劉巖松，張偉杰，王中，殷維駿，歐凡江，田文卓，劉雷，常亞青

(大連海洋大學 農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

中間球海膽Strongylocentrotusintermedius作為一種優(yōu)質海膽種類，具有生長速度快及生殖腺色澤光亮、質地飽滿和味甜等特點。中間球海膽原產于日本北方沿海和俄羅斯遠東部分地區(qū)沿海，中國自1989年從日本引入該種后，便對其開展了生物學、生態(tài)學、人工育苗及遺傳育種等一系列研究[1-2]，同時開始進行人工增養(yǎng)殖生產。目前，中間球海膽已成為中國重要的海珍品增養(yǎng)殖種類之一[2]。近年來，海膽逐漸被中國消費者認可，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，但細菌性疾病如黑嘴病[3]、紅斑病[4-5]和病變綜合征等[6]也開始在養(yǎng)殖生產中頻繁暴發(fā)，嚴重制約了海膽?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展。

黑嘴病是中間球海膽?zhàn)B殖過程中危害最嚴重的疾病之一。春夏交替時的低溫期是黑嘴病頻繁暴發(fā)的高峰期，且黑嘴病病原菌對受損傷海膽致病性較強[7]，患病海膽的主要特征是圍口膜顏色發(fā)黑，隨著病情逐漸加重，其不能正常進行附著和攝食活動，棘逐漸脫落直至死亡[3]。黑嘴病傳染性強，死亡率高，在中間球海膽?zhàn)B殖過程中危害較大，因此，開展黑嘴病病原的分離和鑒定及病原菌病原特性的研究，對有效防控中間球海膽黑嘴病具有重要意義。目前，已有研究對中間球海膽黑嘴病致病菌的鑒定尚有爭議。Takeuchi等[8]從患黑嘴病中間球海膽中分離出一種菌株，根據病原菌的生化特性、DNA-DNA同源性和血清學分析，證明該病原菌為弧菌屬Vibrio；而李太武等[3]根據該病原菌的形態(tài)特征及生化特性，鑒定中間球海膽黑嘴病的病原菌為堅強芽孢桿菌Bacillusfirmus。原因可能是黑嘴病的病原菌有多種，導致分離出的致病菌種類不一，也可能是因為試驗方法及鑒定方法不同，導致結果出現(xiàn)分歧。鑒于目前細菌鑒定技術的不斷進步，有必要對黑嘴病病原菌進行重新鑒定。本研究中，對患有黑嘴病的中間球海膽進行了病原菌分離純化，并采用電鏡觀察、革蘭氏染色、生理生化鑒定和16S rRNA序列比對等系列手段對該病原進行了鑒定，以期為海膽黑嘴病的防治提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用患病及健康中間球海膽均取自大連海洋大學農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室同批人工繁育群體，挑選具有典型黑嘴病病癥的個體作為病原分離的試驗材料。

抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細菌微量鑒定管購自海博生物技術有限公司；2216E培養(yǎng)基、無菌接種環(huán)和PBS試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 在無菌條件下，對具有典型黑嘴病病癥的中間球海膽進行解剖，吸取其體腔液于2216E固體培養(yǎng)基上進行劃線分離，在16 ℃下恒溫培養(yǎng)12 h后，對菌落形態(tài)、大小和顏色等進行觀察比較，挑取優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)，將菌液與體積分數(shù)為80%的甘油按體積比1∶1混合均勻后置于-80 ℃下保存?zhèn)溆茫蛛x的細菌編號為D1。

1.2.2 人工回感試驗 采用浸泡法進行人工回歸感染試驗，隨機取200只健康無病癥的中間球海膽，等分放入4個10 L滅菌水槽中，暫養(yǎng)3 d后開始試驗，使用1 mL無菌注射器針頭從海膽圍口膜處刺入造成損傷后，向水槽中加入10 μL濃度為108cfu/mL的D1菌液，最終浸泡脅迫濃度為 102cfu/mL，對照組僅使用針頭損傷海膽，養(yǎng)殖于無菌海水中。試驗期間保持水溫為(17±1)℃，連續(xù)觀察7 d并記錄試驗海膽的發(fā)病癥狀及死亡情況。

1.2.3 病原菌形態(tài)觀察 將純化后的病原菌涂布在載玻片上，經火焰固定，隨后分別加結晶紫染液1 min后水洗、碘液1 min后水洗、脫色液1 min后水洗及復染液30 min后水洗，晾干后進行鏡檢。

取10 mL濃度為109cfu/mL的D1菌液離心(3 000g)，去除上清液，加入5 mL 0.1 mol/L PBS清洗，清洗3次后加入5 mL體積分數(shù)為2.5%的戊二醛固定3 h，用PBS清洗2次，用純水清洗2次，再用體積分數(shù)為30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液梯度脫水，最后滴加處理好的樣品于1 cm×1 cm的貝殼上，置于烘箱中進行烘干，樣品充分干燥后進行掃描電鏡觀察。

1.2.4 病原菌生化特征鑒定 將分離株D1接種于2216E固體培養(yǎng)基上，在16 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，用無菌接種環(huán)挑取適量單菌落接種于細菌微量鑒定管中，用無菌封口膜封口，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)。

1.2.5 病原菌分子生物學鑒定 將新鮮培養(yǎng)的單菌落挑取至2216E液體培養(yǎng)基中，于16 ℃下恒溫培養(yǎng)12 h后，取1 μL稀釋5倍作為模板。利用通用引物(引物序列為8F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)擴增16S rRNA基因全長。反應體系(共50 μL)：正、反向引物各2 μL，DNA模板1 μL，rTaq 0.4 μL，dNTP Mixture 4 μL，10×PCR Buffer 5 μL，用無菌水補足至50 μL。反應條件：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下變性30 s，43.6 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進行35個循環(huán)；最后再在72 ℃下延伸10 min。將所得未純化PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。運用MEGA X軟件將返回的D1菌株16S rRNA基因擴增序列進行拼接，得到全長后在Ezbio Cloud數(shù)據庫中進行多序列比對。將EzBio Cloud數(shù)據庫中與D1菌株的16S rRNA基因序列相似度較高的幾種常見致病弧菌，用MEGA X軟件進行比對，并采用鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹, 以自舉數(shù)據集為1 000次的自舉分析(bootstrap)進行置信度檢測。

1.2.6 藥敏試驗 對病原菌D1運用藥敏紙片擴散法進行藥敏試驗。取200 μL新鮮菌液涂布于2216E固體培養(yǎng)基上，將藥敏紙片用無菌鑷子貼于涂布新鮮菌液的培養(yǎng)基表面，在16 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，根據杭州微生物試劑有限公司提供的《藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準》，通過測定抑菌圈直徑確定病原菌株的藥物敏感性。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離純化

從圖1可見，從患病中間球海膽中提取的優(yōu)勢病原菌D1在2216E培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h(16 ℃)后，菌落呈圓形、乳白色、不透明。

2.2 人工回感試驗

人工回感試驗發(fā)現(xiàn)，海膽在感染48 h內出現(xiàn)圍口膜變黑，管足回縮，附著能力喪失，運動能力減弱等病癥(圖2)，與自然發(fā)病的海膽癥狀相同。從表1可見：感染后的海膽在48 h后開始出現(xiàn)死亡，第8天時3組的平均死亡率為30.67%±1.15%；對照組海膽損傷后置入無菌海水中暫養(yǎng)，并未發(fā)生病狀。同時，再次從人工感染的發(fā)病海膽中進行優(yōu)勢菌分離，用二次分離到的菌株感染健康海膽，出現(xiàn)的海膽黑嘴病癥狀與自然發(fā)病癥狀相同，16S rRNA序列比對結果均與菌株D1一致。這表明，菌株D1為中間球海膽黑嘴病病原。

圖1 分離的菌株D1Fig.1 Isolated strain D1

圖2 菌株D1回感海膽Fig.2 Strain D1 challenged to the sea urchin

表1 菌株D1感染試驗Tab.1 Strain D1 infection experiment

2.3 病原菌形態(tài)觀察

如圖3、圖4所示，D1菌株經過革蘭氏染色，結果為革蘭氏陰性菌，菌株呈短桿狀，長×寬為(2.10±0.31)μm×(0.68±0.08)μm(n=30)。

圖3 菌株D1革蘭氏染色圖片F(xiàn)ig.3 Micrograph of strain D1 by Gram-staining

2.4 生理生化鑒定

利用細菌微量鑒定管對菌株D1進行鑒定，結果顯示菌株D1在6%氯化鈉胨水中可以生長，無芽孢，不可以利用鳥氨酸、賴氨酸和精氨酸脫羧，V-P反應、甲基紅反應呈陰性，氧化酶反應呈陽性，可以利用蔗糖，不可以利用西蒙氏枸櫞酸鹽、葡萄糖、甘醇、水楊苷，不產生吲哚，不能分解尿素，與常見弧菌屬有一定差別(表2)。

圖4 菌株D1的掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy of strain D1

2.5 分子生物學鑒定

利用通用引物對菌株D1進行16S rRNA基因全長擴增，在EzBio Cloud數(shù)據庫中將菌株D1的16S rRNA基因片段序列進行序列比對，結果顯示，菌株D1與參考菌株棘皮動物弧菌Vibrioechinoideorum的一致性為99.04%(圖5)。

選擇EzBio Cloud數(shù)據庫中已報道的同源性較高的棘皮動物弧菌及其他8種弧菌的16S rRNA基因序列，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示，菌株D1與棘皮動物弧菌單獨聚為一支，表明二者的親緣關系最近(圖6)。根據生理生化試驗和16S rRNA生物學鑒定結果，確定D1菌株為棘皮動物弧菌V.echinoideorum。

表2 病原菌D1的理化特性及與常見弧菌的比較Tab.2 Physicochemical characteristics of pathogenic bacterium D1 and comparison with common Vibrio species

圖6 基于16S rRNA基因序列的D1系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain D1 based on 16S rRNA gene sequence

2.6 藥敏試驗

從表3可見：菌株D1對麥迪霉素、萬古霉素和慶大霉素等11種抗菌藥物耐藥，對頭孢哌酮、新霉素和青霉素3種抗菌藥物中度敏感，對諾氟沙星、環(huán)丙沙星、呋喃唑酮等16種抗菌藥物敏感。

3 討論

3.1 黑嘴病及其致病機理

黑嘴病是中間球海膽?zhàn)B殖過程中常見的一種疾病，對海膽?zhàn)B殖具有較大的危害，可造成大規(guī)模死亡。李太武等[3]研究發(fā)現(xiàn)，黑嘴病癥狀首先是出現(xiàn)圍口膜變黑，對其組織病理切片進行觀察后，發(fā)現(xiàn)圍口膜上無明顯病變，認為可能是細菌通過破壞口器中的肌肉組織，使海膽無法攝食并導致死亡。張勃等[9]研究發(fā)現(xiàn)，患黑嘴病的海膽體腔細胞CAT活性、SOD活性和總抗氧化能力明顯降低。本研究團隊應用該病原菌(棘皮動物弧菌)開展的研究發(fā)現(xiàn)，中間球海膽在黑嘴病病原菌入侵后，首先通過提高酸性磷酸酶等與吞噬作用相關的免疫酶活性及吞噬相關免疫基因表達等方式增強吞噬作用，并通過細胞凋亡和再生保持細胞數(shù)量，在感染后期，由于不能清除病原菌，吞噬作用逐漸減退，細胞壞死率大幅上升，導致海膽發(fā)病[10]。Hira等[11]揭示了棘皮動物弧菌的致病機理，即該菌具有較強的β-溶血活性，具有殺傷宿主細胞的能力，同時還具有溶解海膽體腔細胞的能力。

表3 菌株D1的藥敏試驗結果Tab.3 Drug sensitive test results of strain D1

3.2 海膽黑嘴病病原鑒定

導致海膽發(fā)病的媒介有許多，包括細菌、真菌和寄生蟲等，其中，細菌被認為是大多數(shù)海膽疾病的主要病原體[12]。本試驗中，從患病海膽體腔液中分離出一株優(yōu)勢菌D1，綜合生理生化及分子生物學方法鑒定結果，確定該菌株為棘皮動物弧菌。而李太武等[3]的研究認為，中間球海膽黑嘴病的病原菌為堅強芽孢桿菌，Takeuchi等[8]的研究認為病原菌為弧菌屬。本研究中，利用分離的病原菌進行人工回感試驗時，能夠復制中間球海膽黑嘴病自然發(fā)病癥狀，且從人工感染的患病海膽體腔液中再次得到相同的分離菌株，證實棘皮動物弧菌為中間球海膽黑嘴病的病原菌。

弧菌是水產動物主要的致病菌，引起的病癥有多種。溶藻弧菌V.alginolyticus是導致海參患腐皮綜合征的主要致病菌之一[13]；方斑東風螺Babyloniaareolata和長牡蠣Crassostreagigas在感染哈維氏弧菌V.harveyi后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象[14-15]；紅鰭東方鲀Fugurubripes在感染哈維氏弧菌后會出現(xiàn)爛鰭爛尾、體色發(fā)黑和死亡等癥狀[16]；溶珊瑚弧菌V.coralliilyticus可導致中間球海膽發(fā)生紅斑病[17]；強壯弧菌V.fortis、羅尼氏弧菌V.shilonii、哈維氏弧菌和燦爛弧菌V.splendidus是中間球海膽病變綜合征的病原菌[6]；鰻弧菌V.anguillarum可導致紫球海膽S.purpuratus發(fā)生禿海膽病[18]。弧菌的形態(tài)一般呈弧狀，而棘皮動物弧菌的形態(tài)呈短桿狀。在水產動物中，這種情況時有發(fā)生，如異育銀鯽Carassiusauratusgibelio腸道中存在的蛭弧菌Bdellovibriobacteriovous和青石斑魚Epinephlusawoara病魚體表及內臟中存在的哈維氏弧菌均為短桿狀[12,19]。Hira等[20]發(fā)現(xiàn)，棘皮動物弧菌同樣為短桿狀，菌株長度為(1.9±0.1)μm，與本研究中菌株長度(2.10±0.31)μm十分接近。值得注意的是，Hira等[20]在綠海膽S.droebachiensis病變表皮中分離出該菌，說明棘皮動物弧菌也可能會導致海膽發(fā)生其他疾病，但本研究在回感試驗中未觀察到感染海膽出現(xiàn)其他癥狀，這可能與感染條件(如水溫)等有關。

3.3 海膽黑嘴病的控制方法

水產動物疾病的治療一直是較難攻克的問題，對于魚類等脊椎動物來說，可研發(fā)針對特定病原的疫苗來預防感染[21]，但對于缺少獲得性免疫的無脊椎動物來說，目前尚無疫苗用于疾病預防[22]?？咕幬镌陬A防和治療水產動物細菌性疾病中發(fā)揮著重要作用[23-24]。本研究中，明確了棘皮動物弧菌對30種抗菌藥物的敏感性，該菌對麥迪霉素、萬古霉素、克林霉素和丁胺卡那等11種抗菌藥物不敏感，對諾氟沙星和氧氟沙星等16種抗菌藥物敏感。值得注意的是，上述敏感藥物并不一定可用于預防和治療海膽的黑嘴病，原因有兩方面：一是許多抗菌藥物禁止用于水產動物，是否可用必須查詢獸藥典、獸藥質量標準和相關公告；二是實際養(yǎng)殖環(huán)境復雜，藥敏試驗和實際使用效果是否一致還需進一步驗證。

對于海膽黑嘴病的防控，目前亟須研發(fā)綠色無抗技術，作者提出建議如下：

1)對海膽的抗病力進行遺傳改良是提升其抗病能力的根本途徑。本課題組近期對中間球海膽不同選育家系間的抗病能力進行了比較，發(fā)現(xiàn)不同家系間的抗病力具有顯著差異，通過構建復合抗病指數(shù)，可實現(xiàn)對抗病和生長性狀的復合選擇[25]。

2)通過開發(fā)生產海膽的特定疫苗及以病原菌為抗原制備卵黃抗體等方法，也可降低其患病概率、減少疾病損失，由于海膽的經濟價值及養(yǎng)殖規(guī)模等因素，可考慮采用浸泡法。

3)海膽?zhàn)B殖過程中，在配合飼料中添加維生素、免疫增強劑，以及天然植物提取物和芽孢桿菌等益生菌，均可以提高海膽的免疫力，起到一定的防病害效果。

4)海膽損傷后致病菌更易侵入，導致海膽發(fā)病，故在養(yǎng)殖過程中應注意盡量避免海膽損傷。綜上所述，本研究中分離獲得的病原菌將為海膽抗病育種和提高免疫力研究提供有益參考。

4 結論

1)從患黑嘴病海膽體腔液中分離出的1株優(yōu)勢菌，菌株大小(長×寬)為(2.10±0.31)μm×(0.68±0.08)μm，為革蘭氏陰性菌；通過生理生化試驗及16S rRNA分子生物學鑒定，確定該菌株為棘皮動物弧菌。

2)病原棘皮動物弧菌對麥迪霉素、萬古霉素、克林霉素、丁胺卡那等11種抗菌藥物不敏感，對諾氟沙星、氧氟沙星等16種抗菌藥物敏感。恩諾沙星是喹諾酮類抑菌劑，可以嘗試在生產中用其預防和治療黑嘴病，抗菌藥物治療必須依據獸藥典、獸藥質量標準和相關公告。