陶鳳庭，潘創(chuàng)，戚勃，胡曉，趙永強(qiáng),3，楊賢慶,3*，楊莉莉

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；3.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；4.廣東百維生物科技有限公司，廣東 化州525100)

海藻是重要的海洋生物資源，是海洋中最古老的低等隱花植物之一[1]。眾多研究表明，藻類含有的蛋白質(zhì)、多糖、多肽和多酚等生物活性物質(zhì)具有抗氧化、抗感染、抗糖尿病、抗癌、抗病毒、抗菌和抗肥胖等多種生理功能[2]，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工和農(nóng)業(yè)等方面[3]。紫菜是中國(guó)大規(guī)模種植的經(jīng)濟(jì)海藻種類之一，其中的壇紫菜Porphyrahaitanensis是中國(guó)特有的暖溫帶品種，主要分布于廣東、浙江和福建等地，年產(chǎn)量約占全國(guó)紫菜產(chǎn)量的70%以上[4]。目前，壇紫菜雖然已實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化培育、養(yǎng)殖和采收，但其仍作為初級(jí)產(chǎn)品進(jìn)入銷售市場(chǎng)，而生長(zhǎng)后期的壇紫菜由于口感差、利潤(rùn)低，養(yǎng)殖戶常放棄采收，造成了資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。因此，促進(jìn)壇紫菜高附加值產(chǎn)品的開發(fā)已成為壇紫菜產(chǎn)業(yè)亟待解決的重要問(wèn)題。

壇紫菜粗提液(crude extract ofPorphyrahaitanensis，CEPh)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且粗提液中蛋白濃度與抗氧化活性間存在劑量依賴關(guān)系，其中大量存在的蛋白被認(rèn)為是一種潛在的高效天然抗氧化劑[5]。然而，復(fù)雜的多糖基質(zhì)會(huì)阻礙蛋白的提取[6]，李春霞[7]、孔祥佳等[8]、于嬌等[9]先后以蒸餾水為提取劑，分別運(yùn)用溶脹加組織搗碎法、超聲波酶解法和超聲波輔助水提法對(duì)壇紫菜蛋白進(jìn)行提取，不同提取方法得到的蛋白提取率存在明顯差異。硫酸銨鹽析沉淀分離蛋白法操作簡(jiǎn)便且對(duì)蛋白有保護(hù)作用，從而被廣泛應(yīng)用[10]，但不同飽和度硫酸銨溶液對(duì)壇紫菜分離蛋白組分的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性及抗氧化活性的影響目前尚未見報(bào)道。本研究中，將2種提取液搭配3種破壁方法組合成6種提取方法，進(jìn)行壇紫菜蛋白提取率對(duì)比試驗(yàn)，并用提取率最高的方法制備壇紫菜粗提液制備分離蛋白，通過(guò)蛋白沉淀量、紫外吸收光譜、紅外光譜、圓二色光譜、SDS-PAGE凝膠電泳等方法，比較了不同飽和度硫酸銨對(duì)壇紫菜粗提液中蛋白的理化特性和抗氧化能力的影響，以期為壇紫菜蛋白的分離提取、結(jié)構(gòu)解析和活性研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用三水曬干壇紫菜購(gòu)于廣東省潮州市饒平縣，粉碎過(guò)245 μm篩后避光保存。按GB 5009.6—2016中的方法測(cè)得其蛋白含量為32.85%。

試劑：Nu PAGETM12% Bis-Tris預(yù)制膠、Nu PAGETMMOPS SDS電泳緩沖液(20×)購(gòu)自賽默飛科技(上海)有限公司;BeyoColor TM彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(相對(duì)分子質(zhì)量為6 500～270 000)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、考馬斯亮藍(lán)超快染色試劑盒和Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；KBr購(gòu)自美國(guó)PIKE公司；ABTS和DPPH購(gòu)自合肥博美生物有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器與設(shè)備：JY99-IIDN超聲波細(xì)胞破碎儀(中國(guó)，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司)；IR-Affinity-1紅外光譜儀(日本，島津公司)；Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽和PowerPac Basic基礎(chǔ)電泳儀(美國(guó)，Bio-Rad公司)；Synergy全功能酶標(biāo)儀(美國(guó)，BioTek公司)；Chiranscan圓二色光譜儀(英國(guó)，應(yīng)用光物理公司)；UV-2550紫外分光光度計(jì)(日本，島津公司)。

1.2 方法

1.2.1 壇紫菜粗蛋白的提取 各稱取18份壇紫菜粉末，每份1 g，均分為兩組，分別將壇紫菜與蒸餾水或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)以料液比為1∶100(g∶mL)進(jìn)行混合，然后每組用溶脹法(4 ℃下放置72 h)、反復(fù)凍融法(凍融6次)和超聲波輔助法(1 000 W，6 s 開，6 s關(guān)，共1 h)各處理3份，再經(jīng)4 000g離心后取上清液，得到6種不同處理?xiàng)l件下的壇紫菜粗提液(CEPh)各3份。采用Bradford蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白含量，結(jié)果取其平均值。

1.2.2 硫酸銨沉淀法粗分離壇紫菜蛋白 將“1.2.1節(jié)”中蛋白提取率最高的方法用于制備壇紫菜粗提液CEPh。根據(jù)粗提液的體積，添加相應(yīng)的硫酸銨粉末制成飽和度為10%的硫酸銨壇紫菜粗提液，靜置2 h后離心15 min(10 000g，4 ℃)，取沉淀用一定體積的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)復(fù)溶，分離出的蛋白組分命名為10%-PhPI(壇紫菜分離蛋白，Porphyrahaitanensisprotein isolate)；根據(jù)上清液的體積添加硫酸銨粉末至飽和度為20%，靜置2 h后離心15 min(10 000g，4 ℃)，取沉淀用相同濃度的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，分離蛋白組分命名為20%-PhPI，以同樣方法繼續(xù)制得30%-PhPI、40%-PhPI、50%-PhPI、60%-PhPI分離蛋白組分，6個(gè)組分所得的蛋白沉出量(mg)計(jì)算公式為

蛋白沉出量=Cpro×V。

其中：Cpro為測(cè)得的蛋白濃度；V為沉淀復(fù)溶用磷酸鹽緩沖液的體積。

1.2.3 紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定 將經(jīng)硫酸銨鹽析得到的6個(gè)分離蛋白組分別制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的蛋白溶液，采用紫外可見分光光度計(jì)在400～650 nm下進(jìn)行掃描測(cè)定。

1.2.4 傅里葉紅外光譜(FT-IR)分析 取凍干的6個(gè)分離蛋白組分樣品各1 mg，與干燥KBr粉末按質(zhì)量比為1∶100混合后壓成透明薄片，采用紅外光譜掃描并記錄吸光值。掃描波長(zhǎng)為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為32，分辨率為2 cm-1。

1.2.5 蛋白分子量的測(cè)定 在Mini-PROTEAN Tetra 小型垂直電泳槽中進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，測(cè)定CEPh和6個(gè)分離蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。樣品上樣量為10 μg，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)超快染液進(jìn)行染色，并用水進(jìn)行脫色，直至背景清晰。

1.2.6 圓二色光譜(CD)分析 參考楊肖杰等[11]的方法，采用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)將6個(gè)分離蛋白的質(zhì)量濃度統(tǒng)一調(diào)整為0.1 mg/mL，選擇190～270 nm區(qū)域進(jìn)行掃描。CD強(qiáng)度用摩爾橢圓率[θ] 表示。二級(jí)結(jié)構(gòu)含量由CDNN軟件進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 體外抗氧化活性分析

1)DPPH自由基清除能力。將CEPh和6個(gè)分離蛋白溶液樣品稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，并參考李詩(shī)雅等[12]的方法測(cè)定DPPH自由基清除能力。

2)ABTS自由基清除能力。將CEPh和6個(gè)分離蛋白溶液樣品稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，并參考李月等[13]的方法測(cè)定ABTS自由基清除能力。

3)還原力。配制質(zhì)量濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的維生素C(VC)溶液，以VC的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將CEPh和6個(gè)分離蛋白溶液樣品稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的樣品溶液，并測(cè)定不同蛋白的還原力，以相同吸光值對(duì)應(yīng)的VC質(zhì)量濃度與蛋白質(zhì)量濃度的比值來(lái)表示。

4)總抗氧化能力(T-AOC)。將CEPh和6個(gè)分離蛋白溶液樣品稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的樣品溶液，采用T-AOC檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)壇紫菜蛋白提取率的影響

從圖1可見：在提取液相同的情況下，溶脹法和反復(fù)凍融法的蛋白提取率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，且均顯著低于超聲波輔助法(P<0.05)；在相同提取方法下，以磷酸鹽緩沖液作為提取液的蛋白提取率均顯著高于以蒸餾水作為提取液的蛋白提取率(P<0.05)，其中，使用超聲波輔助磷酸鹽緩沖液提取法，壇紫菜蛋白提取率最高(55.28%)(P<0.05)。故本試驗(yàn)中選用超聲波輔助磷酸鹽緩沖液法提取壇紫菜的全蛋白。

2.2 不同飽和度硫酸銨對(duì)蛋白沉出量的影響

從圖2可見：隨著硫酸銨飽和度的增加，蛋白沉出量呈先上升后下降的趨勢(shì)，不同分離蛋白總沉出量為154.9 mg，占CEPh中蛋白總量(220.9 mg)的70.11%；硫酸銨飽和度為40%～60%時(shí)，CEPh中的蛋白被大量沉出，其中，硫酸銨飽和度為50%時(shí)沉出的蛋白為81.3 mg，占蛋白總沉出量的52.47%。在硫酸銨飽和度增加的過(guò)程中，溶液顏色由暗紅色變?yōu)樽仙?，最后變成淡黃色，沉淀逐漸呈膠狀。沉淀復(fù)溶后的溶液即圖2中的分離蛋白溶液，由淡紅色變?yōu)樯钭仙?，再變?yōu)榈t色，最后變?yōu)槿夥凵?，這說(shuō)明壇紫菜蛋白溶液中含有色素結(jié)合蛋白，且不同硫酸銨飽和度沉淀下來(lái)的色素結(jié)合蛋白種類及含量有一定差異。

標(biāo)有不同大寫字母者表示同一提取方法下不同提取液之間的蛋白提取率有顯著性差異(P<0.05)；標(biāo)有不同小寫字母者表示同一提取液下不同提取方法之間的蛋白提取率有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。Means with different capital letters are significant difference in protein extraction rate between different extracts solution under the same extraction method (P<0.05)；Means with different letters are significant difference in protein extraction rate between different extraction methods under the same extraction solution (P<0.05), and means with the same letters are not significant difference between groups (P>0.05).圖1 6種提取方法的蛋白提取率比較Fig.1 Comparison of protein extraction rate of six extraction methods

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.圖2 不同飽和度硫酸銨處理后壇紫菜蛋白的沉出量Fig.2 Protein precipitation of laver Porphyra haitanensis precipitated by different concentration gradients of ammonium sulfate

2.3 紫外可見光譜分析

從圖3可見：壇紫菜6個(gè)分離蛋白均含有結(jié)合色素的藻膽蛋白，3個(gè)明顯的特征吸收峰來(lái)源于藻膽蛋白，分別在496、552、614 nm附近，且均為中間峰高于兩邊峰；10%-PhPI、20%-PhPI、60%-PhPI蛋白的吸收峰強(qiáng)度較弱，吸光值均低于0.25，30%-PhPI、40%-PhPI、50%-PhPI蛋白的吸收峰值均高于0.40，其中40%-PhPI蛋白在553、616 mm處的吸收峰值最大，而在497 nm處的吸收峰值低于50%-PhPI。從圖3的表格中可知，6組分離蛋白中僅60%-PhPI蛋白在614 nm附近缺失吸收峰。

圖3 不同飽和度硫酸銨處理后壇紫菜分離蛋白的紫外可見光譜(400～650 nm)Fig.3 UV spectrum of laver Porphyra haitanensis protein exposed to different ammonium sulfate concentrations (400-650 nm)

2.4 傅里葉紅外光譜分析

從圖4可見，6個(gè)分離蛋白組分均含有蛋白特征峰酰胺Ⅰ帶(1 654 cm-1)、酰胺Ⅲ帶吸收峰(1 242 cm-1)、O—H伸縮振動(dòng)吸收寬峰(3 600～ 3 200 cm-1)和C—H伸縮振動(dòng)吸收峰(2 934 cm-1)，僅50%-PhPI和60%-PhPI蛋白缺失酰胺Ⅱ帶吸收峰(1 539 cm-1)，但增加了2個(gè)非蛋白吸收峰(1 155 cm-1和773 cm-1)。

2.5 蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量組成分析

從圖5可見：未經(jīng)硫酸銨處理的壇紫菜提取液(CEPh)電泳條帶多且淺，蛋白種類豐富；經(jīng)硫酸銨處理的分離蛋白存在明顯的蛋白條帶(相對(duì)分子質(zhì)量為55 000、20 000和18 000)；當(dāng)硫酸銨飽和度為10%～30%時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量為55 000、20 000和18 000的蛋白條帶顏色逐漸加深，這3個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白在低鹽離子強(qiáng)度下溶解度較高，而相對(duì)分子質(zhì)量為28 000和42 000的蛋白條帶顏色逐漸變?nèi)?，這說(shuō)明這2個(gè)分子量的蛋白僅在該飽和度區(qū)間內(nèi)沉出；當(dāng)硫酸銨飽和度大于30%時(shí)，僅相對(duì)分子質(zhì)量為55 000、20 000和18 000的蛋白條帶明顯。

圖4 不同飽和度硫酸銨處理后壇紫菜分離蛋白的紅外光譜(400～4 000 cm-1)Fig.4 FT-IR spectrum of laver Porphyra haitanensis protein exposed to different ammonium sulfate concentrations(400-4 000 cm-1)

圖5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of the proteins

2.6 圓二色光譜分析

從圖6可見，經(jīng)不同飽和度硫酸銨處理的6個(gè)分離蛋白在193 nm處產(chǎn)生一個(gè)正峰，222、210 nm處產(chǎn)生2個(gè)負(fù)峰，是典型的以α-螺旋為主的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中，60%-PhPI蛋白在222 nm的峰向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)，即出現(xiàn)藍(lán)移。經(jīng)CDNN軟件計(jì)算，隨著硫酸銨飽和度的增加，壇紫菜分離蛋白的α-螺旋相對(duì)含量呈先增加后減少的趨勢(shì)；60%-PhPI蛋白的α-螺旋相對(duì)含量最低，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量最高，形成了以β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲為主的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而40%-PhPI蛋白的α-螺旋相對(duì)含量最高，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量最低，結(jié)構(gòu)最為有序。

圖6 不同飽和度硫酸銨處理后壇紫菜蛋白圓二色光譜Fig.6 CD spectrum of laver Porphyra haitanensis protein after treatment with different ammonium sulfate concentrations

2.7 體外抗氧化活性測(cè)定

從表1可見：50%-PhPI蛋白的DPPH自由基清除活性最強(qiáng)，清除率為81.70%，與CEPh無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但顯著高于20%-PhPI、30%-PhPI、40%-PhPI和60%-PhPI蛋白組(P<0.05)； 60%-PhPI蛋白的ABTS自由基清除活性最強(qiáng)，清除率為88.33%，顯著高于CEPh及其他蛋白組(P<0.05)；10%-PhPI蛋白的總抗氧化能力最高，顯著高于CEPh及其他蛋白組(P<0.05)；蛋白含量為0.5 mg/mL的CEPh還原力相當(dāng)于0.085 mg/mL VC溶液的還原力，顯著高于6組分離蛋白(P<0.05)，說(shuō)明硫酸銨處理去除了部分還原力較高的物質(zhì)，使得還原力水平下降。

3 討論

3.1 壇紫菜分離蛋白的提取

植物細(xì)胞存在細(xì)胞壁，破壁技術(shù)是高效提取蛋白的關(guān)鍵，其次就是溶解蛋白所用的提取液種類。超聲波作為一種機(jī)械波，在介質(zhì)中傳播時(shí)會(huì)引起介質(zhì)粒子的機(jī)械振動(dòng)，并引發(fā)一系列的物理化學(xué)作用,從而達(dá)到提取植物細(xì)胞內(nèi)容物的效果[14]，如從藻類中高效提取?；撬醄15]、藻油[16]和多糖[17]等物質(zhì)。蔡苗苗等[18]探究了不同破壁技術(shù)對(duì)舌狀蜈蚣藻Grateloupialivida蛋白的提取效果，結(jié)果顯示，超聲波輔助水提法得到蛋白提取率高于溶脹法、反復(fù)凍融法和珠磨法，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。姚興存等[19]研究表明，超聲波輔助磷酸鹽緩沖液提取法較酶解法、超微粉碎法和氯化鈣法等更適合于從紫菜中制備藻膽蛋白。本試驗(yàn)表明，在超聲波輔助下用磷酸鹽作為提取劑優(yōu)于用蒸餾水。鹽析法常用于溶液中分離蛋白，本研究中以10%飽和度為一個(gè)梯度，對(duì)壇紫菜蛋白粗提液用硫酸銨沉淀后制備分離蛋白，發(fā)現(xiàn)分離蛋白在40%～60%飽和度下大量析出，且每個(gè)分離組分溶液的顏色均不相同，說(shuō)明分離蛋白存在差異，故后續(xù)對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性及抗氧化活性進(jìn)行了進(jìn)一步分析。

表1 體外抗氧化活性指標(biāo)的測(cè)定Tab.1 Determination of antioxidant activity in vitro

3.2 壇紫菜分離蛋白的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)解析

壇紫菜粗提液中存在結(jié)合藻膽色素的藻膽蛋白，主要為藻紅蛋白(PEs，λmax=540～570 nm)和藻藍(lán)蛋白(PCs，λmax=610～620 nm)[20]。壇紫菜中的藻膽蛋白含量較高，大約占?jí)喜烁少|(zhì)量的4%左右，其中，藻紅蛋白含量最高可達(dá)干質(zhì)量的2.43%[9]。本研究中，30%-PhPI、40%-PhPI、50%-PhPI的藻膽蛋白紫外吸收特征峰明顯，說(shuō)明硫酸銨飽和度達(dá)到30%時(shí)藻膽蛋白大量溶出，在飽和度達(dá)到50%時(shí)溶出量達(dá)到峰值，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到60%時(shí)分離蛋白溶液呈肉粉色，紫外光譜顯示，其存在藻紅蛋白特征吸收峰，而藻藍(lán)蛋白吸收峰消失，這表明藻藍(lán)蛋白在上一梯度已全部離心沉出，提取藻藍(lán)蛋白使用的硫酸銨飽和度應(yīng)小于50%，故20%～50%飽和度的硫酸銨適用于制備藻膽蛋白。錢曉婕等[21]從壇紫菜中制備藻膽蛋白所采用硫酸銨飽和度為45%，在此區(qū)間中。

傅里葉紅外光譜是量化蛋白樣品間變化和差異的有用工具，通過(guò)這種技術(shù)可以分析氨基酸酰胺鍵的不同振動(dòng)，主要是酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)、酰胺Ⅱ帶(1 500～1 600 cm-1)和酰胺Ⅲ帶(1 330～1 220 cm-1)[22]。本試驗(yàn)中，6個(gè)分離蛋白組分均含有典型的蛋白吸收峰，其中50%-PhPI、60%-PhPI缺失了酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰，但增加了1 155 cm-1和773 cm-12個(gè)非蛋白吸收峰。Yan等[23]用紅外光譜分析多糖時(shí)認(rèn)為，在1 200～1 000 cm-1(1 068 cm-1、1 155 cm-1)內(nèi)的吸收峰歸因于吡喃糖中的C—O—C和C—O—H鍵，773 cm-1處的峰可能為α-吡喃環(huán)對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，與本研究中新增的2個(gè)峰相似，說(shuō)明有非蛋白物質(zhì)發(fā)生沉淀，可能為多糖。王月華[24]曾用75%飽和度的硫酸銨從紅藻中提取凝集素(糖蛋白)，這說(shuō)明當(dāng)溶液中硫酸銨飽和度超過(guò)50%時(shí)，糖結(jié)合蛋白發(fā)生了沉淀，高飽和度的硫酸銨適合提取糖結(jié)合蛋白。

藻膽蛋白的基本構(gòu)建單位是α和β亞基，相對(duì)分子質(zhì)量為17 000～22 000，在藻紅蛋白中，一個(gè)額外的γ亞基(相對(duì)分子質(zhì)量約為30 000)通常結(jié)合α和β亞基形成穩(wěn)定的(αβ)6γ六聚體[20]。本試驗(yàn)中，SDS-PAGE電泳得到的相對(duì)分子質(zhì)量為20 000和18 000的蛋白條帶極可能是藻膽蛋白的α和β亞基，此結(jié)果同紫外吸收光譜結(jié)果吻合。董宏坡等[25]對(duì)壇紫菜進(jìn)行純化時(shí)，發(fā)現(xiàn)一條相對(duì)分子質(zhì)量為55 000的條帶，并認(rèn)為其有可能是由α或β亞基、γ亞基和連接肽組成，這與本試驗(yàn)中所得的相對(duì)分子質(zhì)量為52 000～66 000的蛋白條帶相似，故研究相對(duì)分子質(zhì)量為55 000的蛋白時(shí)，應(yīng)選擇飽和度為10%～30%的硫酸銨。

CD光譜遠(yuǎn)紫外區(qū)(190～240 nm)的圓二色性反映了肽鏈主鏈的構(gòu)象，常用于分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲是蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的4種主要類型，每種類型均有其獨(dú)特的CD光譜[26]。壇紫菜藻膽蛋白中的α亞基和β亞基雖然一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，但它們的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)卻十分相似，均含有9個(gè)α-螺旋，且每?jī)蓚€(gè)α-螺旋間有不規(guī)則轉(zhuǎn)角相連[27]。由此推測(cè)，本研究中，40%-PhPI蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量最高，這可能與以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主的藻膽蛋白集中沉出相關(guān)。

3.3 壇紫菜分離蛋白的體外抗氧化活性

本研究團(tuán)隊(duì)在先前的試驗(yàn)中，對(duì)壇紫菜粗提液CEPh的DPPH自由基清除活性和ABTS自由基清除活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，半數(shù)抑制濃度(IC50)依次為250、42 μg/mL，還原力測(cè)試結(jié)果為質(zhì)量濃度1 mg/mL的蛋白粗提液相當(dāng)于質(zhì)量濃度0.05 mg/mL的VC溶液，具有較高的抗氧化活性且呈量效關(guān)系[5]。故本試驗(yàn)中以其為標(biāo)準(zhǔn)，探討了不同飽和度硫酸銨對(duì)壇紫菜蛋白抗氧化活性的影響。目前，關(guān)于壇紫菜蛋白的抗氧化活性研究大多集中于藻膽蛋白，如周站平等[28]探討了光照和脫輔基蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)藻膽蛋白抗氧化活性的影響，結(jié)果表明，藻膽蛋白黑暗下能夠清除自由基。Chen[29]用超聲波輔助水提法結(jié)合硫酸銨沉淀法制備的藻膽蛋白，結(jié)果同樣顯示該蛋白具有體外抗氧化活性。本研究中，6組分離蛋白的DPPH自由基清除能力水平均在60%以上，說(shuō)明硫酸銨沉淀對(duì)該自由基清除活性的影響較小；60%-PhPI蛋白相較于其他組分具有最高的ABTS自由基清除活性(清除率為88.33%)，從紅外光譜中可以看出，其非蛋白峰強(qiáng)度較高，活性可能來(lái)源于非蛋白組分；10%-PhPI蛋白相較于其他組分具有最高的總抗氧化能力(0.88 μmol/mg prot)，從SDS-PAGE電泳圖可以看出，其相對(duì)分子質(zhì)量為28 000和42 000的蛋白條帶較為明顯，活性可能來(lái)源于這兩種蛋白；經(jīng)硫酸銨沉淀后蛋白溶液的還原力均顯著下降，故4種體外抗氧化活性指標(biāo)中受硫酸銨沉淀影響最大的是還原力，這可能與硫酸銨去除的具有供電子能力的小分子物質(zhì)有關(guān)。由此可見，6組分離蛋白均保持了一定的抗氧化活性，但其間存在顯著性差異，原因可能是抗氧化體系是各種抗氧化活性成分協(xié)同作用的結(jié)果，并非僅由某一種物質(zhì)決定著壇紫菜抗氧化活性的強(qiáng)弱。

4 結(jié)論

1)采用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)作為提取液優(yōu)于蒸餾水，超聲波輔助提取法優(yōu)于溶脹法和反復(fù)凍融法；超聲波輔助磷酸鹽緩沖液法為壇紫菜蛋白最優(yōu)提取方法，得率為55.28%。

2)在硫酸銨飽和度低于50%時(shí)，分離蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)穩(wěn)定，壇紫菜中的藻膽蛋白幾乎全部沉出。

3)硫酸銨處理后得到的6組分離蛋白均表現(xiàn)出體外抗氧化活性，不同指標(biāo)下活性強(qiáng)弱存在顯著性差異。

4)不同飽和度硫酸銨沉淀壇紫菜蛋白粗提液得到的分離蛋白結(jié)構(gòu)特性存在較大差異，可為提取相應(yīng)結(jié)構(gòu)的蛋白提供合適的飽和度區(qū)間參考。