(μg/g);Ci為培養(yǎng)液中滅多威的初始質(zhì)量濃度(μg/L)；滅多威溶液的密度為1 020 g/L[20-21]。

5)大型溞對(duì)普通小球藻的攝食率(GR)。計(jì)算公式[22]為

GR=FR×(Ntf-N0)/ (lnNtf-lnN0)，

(2)

FR=V/N×(lnNt-lnN0)/t。

(3)

其中: GR為每只大型溞單位時(shí)間內(nèi)過濾的餌料細(xì)胞數(shù)[cells/(h·ind.)]; FR為水樣中大型溞個(gè)體在單位時(shí)間內(nèi)濾過的水樣量[mL/(h·ind.)];V為大型溞培養(yǎng)液體積(mL);N為每個(gè)處理組中浮游動(dòng)物數(shù)(ind.);N0為投喂餌料密度(cells/mL);Nt為對(duì)照組中的最終餌料密度(cells/mL);Ntf為處理組中的最終餌料密度(cells/mL)。

6)大型溞體內(nèi)滅多威含量。取30只大型溞，用超純水清洗大型溞3次，每次各1 min，用濾紙吸干外殼表面的液體，將大型溞干燥后稱重，隨后研磨大型溞，以2 mL正己烷和二氯甲烷的混合液(二者體積比為1∶1) 為萃取液，萃取20 h。用超聲波清洗機(jī)萃取30 min 后，用氮吹儀裝置吹干，再加入0.5 mL 的流動(dòng)相，搖勻至定容，上機(jī)測(cè)定大型溞體內(nèi)的滅多威含量。

7)斑馬魚體內(nèi)滅多威含量。稱取1.5 g的魚體樣品，放入50 mL的離心管中，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸乙腈提取液，振蕩混勻，以 2 000 r/min渦旋振蕩10 min，以10 000 r/min離心5 min;取5 mL離心后的上清液，放入已經(jīng)用5 mL超純水活化后的Agilent Bond EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管中，以2 000 r/min渦旋振蕩5 min，以4 000 r/min離心5 min；將離心后的上清液全部轉(zhuǎn)入含有1.7 g EMR-Lipid Polish MgSO4的離心管中，以2 000 r/min渦旋振蕩5 min，以4 000 r/min離心5 min；取有機(jī)相(上層)過0.22 μm有機(jī)相濾膜，置于10 mL離心管中，上機(jī)測(cè)定斑馬魚體內(nèi)的滅多威含量。

8)滅多威從低營養(yǎng)級(jí)到高營養(yǎng)級(jí)傳遞的生物放大系數(shù)(biomagnification factor，BMF)。計(jì)算公式[23]為

BMF=Ca/Cb。

(4)

其中:Ca、Cb分別為高、低營養(yǎng)級(jí)生物體內(nèi)的滅多威富集量(μg/g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one way-ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通小球藻對(duì)滅多威的生物富集效應(yīng)

從圖1可見：在小球藻培養(yǎng)液中分別添加2、10、50 μg/L滅多威后，培養(yǎng)液中的滅多威含量均呈現(xiàn)迅速降低的趨勢(shì)；高濃度滅多威組(50 μg/L)在1～24 h時(shí)降低幅度最大，其次為中濃度滅多威組(10 μg/L)。

圖1 不同濃度滅多威在小球藻培養(yǎng)液中96 h的變化Fig.1 Changes in methomyl with different concentrations in Chlorella culture medium for 96 h

從圖2可見：高濃度和中濃度滅多威組藻細(xì)胞內(nèi)部的滅多威含量在24 h時(shí)迅速增加并達(dá)到最大值，分別為426.47、87.78 μg/g，隨著暴露時(shí)間的延長，藻細(xì)胞內(nèi)部滅多威含量呈快速降低趨勢(shì)；而低濃度滅多威組則在72 h時(shí)達(dá)到最大值，滅多威含量為 33.28 μg/g。從圖3可見：高濃度和低濃度滅多威組藻細(xì)胞表面滅多威含量在24 h時(shí)達(dá)到最高值，之后隨著暴露時(shí)間的延長，滅多威含量呈快速降低趨勢(shì)；而中濃度滅多威組隨著暴露時(shí)間的延長，滅多威含量一直呈快速降低趨勢(shì)。

圖2 不同濃度滅多威在藻細(xì)胞內(nèi)部96 h的變化Fig.2 Changes in methomyl with different concentrations in alga cells for 96 h

圖3 不同濃度滅多威在藻細(xì)胞表面96 h的變化Fig.3 Changes in methomyl with different concentrations on the surface of algae cells for 96 h

從圖4可見：普通小球藻對(duì)滅多威具有特別強(qiáng)的富集作用，低濃度滅多威組在1～96 h時(shí)，BCF呈先增大后減少的變化趨勢(shì)，在72 h 時(shí)BCF值達(dá)到最大值(17 549.99)；中濃度滅多威組在1～24 h時(shí)，BCF呈逐漸增大的趨勢(shì)，并在24 h時(shí)達(dá)到最大值(9 108.83)，之后BCF呈先降低后升高的趨勢(shì)；高濃度滅多威組在1～24 h時(shí)，BCF呈逐漸增大趨勢(shì)，在24 h時(shí)達(dá)到最大值(8 768.40)，之后BCF呈逐漸降低的趨勢(shì)。

2.2 大型溞對(duì)滅多威暴露藻液中小球藻的攝食率

從圖5可見：在各時(shí)間點(diǎn)，隨著滅多威濃度的增大，滅多威暴露藻液投喂組大型溞的攝食率均呈顯著性下降趨勢(shì)(P<0.05)；高濃度投喂組在第4天時(shí)攝食率為0.45×104cells/(h·ind.)，顯著低于其他3組(P<0.05)，且在前6 d的攝食率較其他組均為最低；中濃度投喂組在第8天時(shí)攝食率最低，為0.05×104cells/(h·ind.)，顯著低于低濃度和對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)過程中，低濃度投喂組大型溞的攝食率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但總體上顯著高于其他2個(gè)濃度組(P<0.05)。滅多威暴露于普通小球藻后，大型溞攝食率有著特別明顯的變化，這表明經(jīng)滅多威暴露后的小球藻對(duì)大型溞的攝食具有較大的抑制效果。

標(biāo)有不同字母者表示同一時(shí)間下不同組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。The means with different letters in same time are significant differences in different groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.圖4 普通小球藻對(duì)滅多威的生物富集系數(shù)Fig.4 Bioconcentration factors of methomyl in green alga Chlorella vulgaris

圖5 滅多威對(duì)大型溞攝食率的影響Fig.5 Effects of methomyl on grazing rate of water fleas Daphnia magna

2.3 滅多威在大型溞中的富集量

從圖6可見：3個(gè)投喂組中，隨著投喂時(shí)間的延長，高濃度滅多威暴露藻液投喂組大型溞體內(nèi)的滅多威富集量逐漸升高，并在第9天時(shí)達(dá)到最大值，富集量達(dá)6.02 μg/g，中濃度和低濃度組富集量則逐漸降低，均在第3天時(shí)達(dá)到最大值；而3個(gè)滅多威直接暴露組中，隨著暴露時(shí)間的延長，大型溞體內(nèi)的滅多威富集量逐漸降低，在暴露3 d后，滅多威最大富集量為1.4 μg/g；滅多威直接暴露組大型溞的滅多威最大富集量遠(yuǎn)小于投喂組的最大值。這表明，大型溞體內(nèi)的滅多威富集大部分是通過攝食含滅多威的小球藻，從水環(huán)境中只能富集少量滅多威。

從表1可見：用滅多威暴露藻液投喂大型溞9 d后，滅多威經(jīng)普通小球藻傳遞到大型溞體內(nèi)并積累，其BMF最大值出現(xiàn)在高濃度滅多威暴露藻液投喂組(0.177 0)，未存在生物放大效應(yīng)；中濃度、低濃度投喂組BMF值更低，均未出現(xiàn)生物放大現(xiàn)象。

圖6 大型溞體內(nèi)的滅多威富集量Fig.6 Accumulation amount of methomyl in the water fleas Daphina magna

表1 不同濃度滅多威通過食物傳遞在小球藻-大型溞體內(nèi)的積累

2.4 滅多威在斑馬魚中的富集量

從圖7可見：用經(jīng)過滅多威(2、10、50 μg/L)暴露藻液處理9 d的大型溞投喂斑馬魚，4 d后，高濃度投喂組斑馬魚體內(nèi)滅多威富集量最大值為0.12 μg/g，低濃度和中濃度投喂組中，斑馬魚體內(nèi)滅多威富集量十分相近，高濃度投喂組斑馬魚體內(nèi)滅多威富集量顯著高于低濃度和中濃度投喂組(P<0.05)，分別為低濃度和中濃度投喂組的 2.2倍和2.7倍；而在斑馬魚直接暴露組中，經(jīng)過4 d水體滅多威暴露，隨著暴露水體滅多威濃度的增加，斑馬魚體內(nèi)滅多威富集量增加，其最大值為0.72 μg/g，且顯著高于投喂組(P<0.05)。

從表2可見，用經(jīng)過滅多威暴露藻液處理9 d的大型溞投喂斑馬魚，4 d后，滅多威經(jīng)大型溞傳遞到斑馬魚體內(nèi)并積累，其BMF最大值(5.00)出現(xiàn)在低濃度投喂組，有生物放大效應(yīng)，BMF最低值(0.02)出現(xiàn)在高濃度投喂組，中濃度、高濃度投喂組無生物放大效應(yīng)，即滅多威大型溞的濃度越大，大型溞斑馬魚的BMF值就越小。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.圖7 斑馬魚體內(nèi)的滅多威富集量Fig.7 Accumulation of methomyl in zebrafish Danio rerio

表2 不同濃度滅多威通過食物傳遞在大型溞-斑馬魚體內(nèi)的積累

3 討論

3.1 普通小球藻對(duì)滅多威的生物富集效應(yīng)

微藻在尾水處理方面具有顯著效果[24]，水體中無機(jī)物和有機(jī)物均可被微藻富集[25]。本研究中發(fā)現(xiàn)，普通小球藻培養(yǎng)液中添加2、10、50 μg/L滅多威后，培養(yǎng)液中滅多威含量均呈現(xiàn)迅速降低的趨勢(shì)，尤其高濃度滅多威組在1～24 h時(shí)降低幅度最大。培養(yǎng)液中初始添加的滅多威濃度越高，小球藻對(duì)滅多威的去除率就越高，最高去除率達(dá)到58%，這與Zhou等[26]在5 d內(nèi)去除壬基酚效率為58.3%的結(jié)論接近。隨著滅多威暴露時(shí)間的延長，小球藻培養(yǎng)液中滅多威含量逐漸降低，這可能是由于小球藻生物量的增加，大量的滅多威被小球藻吸附到藻細(xì)胞內(nèi)[27]。而在48 h后培養(yǎng)液中滅多威含量趨于穩(wěn)定，這說明小球藻只能在短時(shí)間內(nèi)有去除滅多威的能力，這可能是由于藻細(xì)胞濃度呈指數(shù)增加，導(dǎo)致水體中陰影面積增大，光照強(qiáng)度減弱，進(jìn)而導(dǎo)致滅多威無法進(jìn)一步降解[27]。

本試驗(yàn)中，低濃度和中濃度滅多威組小球藻在96 h的試驗(yàn)周期內(nèi)，藻細(xì)胞內(nèi)部滅多威含量的曲線變化不大，而高濃度滅多威組在96 h的試驗(yàn)周期內(nèi)，藻細(xì)胞內(nèi)部滅多威含量的曲線變化幅度較大(圖2)。孫凱峰等[28]研究發(fā)現(xiàn)，隨著0.1 mg/L壬基酚暴露時(shí)間的延長，藻細(xì)胞吸收壬基酚的含量呈降低趨勢(shì)，與本試驗(yàn)中高濃度滅多威組藻細(xì)胞內(nèi)部吸收滅多威的變化趨勢(shì)一致。

本試驗(yàn)中，普通小球藻對(duì)滅多威具有較強(qiáng)的富集作用，滅多威濃度越低，小球藻對(duì)滅多威的富集作用越強(qiáng)，其中，BCF最大值(17 549.99)出現(xiàn)在72 h時(shí)的低濃度滅多威組，而BCF最低值(698.00)則出現(xiàn)在96 h的高濃度滅多威組，到試驗(yàn)后期，隨著滅多威濃度的增加，小球藻的BCF值逐漸減少，這可能是由于滅多威濃度較大，很大程度上抑制了藻細(xì)胞的生長，從而導(dǎo)致小球藻富集滅多威含量減少。侯云等[29]研究報(bào)道，小球藻隨著壬基酚暴露濃度的增加，BCF值逐漸減小，抑制了藻細(xì)胞的生長，壬基酚暴露濃度與BCF的關(guān)系和本試驗(yàn)中報(bào)道的滅多威暴露濃度與BCF的關(guān)系相一致。

3.2 普通小球藻-大型溞-斑馬魚對(duì)滅多威的富集傳遞效應(yīng)

本試驗(yàn)中，水環(huán)境中，污染物的生物富集和食物鏈傳遞是普遍存在的[30]。Taylor等[31]研究表明，重金屬在食物鏈中存在生物放大效應(yīng)。Rasmussen等[32]也發(fā)現(xiàn)，微藻-大型溞-魚三級(jí)食物鏈的多溴聯(lián)苯(PCB)能夠發(fā)生生物放大。小球藻對(duì)許多污染物都有較強(qiáng)的富集能力，而大型溞以小球藻為食，可以形成小球藻-大型溞的食物鏈傳遞。本研究中發(fā)現(xiàn)，小球藻富集滅多威的能力較強(qiáng)，且可以通過攝食過程將滅多威傳遞到大型溞。同時(shí)，大型溞還可通過水環(huán)境中獲取少量的滅多威。Juei等[33]發(fā)現(xiàn)， 從浮游植物到水生動(dòng)物的多溴聯(lián)苯500 mg/L(高濃度組)，經(jīng)過4 d的富集后，浮游動(dòng)物體內(nèi)的多溴聯(lián)苯富集可達(dá)318.81 mg/L，不存在生物放大效應(yīng)。與此相似，本試驗(yàn)中經(jīng)滅多威暴露藻液投喂的大型溞，隨著小球藻投喂時(shí)間的延長，高濃度滅多威投喂組(50 μg/L)大型溞體內(nèi)的滅多威富集量最高(6.02 μg/g)，高濃度投喂組大型溞的BMF值為0.177 0，也不存在生物放大效應(yīng)。在投喂 9 d后，隨著攝入小球藻濃度的增大，大型溞的BMF值隨之增大(表1)。據(jù)Kannan等[34]研究發(fā)現(xiàn)，污染物發(fā)生生物放大效應(yīng)與自身的理化性質(zhì)有關(guān)，因此，大型溞是否會(huì)發(fā)生生物放大效應(yīng)可能與攝入的小球藻的濃度有關(guān)。大型溞體內(nèi)滅多威富集量與大型溞的攝食率也有一定關(guān)系，大型溞在高濃度投喂組的攝食率與對(duì)照組相比有顯著性下降，說明在一定程度上排斥攝食有毒的滅多威小球藻。Mohamed等[35]發(fā)現(xiàn)，水蚤Daphnia優(yōu)先以無毒綠藻和硅藻為食，而有毒的藍(lán)藻銅綠微囊藻Microcystisaeruginosa是待無毒藻類都攝食盡才會(huì)選擇攝食。本試驗(yàn)中，高濃度投喂組大型溞最后體內(nèi)滅多威富集量較高的原因，可能是由于投喂時(shí)間久，大型溞被迫攝食有毒的小球藻，加上大型溞無法將有毒滅多威代謝和排泄出去，導(dǎo)致高濃度組大型溞體內(nèi)滅多威含量較高[36]。

本試驗(yàn)中，關(guān)于滅多威在大型溞-斑馬魚食物鏈的傳遞特征表明，中濃度和高濃度投喂組中斑馬魚體內(nèi)滅多威富集量遠(yuǎn)小于同濃度的滅多威直接暴露組。Zhu等[23]研究表明，投喂經(jīng)TiO2暴露后的大型溞給斑馬魚，與斑馬魚水體暴露組相比，同濃度投喂組斑馬魚體內(nèi)TiO2的富集量比水體暴露組低。本試驗(yàn)中，在投喂大型溞4 d后，滅多威從大型溞傳遞到斑馬魚體內(nèi)，其BMF最大值(5.00)出現(xiàn)在低濃度投喂組，存在生物放大效應(yīng)，而在中濃度、高濃度投喂組則無生物放大效應(yīng)。斑馬魚高濃度投喂組BMF值低的原因，可能是本試驗(yàn)中從大型溞到斑馬魚的投喂時(shí)間僅為4 d，投喂時(shí)間較短，高濃度投喂組的斑馬魚未能在體內(nèi)富集滅多威，導(dǎo)致高濃度組BMF值較低。

本研究中，從兩種路徑探究了三級(jí)食物鏈的傳遞特征，分別為從水體暴露傳遞(直接暴露組)和食物傳遞(投喂組)。從大型溞富集數(shù)據(jù)(圖6)可以看出，在水體暴露方面較難對(duì)大型溞體內(nèi)產(chǎn)生富集，而從斑馬魚富集滅多威的數(shù)據(jù)(圖7)可以看出，在水體暴露攝取滅多威的含量大于從食物中攝取，這形成一定的矛盾。根據(jù)Zhu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，通過水體暴露方式，斑馬魚除能通過鰓吸收水體中滅多威外，還能通過體內(nèi)壓力機(jī)制吸收，故斑馬魚水體暴露富集的滅多威更多。而大型溞攝入滅多威的方式就顯得十分單一，只能通過濾食來富集滅多威。因此，導(dǎo)致在食物鏈傳遞中，二者面對(duì)水體暴露和食物傳遞方式出現(xiàn)明顯不同。在食物鏈傳遞方式中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過小球藻-大型溞-斑馬魚三級(jí)傳遞，隨著食物鏈等級(jí)的提高，生物放大系數(shù)逐漸增大，且在傳遞到斑馬魚后出現(xiàn)明顯生物放大效應(yīng)(BMF>1)，根據(jù)Whittle等[37]的研究結(jié)果，食物鏈的長度與生物放大系數(shù)成正比，本次試驗(yàn)結(jié)果也符合這個(gè)結(jié)論?？梢钥闯?，若是隨著水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈長度的增長，水生生物體內(nèi)的滅多威富集濃度會(huì)有增加的可能。這需要引起研究者的注意，因?yàn)樵诂F(xiàn)實(shí)水環(huán)境中，食物鏈的長度往往不只是三級(jí)，而且滅多威在中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中是主要?dú)⑾x劑之一，人類作為食物鏈頂端的生物，有可能在體內(nèi)形成農(nóng)藥富集，甚至出現(xiàn)生物放大效應(yīng)，從而危害人類身體健康。因此，本研究結(jié)果對(duì)于評(píng)估滅多威的生物風(fēng)險(xiǎn)及在水生生物中的富集和傳遞效應(yīng)提供了一定的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

1)滅多威暴露于普通小球藻培養(yǎng)液中，小球藻出現(xiàn)了快速的生物放大效應(yīng)和生物富集。

2)滅多威經(jīng)普通小球藻傳遞到大型溞的生物放大系數(shù)僅為0.177 0，未存在生物放大效應(yīng)。

3)滅多威經(jīng)過大型溞傳遞到斑馬魚的生物放大系數(shù)達(dá)到5.00，存在生物放大效應(yīng)。小球藻-大型溞-斑馬魚的食物鏈傳遞過程中，隨著食物鏈等級(jí)的提高，生物放大系數(shù)逐漸增大。